Name: İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Öğrenin, F-aktin hücre iskeletini dev unilameller veziküllere kapsüllendirme yöntemini. Bu teknik, biyomimetik korteks katmanı oluşturarak hücre mekaniği araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ARO MURI W911NF-14-1-0403'ün M.P.M.'ye, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 1R01GM126256'dan M.P.M.'ye, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, Michigan Üniversitesi / Genentech, SUBK00016255 ve İnsan Sınırları Bilim Programı (HFSP) hibe numarası RGY0073/2018'den M.P.M.'ye fon sağladığını kabul ediyoruz. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya öneri yazar(lar)a aittir ve mutlaka ARO, NIH veya HFSP'nin görüşlerini yansıtmaz. S.C., V. Yadav, C. Muresan ve S. Amiri ile verimli tartışmalar yaptığını kabul eder.

1. Tamponların ve protein çözeltilerinin hazırlanması
<ol><li>Sulu İç Polimerizasyon Olmayan (INP) Tamponunu, 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM sakkaroz ve 0,2 mM ATP'yi karıştırarak toplam 5 mL hacimde hazırlayın.</li>
	<li>Aşağıdaki konsantrasyonlarda 4 ° C'de INP tamponuna proteinler ekleyerek Protein Karışımını (PM) hazırlayın: 11.2 μM floresan olmayan G-aktin, 2.8 μM floresan etiketli aktin ve 0.24 μM Arp2/3 (Malzeme Tablosu). Bir F-aktin tabakası oluşturmak için, PM'ye 100 nM gelsolin, 4 μM kofilin ve 2.2 μM VCA-His ekleyin. Bir kontrol deneyi olarak, PM'yi 100 μg / mL floresan boya ile değiştirin (Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Sulu İç Polimerizasyon (IP) Tamponunu (sulu), 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 10 mM ATP ve 80 mM sakkarozu karıştırarak toplam 5 mL hacimde hazırlayın.</li>
	<li>İç sulu çözeltiyi lipozom içinde kapsüllenecek toplam 30 μL'lik bir hacimde elde etmek için INP tamponunu (PM içeren) ve IP tamponunu 1: 1 hacim oranında karıştırarak Son Tamponu (FB) hazırlayın.</li>
	<li>Sulu Dış Tamponu (OB) 10 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM KCl, 2mM MgCl 2, 0.2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco,212 mM glikoz ve 0.1 mg/mL β kazein karıştırarak toplam 150 μL hacimde hazırlayın. NOT: OB'nin ozmolaritesi, OB'nin ozmotik basıncının FB'ninkinden (20-60 mOsm) biraz daha büyük olmasını sağlamak için glikoz ile ayarlanabilir. FB'nin yoğunluğu OB'den biraz daha yüksek olmalıdır.</li>
</ol>2. Ters emülsiyon tekniklerine dayalı lipozomların hazırlanması
<ol><li>Lipid-yağ karışımını hazırlayın<ol><li>Bir cam şişeye 100 μL 25 mg / mL L-α-fosfatidilkolin (% 1 DHPE dahil olmak üzere EPC olarak da adlandırılan floresan olmayan Yumurta PC) ekleyin. Kloroformu argon gazı ile buharlaştırın, şişenin dibinde kuru bir katı lipit filmi (2.5 mg) bırakın.<ol><li>Bir F-aktin tabakası oluşturmak için, EPC'nin DOGS-NTA-Ni'ye 10: 1 oranında 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n (5-amino-1-carboxypentiyl) iminodiasetik asit] süksinil} nikel tuzu (DOGS-NTA-Ni) ekleyin ve kloroformun buharlaşmasından önce karıştırın.</li>
		</ol></li>
		<li>2 mL mineral yağ ekleyin ve lipitleri yeniden askıya almak için 1 saat boyunca bir banyoda oda sıcaklığında lipit-yağ karışımını sonikleştirin. NOT: Sonikasyondan sonra lipit-yağ karışımı 4 ° C'de 1 hafta boyunca saklanabilir. Kullanımdan önce yeniden sonikasyon önerilir.</li>
	</ol></li>
	<li>İlgilenilen proteini içeren tek katmanlı lipit damlacıkları hazırlamak için yağ (FB / yağ) emülsiyonunda bir Son Tampon hazırlayın.<ol><li>Plastik bir tüp içinde alınan 100 μL lipit-yağ karışımına, 10 μL FB ekleyin. FB'nin bir damlacıkta olduğundan emin olun.</li>
