Fonksiyonel Çalışmalar için İnsan Sinaptik Reseptörlerini Yeniden Aktive Etmek için Sinaptik Membranların Mikrotransplantasyonu

Nörodejeneratif ve zihinsel sağlık bozuklukları sinaptik iletişimdeki değişikliklerden kaynaklanır. Multifaktöriyel olaylar, sinaptik reseptörleri tam olarak anlamadığımız şekillerde değiştirir. Sinaptik membranların mikrotransplantasyonu bu değişiklikler hakkında fikir verir.

Bu tekniğin temel avantajı, insan beyninde çalışan yerli beyin reseptörlerinin aktivitesini kaydetme olasılığıdır ve bu nedenle çalıştığımız hastalıkları temsil eder. Sinaptik reseptörler, beynin elektriksel aktivitesini düzenleyen tıbbın ana hedefleridir, ancak bu reseptörlerin nasıl değiştiğini anlayarak, işlevlerini geri kazandıran daha iyi tedaviler geliştirilebilir. Bu yöntem, böceklerden, balıklardan, memelilerden farklı türlere başarıyla uygulanmıştır, ancak beyin dışındaki zar reseptörlerine, örneğin kaslara ve tümörlere de uygulanabilir.

Olasılıklar geniştir. Enjeksiyon iğnelerini kırpmak zordur. Çok küçük protein enjeksiyonunu önleyebilir ve iki büyük hücreyi öldürebilir.

Bir tıraş bıçağının kenarı gibi tutarlı bir ölçüm kullanılmasına yardımcı olur. İlgilenilen insan beyni bölgesinden hazırlanan seçilen örnekleri, yüzen ıslak buzlu bir banyoda üç kez sonikleştirerek başlayın. Her seferinde beş saniyelik döngüler kullanın ve döngüler arasında ıslak buzda bir dakika bekleyin.

Numunenin bir mikrolitresini termoplastik üzerine yerleştirin ve numunenin hareketini önlemek için numune yerleştirmeden önce gerekirse yüzeyde bir girinti yapın. İğneyi konumlandırmak için nanoenjektörü tutan manipülatörün düğmelerini kullanın ve doldurulacak numuneye doğru hareket ettirin. İğne ucu numuneye girdikten sonra, yeterli numune alınana kadar doldurma düğmesini basılı tutun.

10 yumurta için yaklaşık 0,5 mikrolitre numune gereklidir. Nanoenjektörün iğnesini en yüksek konuma geri döndürmek için düğmeleri kullanın. Yumurtayı yüzeyin hemen altında, daha derin olmayan bir iğne ile delin ve numuneyi enjekte etmek için ayak pedalını kullanın.

Yaklaşık iki ila üç saniye bekleyin. Başarılı enjeksiyondan sonra, hücre genişleyecektir. Hücreden çıkmak için manipülatörün üzerindeki düğmeleri kullanın.

Petri kabını, bir sonraki yumurta iğne ile aynı hizada olacak şekilde hareket ettirin. Çanakta istenen sayıda yumurta enjekte edilene kadar işlemi tekrarlayın, ardından nanoenjektörü orijinal konumuna geri çekin ve iğneyi çıkarın. Bir yumurta kuyucuğunun kontrol olarak kullanılmak üzere enjekte edilmeden bırakıldığından emin olun.

İyon akımlarının kaydedilmesi için kullanılan tüm ekipmanları açın, ardından masaüstü bilgisayarı açın ve WinEDR sürüm 3.9.1'de oturum açın. Programın çalıştığından ve kaydın Disk olarak ayarlandığından emin olun. Bundan sonra, kayıt süresini ayarlayın ve Simülatör seçeneğini temizleyin.

Voltaj elektrodu bölümü için, negatif kapasite telafisi kapatılır. Banyo elektrodu bölümü için kazanç seçici anahtarı 10'a ayarlayın, ardından kazanç çarpanını seçen üç konumlu geçiş anahtarını x1 olarak ayarlayın. LED ışıkları kazanç çarpanı seçimini gösterecektir.

Kelepçe modu seçiciyi kapatın, DC kazanç kontrolünü içeri yerleştirin ve kazanç kontrolünü tam bant genişliği açık döngüsünün yaklaşık yarısına ayarlayın. Komutları 40 milivolta, tutma kontrolleri negatife ve ölçek çarpanını x2'ye ayarlayın. Mevcut elektrot için, oositi etkilemeden önce sıfır referans oluşturmak için VE ofsetini kullanın.

Ardından, WinEDR sürüm 3.9.1 yazılımını açın, üst menüye gidin ve Dosya'yı ve ardından Yeni'yi seçin. Kendi klasörünüzü oluşturun ve dosyayı kaydedin. Ana menüde Kaydet'i ve ardından Diske Kaydet'i seçin.

Agar köprülerini kayıt odasının arkasındaki ilgili dairesel deliklere yerleştirin ve kayıt odasında toprak referansı olarak kullanılan elektrotlar için kuyucukları bağlayın. İlgili perfüzyon valfine 1x Ringer'ın Çalışma Çözümünü ekleyin. Kayıt odası Ringer Çözümü ile dolana kadar vanayı açın.

