İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Bu önlem, karmaşık biyokimyasal düzenlemelerden yoksun hücrenin minimum bir modelini oluşturur. Kullanılan teknik, yüksek miktarda lipozom üretebilir ve sitoiskelet proteinleri için yüksek kapsülleme verimliliğine sahip olabilir. Bu önlem, çeşitli proteinlerin ve mikropartiküller ve kendi kendini hazırlayan mikro yüzücüler gibi büyük nesnelerin kapsüllenmesine uygulanabilir.

Bir birey ilk birkaç girişim için lipozom verimini arttırmak için mücadele ediyor. Verimi artırmak için daha fazla ayrıntı için makalenin düzenli olarak tartışılması önerilir. Başlamak için, 0.1 milimolar CACL iki, 10 milimolar HEPES, bir milimolar DTT, 0.5 milimolar DAPCO, 320 milimolar sakkaroz ve 0.2 milimolar ATP'yi karıştırarak sulu iç polimerizasyon tamponunu toplam beş mililitre hacimde hazırlayın.

Protein karışımını, polimerizasyon içermeyen iç tampona dört santigrat derecede proteinler ekleyerek hazırlayın. Bir aktin tabakası oluşturmak için, protein karışımına 100 nanomolar gellcalin, dört mikromolar coughalin ve 2.2 mikromolar VCA HEZ ekleyin. Bir kontrol deneyi olarak, protein karışımını mililitre floresan boya başına 100 mikrogram ile değiştirin.

Sulu iç polimerizasyon tamponunu, 100 milimolar potasyum klorürü karıştırarak toplam beş mililitre hacimde hazırlayın. Dört milimolar magnezyum klorür, 10 milimolar HEPES, bir milimolar DTT, 0.5 milimolar DABCO, 10 milimolar ATP ve 80 milimolar sakaroz. İç polimerizasyon tamponunu ve iç polimerizasyon tamponunu bire bir hacim oranında karıştırarak son tamponu hazırlayın, iç sulu çözeltiyi lipozom içinde kapsüllenecek toplam 30 mikrolitre hacimde verin.

Sulu dış tamponu, 10 milimolar HEPES, 50 milimolar potasyum klorür, iki milimolar magnezyum klorür, 0.2 milimolar kalsiyum klorür, iki milimolar ATP, bir milimolar DTT, 0.5 milimolar DAPCO, 212 milimolar glikoz ve mililitre beta kasa başına 0.1 miligram karıştırarak toplam 150 mikrolitre hacimde hazırlayın. Lipid yağı karışımını hazırlamak için, bir cam şişeye mililitre EGGPC başına 100 mikrolitre 25 miligram ekleyerek başlayın. Kloroformu, şişenin dibinde kuru bir katı lipit filmi bırakarak argon gazı ile buharlaştırın.

Bir aktin tabakası oluşturmak için, kloroformun buharlaşmasından önce EGGPC'nin nikel lipitine 10 ila bir oranında nikel lipit ekleyin ve karıştırın. İki mililitre mineral yağ ekleyin. Lipitleri yeniden askıya almak için kloroformu buharlaştırın ve lipit yağı karışımını oda sıcaklığında bir saat boyunca bir banyoda sonikleştirin.

İlgilenilen proteini içeren tek katmanlı lipit damlacıklarını hazırlamak için yağ emülsiyonunda son bir tampon hazırlayın. Plastik bir tüpe 100 mikrolitre lipit yağı karışımı alarak başlayın ve lipit yağı karışımına 10 mikrolitre son tampon ekleyin. Son tamponun tek bir damlacıkta olduğundan emin olun.

Bir cam şırınga kullanarak önce az miktarda lipit yağı karışımı ve daha sonra şırınganın ucunu damlacığın çevresine yerleştirerek son tampon damlacığını küçük damlacıklara ayırın. Bulutlu bir emülsiyon oluşana kadar yavaşça yukarı ve aşağı doğru birkaç kez aspire edin. Ayrı bir plastik tüpe 30 mikrolitre dış tampon koyun.

Dış tamponun üzerine 30 mikrolitre lipit yağı karışımı yerleştirin ve arayüzde bir lipit tek katmanı geliştirmek için yaklaşık 10 dakika bekletin. Lipozomları hazırlamak için, tüpün üst yağ fazına 50 mikrolitre son tampon yağı emülsiyonunu dikkatlice ekleyin. Plastik tüpü dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 100 kez G'de santrifüj yapın.