		<li>Bir cam şırınga kullanarak, lipit-yağ-FB karışımını çekin ve emülsifiye etmek için birkaç kez yavaşça yukarı ve aşağı aspire edin; önce az miktarda lipit-yağ karışımı çekin ve daha sonra şırınganın ucunu damlacığın çevresine yerleştirerek FB damlacığını küçük damlacıklara ayırın. Beyazımsı ve bulutlu bir emülsiyon oluşana kadar yukarı ve aşağı aspirasyonu tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Ayrı bir plastik tüpe 30 μL OB koyun. OB'nin üzerine 30 μL lipit-yağ karışımı yerleştirin ve arayüzde bir lipit tek katmanı geliştirmek için ~ 10 dakika bekletin. NOT: Lipitler yüklenmişse veya protein dahil edilmişse, bu adımın süresi38 uzatılmalıdır.</li>
	<li>Lipozomları hazırlayın<ol><li>50 μL FB/yağ emülsiyonunu (adım 2.2) 2.3. adımdan itibaren tüpün üst yağ fazına dikkatlice ekleyin.</li>
		<li>Plastik tüpü 4 °C'de 15 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın. Lipozom oluşumunu optimize etmek için zamanı ve santrifüjleme hızını değiştirin. NOT: Santrifüjlemeden sonra, üst yağ fazı açık olmalı ve alt OB (lipozomlar içeren) hafif bulutlu olmalıdır.</li>
		<li>Yağ fazını pipetle dikkatlice çıkarın. Gerekirse ekstra hacim aspire edin. Lipozom fazının üstünde bir yağ menisküsü oluşturmamak için pipet ucunu tüpün yanına koymadığınızdan emin olun.</li>
		<li>Yeni bir pipetle, pipet ucunu yavaşça kalan alt faza yapıştırın ve lipozomları toplamak için sulu hacmi aspire edin. NOT: Hacmi kaybetmek, yağı dahil etmekten daha iyidir. Yağın dahil edilmesi lipozomların yırtılmasına neden olur ve iç bileşenler dış tampona salınır. Makası azaltmak için pipetin ucunu kesin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Mikroskopi gözlemi
<ol><li>Bir kuluçka odasının kuyucuğuna 100 μL OB dökün (12 mm yuvarlak kapaklar içeren 4 delikli plaka). Toplanan lipozomları (adım 2.4.4) yavaşça OB'ye yatırın ve ardından odanın üstüne başka bir örtü parçası yerleştirin. NOT: OB, cam yüzeyi pasifleştirmek ve lipozomlar20 arasındaki yapışmayı en aza indirmek için β kazein içerir.</li>
	<li>63x yağ daldırma hedefi kullanarak lipozomları konfokal mikroskopla gözlemleyin. Floresan olarak etiketlenmiş lipit, kapsüllenmiş floresan boya ve kapsüllenmiş floresan etiketli aktini gözlemlemek için sırasıyla 488 nm, 647 nm ve 561 nm lazer çizgileri kullanın. İlgilendiğiniz kareleri yakalayın ve görüntüleri TIFF formatında kaydedin.</li>
	<li>ImageJ/Fiji39'da görüntüleri işleyin ve analiz edin. ImageJ/Fiji'nin yeni kullanıcıları için çevrimiçi bir öğretici mevcuttur (bkz.<ol><li>ImageJ/Fiji yazılımını kullanarak TIFF dosyasını açın.</li>
		<li>Git Görüntü > Parlaklığı / Kontrastı > Ayarla. Minimum ve Maksimum ayarlarını, Parlaklık ve Kontrast kaydırıcılarını ayarlayarak görüntünün parlaklığını ve karşıtlığını istediğiniz ölçeğe ayarlayın.</li>
		<li>Araç çubuğundaki Dikdörtgen seçim aracına tıklayın ve ilgilenilen bölgeyi (YG) seçin. YG'yi kırpmak için Görüntü > Kırpma'ya gidin.</li>
		<li>Ölçeği Analiz > Ayarla'ya gidin. Açılır pencerede, Piksel En Boy Oranı alanına 1.0 girin ve μm'yi Uzunluk Birimi olarak ayarlayın. Piksel Cinsinden Uzaklık alanına görüntü genişliğini piksel cinsinden girin. Bilinen Uzaklık alanına, gerçek görüntü genişliğini mikron cinsinden girin.</li>
		<li>Lipozomun boyutunu ölçmek için, araç çubuğundaki Oval seçim aracını kullanarak, lipozomun kenarı boyunca bir daire çizin. Lipozomun çapının hesaplanabileceği dairenin alanını ölçmek için Analiz > Ölçüm'e gidin.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Birkaç önemli adım, hazırlık sürecinde yüksek miktarda lipozomun başarısını belirler. Lipit filmini yağda tamamen çözmek için, cam şişenin altındaki lipit filmi tamamen kaybolana kadar numune sonikleştirilmelidir. Sonikasyondan sonra, lipit-yağ karışımı, lipit moleküllerinin daha fazla dağılması için karanlık koşullar altında oda sıcaklığında gece boyunca saklanmalıdır29. Karışım 4 ° C'de bir haftaya kadar saklanabilir. İlgilenilen proteini içeren tek katmanlı lipit damlacıkları ile bir FB / yağ e...

