Osteoklastik Rezorpsiyonu In Vitro Görselleştirmek ve Ölçmek için Basit Bir Pit Tahlil Protokolü

Protokolümüz, osteoklastik rezorpsiyon testi için basit ve güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır. Kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakalarının kullanımı, laboratuvarda mevcut malzemeler kullanılarak kolayca hazırlanabilir ve görselleştirilebilir. Opak kemik veya dentin dilimlerinin aksine, kalsiyum fosfat kaplama, rezorpsiyon çukurlarının ve hücrelerin aynı anda görselleştirilmesini sağlar.

Bu protokolde osteoklast farklılaşması için PBMC'ler kullanıyoruz. Bununla birlikte, kemik iliği kaynaklı monositler veya Raw 264.7 hücreleri gibi diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. İlk önce düz tabanlı 96 kuyucuk hücre kültürü plakası ve pipet 300 mikrolitre önceden hazırlanmış kalsiyum fosfat çözeltisini her bir kuyucuğa alın.

Ardından, plakayı kapakla örtün ve plakayı üç gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Üç gün sonra, ön kalsifikasyon çözeltisini önceden kalsifiye edilmiş 96 kuyucuk hücre kültürü plakasından aspire edin ve her bir oyuğa 300 mikrolitre kalsiyum fosfat çözeltisi ekleyin. Plakaları bir kapakla örtün ve bir gün boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Daha sonra çözeltiyi dökmek için plakayı ters çevirin ve plakayı üç kez deiyonize suyla iyice yıkayın. Düzgün bir yüzey sağlamak için plakayı hemen bir saç kurutma makinesi veya sıkıştırılmış karbondioksit veya azot gazı kullanarak kurulayın. Şimdi, kaplanmış plakayı temiz bir tezgahta ultraviyole ışınlarıyla bir saat boyunca ışınlayın.

Kaplanmış plakayı hemen kullanın veya plakayı Parafilm ile kapatın ve oda sıcaklığında saklayın. 15 mililitre taze kanı eşit hacimde PBS ile seyreltin ve birkaç kez ters çevirerek veya pipetleyerek karıştırın. Daha sonra 50 mililitrelik bir konik tüpte 15 mililitre yoğunluk gradyanı çözeltisi alın, tüpü eğin ve 15 mililitre yoğunluk gradyanı çözeltisi üzerine 30 mililitre seyreltilmiş kan örneğini dikkatlice katmanlayın.

Daha sonra, tüpü sallanan bir kova rotorunda, 20 santigrat derecede 20 dakika boyunca 810 kez G'de kırılmadan santrifüj yapın. Daha sonra üst tabakayı aspire ederek mononükleer hücre tabakasını arayüzde bozulmadan bırakın. Mononükleer hücre tabakasını dikkatlice yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.

Tüpü PBS ile doldurun, karıştırın ve 20 santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. PBMC'leri, mililitre makrofaj kolonisi uyarıcı faktörü başına 20 nanogram içeren tam bir alfa-MEM'de yeniden askıya alın ve bir şişede santimetre kare PBMC'ler başına 2.5 kat 10 ila beşinci hücreye tohumlayın. Kalsiyum fosfat kaplı plakaları bir saat boyunca 37 santigrat derecede 50 mikrolitre fetal sığır serumu ile inkübe edin.

Daha sonra, osteoklast öncüllerini ölü veya yapışkan olmayan hücrelerden ayırmak için şişeyi PBS ile iki kez yıkayın, ardından 75 santimetrekarelik şişe başına dört mililitre tripsin ekleyin. 30 dakika sonra, dört mililitre tam alfa-MEM ekleyerek sindirimi durdurun, ardından bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri dikkatlice ayırın. Hücreleri 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir sayma odası kullanarak toplam hücre sayısını sayın.

Hücreleri peletlemek için tüpü yedi dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj edin ve peleti yeniden askıya alın ve mililitre başına altı hücreye bir kez 10 kat elde etmek için M-CSF ve RANKL içeren alfa MEM'i tamamlayın. Fetal sığır serumunu kalsiyum fosfat kaplı plakadan aspire edin ve kuyu başına 200 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetin. Kuluçkadan sonra, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.

Hücreleri 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve PBS ile tekrar yıkayın. Boyama için, sabit hücrelere geçirgenlik tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca inkübe edin. Aktin filamentlerini boyamak için, hücreleri PBS'de 100 mikrolitre Alexa Fluor 546 etiketli falloidin çözeltisi ile 30 dakika boyunca inkübe edin, ardından boyama çözeltisini aspire edin ve 10 dakika boyunca 100 mikrolitre Hoechst kullanarak çekirdekleri boyayın.

10 dakika boyunca 100 mikrolitre 10 mikromolar kalsein ve PBS ile leke kalsiyum fosfat kaplama. PBS ile üç kez yıkadıktan sonra görüntü yakalayın. Von Kossa için kalsiyum fosfat kaplamanın boyanması her bir kuyucuğa 50 mikrolitre% 5 gümüş nitrat ve deiyonize su ekleyin ve kuyucukların dibindeki kaplama kahverengiye dönene kadar plakayı ultraviyole radyasyon altında bir saat boyunca inkübe edin.

96 kuyu plakasının altındaki kalsiyum fosfat kaplamanın düzgün ve iyi yapışmış olduğu ortaya çıktı. Kalsiyum fosfat kaplı plakalar üzerinde M-CSF ve RANKL'de dokuz günlük kültürden sonra, osteoklast öncülleri rezorpsiyon çukurları ve büyük osteoklastlar oluşturdu. Çukurlarda bulunan çok çekirdekli osteoklastlar yüksek TRAP seviyelerini ifade ediyordu.

Olgun osteoklastlar üç veya daha fazla çekirdeğin varlığını ve farklı aktin halkasını gösterdi. Yeşil kalsiyum fosfat kaplama, siyah rezorpsiyon çukurlarının varlığını gösterdi. Çukur alanı floresan görüntüleri, J. görüntüsünün eşik aracı kullanılarak ölçüldü.Osteoklastların sayısı ve boyutu, ROI yöneticisi kullanılarak hesaplandı ve görüntü J.Osteoklasts'ın RANKL yokluğunda yetiştirilen öncüllerinin çokgen seçim aracı rezorpsiyon çukurları oluşturamadı, ancak M-CSF ve RANKL osteoklastojenik çukurların oluşumunu kolaylaştırdı.

Ve çukur alanı J resmi kullanılarak ölçüldü.Kaplanmış plakanın hava akımı ile hemen kurutulması, düzgün bir kalsiyum fosfat kaplaması yapılmasına yardımcı olur. Aksi takdirde, kuyunun ortasında daha kalın bir kaplama oluşturmaya eğilimlidir.