Lipozom oluşumunu optimize etmek için zamanı ve santrifüjleme hızını değiştirin. Gerekirse yağ fazını pipet aspirat ekstra hacmi ile dikkatlice çıkarın. Lipozom fazının üstünde bir yağ menisküsü oluşturmamak için pipet ucunu tüpün yanına koymadığınızdan emin olun.

Yeni bir pipetle pipetin ucunu kesin. Pipetleri yavaşça kalan alt faza yapıştırın ve lipozomları toplamak için sulu hacmi aspire edin. Bir inkübasyon odasının kuyucuğuna 100 mikrolitre dış tampon dökün.

Toplanan lipozomları yavaşça dış tampona koyun ve ardından odanın üstüne başka bir kapak kayması yerleştirin. 63 x yağ daldırma hedefi kullanarak lipozomları konfokal mikroskopla gözlemleyin. 488, 647 ve 561 nanometre lazer hatları kullanın.

Floresan olarak etiketlenmiş lipitleri gözlemlemek için, sırasıyla kapsüllenmiş floresan boya ve kapsüllenmiş floresan etiketli aktin. İlgilendiğiniz kareleri yakalayın ve görüntüleri TIF formatında kaydedin. TIF dosyasını açıp image J yazılımını kullanarak görüntü J.Start'taki görüntüleri işleyin ve analiz edin.

Görsele gidin ve ardından ayarla'yı tıklayın. Ardından parlaklık kontrastı, minimum ve maksimum ayarları ve parlaklık ve kontrast kaydırıcılarını ayarlayarak görüntünün parlaklığını ve kontrastını istenen ölçeğe ayarlayın. Araç çubuğundaki dikdörtgen seçim aracına tıklayın ve ilgilendiğiniz bölgeyi seçin.

Resme gidin, ardından YG'yi kırpmak için kırp'ı tıklayın. Analiz etmeye gidin ve ardından ölçeği ayarla'yı tıklayın. Açılır pencerede, piksel en boy oranı alanına 1,0 girin ve mikrometreyi uzunluk birimi olarak ayarlayın.

Piksel cinsinden uzaklık alanına, görüntü genişliğini piksel cinsinden girin. Bilinen mesafe alanına, gerçek görüntü genişliğini mikron cinsinden girin. Lipozomun boyutunu ölçmek için, araç çubuğundaki oval seçim aracını kullanarak, lipozomun kenarı boyunca bir daire çizin.

Analize gidin, ardından lipozomun çapının hesaplanabileceği dairenin alanını ölçmek için ölç'ü tıklayın. Başarılı lipozom oluşumu, yeşil floresan lipid çift katmanı olan ince dairesel halkanın görselleştirilmesiyle doğrulanır. Floresan boyanın kapsüllenmesini doğrulamak için konfokal mikroskopi kullanan 488 nanometrelik bir lazer altında.

Lipozomların iç ortamı, 647 nanometrelik bir lazer altında eşit şekilde floresan olmalıdır. Lipozomların oluşumu ince yeşil dairesel halkalar tarafından görselleştirilebilir. Lipozomların içindeki ağlarda yeniden yapılandırılmış etki heterojendir ve aktin filamentlerinin dallanmış ağ yapıları olarak kendini gösterir.

Dal mimarisi, VCA HEZ ile birlikte aktin filamentlerinin çekirdeklenmesini ve dallanmasını aynı anda kontrol eden ARP iki üç kompleksinin tanıtılmasıyla tetiklendi. Lipozomların çift katmanının iç broşüründe, floresan bir tabaka olarak görselleştirilebilen ince, ancak yoğun dallanmış bir aktin tabakası oluşturulur. Lipid ses son tampon karışımı, hava kabarcıklarının ortaya çıkmasını önlemek için genellikle bir cam şırıngadan ileri geri pompalanmalıdır.

İşlemden sonra karışım beyazımsı olmalıdır. Bu teknik, karmaşık biyokimyasal düzenlemelerden yoksun, hücrenin minimal bir modelini oluşturmanın yolunu açtı. Bu hücre taklit sistemi ile araştırmacılar, sitoiskelet proteinlerinin, nükleatörün ve moleküler motorun mekanik ve dinamik özelliklerini keşfedebilirler.