Elektrotları tutan sağ ve sol manipülatörleri kullanarak, elektrot iğnelerini Ringer's Solution ile doldurulmuş kayıt odasına yönlendirin. VM ve VE ofset düğmelerini sıfırlayarak ve ardından elektrot test düğmelerine basarak her elektrotun direncini kontrol edin. Direnç 0,5 ila üç megaohm arasında olmalıdır.

Direnç aralığın dışındaysa, yeni mikroelektrotlar kullanarak değiştirin. Ardından, kayıt odasını yeni Ringer's Solution ile doldurun. Kayıt odasının ortasına enjekte edilmemiş veya mikro nakledilmiş bir oosit yerleştirmek için cam pipet kullanın.

Yumurtanın mikroskop altında hayvan tarafı yukarı bakacak şekilde açıkça görülebildiğinden emin olun. Elektrotu, oosit zarına dokunana kadar Ringer Çözeltisine yönlendirin. Hayvan tarafındaki oosit zarını her iki elektrotla da nazikçe delin ve dinlenme zarı potansiyelini kaydedin.

Zil Sesi Çözümü akışını açın. Oosit Kelepçesi Amplifikatörünü kullanarak, modu voltaj kelepçesi yavaş olarak değiştirin ve tutma voltajını 80 milivolta ayarlayın. Monitördeki akım negatif olmalı, genellikle 0 ila 0,4 mikroamper arasında olmalıdır.

Dosya, Yeni'ye gidin ve ardından yeni bir dosya oluşturmak için kaydı yazılıma kaydedin ve kaydı kaydedin. Kaydı başlatmak için Kaydet'e ve ardından Diske Kaydet'e basın. İşaret Grafiği iletişim kutusunu kullanarak dosyaya ilgili bilgileri ekleyin.

Valfleri açarak ve 15 saniye boyunca kayıt odasına perfüze ederek kimyasal stimülasyon için agonistler uygulayın. Kayıt tamamlandıktan sonra, voltaj kelepçesini kapalı konuma getirin ve Ringer's Solution valfini kapatın. Yumurtayı çıkarın ve insan beyni örnekleri için kurumsal politikayı izleyerek atın, ardından kaydı durdurun ve dosyayı kaydedin.

Kayıtların bir kopyasını bir USB sürücüsüne kaydedin. Oradan, analiz edilecek istenen dosyayı açın. AMPA maksimum yanıtını ve GABA A tepe yanıtını ölçmek için önce kırmızı çizgiyi bularak bir 0 düzeyi veya taban çizgisi oluşturun, ardından bunu Zil uygulaması veya taban çizgisi tarafından oluşturulan akıma sürükleyin.

0 düzeyi belirlendikten sonra, yeşil dikey okuma imlecini grafik izleyicinin istenen bölümüne sürükleyerek yanıt ölçümlerini belirleyin. İnsan sinaptik reseptörlerinden membranlara enjekte edilen oositlerden gelen iyon akımları kaydedildi. AMPA reseptörleri 100 mikromolar kainat ve GABA A reseptörleri bir milimolar GABA ile aktive edildi.

Filtrelenmiş membranların, asetilkolin reseptörleri bakımından zengin, torpidonun elektrik organından birlikte enjeksiyonu ve GABA sırası için kodlanan cDNA, bir reseptörü hayvan kutbuna yerleştirerek, yanıtlarına bağlı olarak esas olarak iki grup oosit üretti. Bir grup oositin asetilkoline büyük yanıtları vardı, ancak bir mikromolar GABA'ya yanıt yoktu. Başka bir gruptaki oositlerin asetilkoline sıfır veya düşük yanıtları vardı, ancak GABA'ya büyük yanıtları vardı.

Grafik görüntü, birinci ve ikinci gruptaki tepe akımının ortalamasının ortalama artı eksi standart hatasını gösterir. Grup ikideki bir oositin büyük GABA ve asetilkolin yanıtları vardı, bu da çekirdeğin rüptürünü düşündürüyordu. Sonuç olarak, yanıtların dağılımı, membran akımının dağılımının ortalaması ve medyanı arasındaki farkla belirtildiği gibi, düşük değerlere çarpıtılmıştır.

Düşük yanıtlı oositlerin nedenlerinden biri, membranların enjekte edilmesi ve yumurtanın çekirdeğine hapsedilmesidir. AD olmayan bir beyinden ve bir AD beyninden elde edilen filtrelenmemiş zarlarla hayvan veya bitkisel kutuplara enjekte edilen oositlerin GABA ve kainat yanıtları burada gösterilmiştir. Çekirdeği hedeflemeden hayvan kutbunun yanına enjekte edilen oositler, bitkisel kutba enjekte edilen oositlerden daha büyük tepkiler verdi, böylece çok az sayıda reseptöre sahip doku örneklerinin incelenmesine izin verdi.

Bu prosedürü denerken, her zaman Zil Sesi seviyenizi izleyin. Her zaman önemli kayıtlar sırasında tükenirsiniz ve sonra sonucunuzu, oositin ölümünü ve çok değerli verilerin kaybını kullanır. Bu prosedürü takiben, sinaptik reseptörlerin veya ilgili proteinlerin varlığını doğrulamak için Batı yüklerini gerçekleştirebiliriz.

Farklı beyin bölgelerindeki sinaptik oranları ve farklı beyin bozukluklarını inhibe etmek için küresel uyarılmayı ölçmeye izin verir ve hastalığın nedenleri hakkında teorik tahminler üzerinde doğrudan test yapılmasına izin verir.