Aktin sitoiskeleti, moleküler düzeyde kontraktiliteyi ve kuvvet üretimi 1,2,3'ü koordine ederek hücrenin hücre içi mimarisinin oluşturulmasında temel bir rol oynar. Sonuç olarak, hücre deformasyonu4,5, bölüm6, göç 7,8 ve yapışma9 dahil olmak üzere çok sayıda temel hücresel aktiviteye aracılık eder. Aktin ağlarının in vitro yeniden yapılanması son yıllarda10,11,12,13,14,15,16,17 gibi büyük ilgi görmüştür. Yeniden yapılanmanın amacı, canlı hücrelerde var olan karmaşık biyokimyasal düzenlemeden yoksun minimal bir hücre modeli oluşturmaktır. Bu, spesifik hücre içi aktiviteleri araştırmak için kontrol edilebilir bir ortam sunar ve aktin sitoiskeletinin farklı bileşenlerinin tanımlanmasını ve analizini kolaylaştırır18,19. Ayrıca, fosfolipid dev unilamellar veziküller (GUV'ler, lipozomlar) içindeki in vitro aktin ağlarının kapsüllenmesi, yarı geçirgen bir sınıra sahip sınırlı fakat deforme edilebilir bir alan sağlar. 9,20,21,22 hücresi içindeki aktin makinesinin fizyolojik ve mekanik mikro çevresini taklit eder.
Lipozomları hazırlamak için çeşitli yöntemler arasında, lipit filmi hidrasyon yöntemi (şişme yöntemi olarak da bilinir) en eski tekniklerden biridir23. Kuru lipit filmi, tamponların eklenmesiyle hidratlanır ve sonunda vezikül haline gelen membranöz kabarcıklar oluşturur24. Daha yüksek verime sahip daha büyük veziküller üretmek için, elektroformasyon yöntemi25 olarak bilinen film hidrasyon yönteminden ilerleyen geliştirilmiş bir yöntem, hidrasyon işlemini verimli bir şekilde teşvik etmek için bir AC elektrik alanı uygular26. Aktin kapsülleme için bu hidrasyon bazlı yöntemlerin başlıca sınırlamaları, yüksek konsantrasyonlu proteinlerin düşük kapsülleme verimliliğine sahip olması ve sadece spesifik lipit bileşimleri ile uyumlu olmasıdır24. Tersine çevrilmiş emülsiyon tekniği, karşılaştırıldığında, lipit bileşenleri ve protein konsantrasyonları20,27,28,29 için daha az sınırlamaya sahiptir. Bu yöntemde, kapsülleme için bir protein karışımı, daha sonra lipit içeren bir mineral yağ çözeltisinde emülsifiye edilen ve lipit-tek katmanlı damlacıklar oluşturan iç sulu tampona eklenir. Tek katmanlı lipit damlacıkları daha sonra iki katmanlı lipit vezikülleri (lipozomlar) oluşturmak için santrifüjleme yoluyla başka bir lipit / yağ-su arayüzünden geçer. Bu tekniğin aktin kapsülleme24,30 için en başarılı stratejilerden biri olduğu kanıtlanmıştır. Ayrı olarak, darbeli püskürtme31,32, geçici membran ejeksiyonu 33 ve cDICE yöntemi34 dahil olmak üzere bazı mikroakışkan cihaz yöntemleri vardır. Ters emülsiyon yöntemi ile mikroakışkan yöntem arasındaki benzerlikler, kullanılan lipit çözücü (yağ) ve lipozomların dış broşürünün oluşumu için lipit/yağ-su arayüzünün kullanılmasıdır. Buna karşılık, mikroakışkan yöntemle lipozomların üretilmesi, mikroakışkan cihazların kurulmasını gerektirir ve iki katmanın iki yaprağı arasında sıkışmış yağ eşlik eder, bu da yağın çıkarılması için ekstra bir adım gerektirir35.
Bu yazıda, daha önce kullanıldığı gibi polimerize bir F-aktin ağını kapsülleyen lipozomları hazırlamak için ters emülsiyon tekniğini kullandık22. Kapsülleme için protein karışımı ilk önce aktinin küresel (G) formunda kalması için polimerize olmayan koşullara sahip bir tampona yerleştirildi. Tüm işlem, daha sonra numunenin oda sıcaklığına ısınmasına izin verilerek tetiklenen erken aktin polimerizasyonunu önlemek için 4 ° C'de gerçekleştirildi. Oda sıcaklığına ulaştığında, aktin filamentli (F) formuna polimerize olur. Protein işlevlerini ve özelliklerini incelemek için iç sulu tampon çözeltisine çeşitli aktin bağlayıcı proteinler eklenebilir, böylece aktin ağı ve membran yüzeyi ile etkileşimi hakkında daha fazla bilgi sağlar. Bu yöntem aynı zamanda ilgilenilen çeşitli proteinlerin36 ve son lipozomların büyüklüğüne yakın büyük nesnelerin (mikropartiküller, kendinden tahrikli mikroyüzücüler, vb.)kapsüllenmesine de uygulanabilir 28,37.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-{[n(5-amino-1-karboksipentil)iminodiasetik asit]süksinil} nikel tuzu (DOGS-NTA-Ni)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipidler A.Ş.</td><td>231615773</td><td>Nikel Lipid</td></tr><tr><td>1,4-Diazabisiklo [2.2.2] oktan</td><td>Sigma</td><td>D27802-25G</td><td>DABCO</td></tr><tr><td>Aktin proteini (% >99 saf): tavşan iskelet kası</td><td>Hücre iskeleti, Inc</td><td>AKL99-D</td><td>floresan olmayan G-aktin</td></tr><tr><td>Aktin proteini (rodamin): tavşan iskelet kası</td><td>Cytoskeleton, Inc</td><td>AR05</td><td>floresan etiketli aktin</td></tr><tr><td>Adenozin 5 ve prime; -trifosfat disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma</td><td>A2383-10G</td><td>ATP</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 boya</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>floresan boya</td></tr><tr><td>Andor iQ3</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>konfokal mikroskop için kontrol ve edinim yazılımı</td></tr><tr><td>Arp2/3 Protein Kompleksi: Domuz Beyin</td><td>Hücre İskeleti, Inc</td><td>RP01P-A</td><td>Arp 2/3</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sigma</td><td>10035048</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Chamlide Odaları (12 mm yuvarlak lamel için 4 kuyulu)</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td>kuluçka odası</td></tr><tr><td>Kofilin proteini: insan rekombinant</td><td>Cytoskeleton, Inc</td><td>CF01-C</td><td>kofilin</td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop (63 kez; yağa daldırma objektifi)</td><td>Andor Technologies</td><td>LEICA DMi8</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-GLUKOZ BIOXTRA</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>glikoz</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>DOT Scientific&nbsp;</td><td>DSD11000-10</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Jelsolin Proteini: Homo Sapiens Rekombinant</td><td>Hücre İskeleti, Inc</td><td>HPG6</td><td>jelsolin</td></tr><tr><td>Hamilton 1750 Gaz Geçirmez Şırınga, 500 ve mikro; L, çimentolu iğne, 22 G, 2" konik uçlu</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-07940-53</td><td>cam şırınga</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/tutorials/</td></tr> <tr><td>L-alfa-Fosfatidilkolin</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>97281442</td><td></td></tr><tr><td>EPC Magnezyum klorür</td><td>Sigma</td><td>7786303</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Mineral yağ, BioReagent, moleküler biyoloji için, hafif yağ</td><td>Sigma</td><td>8042475</td><td>mineral yağ</td></tr><tr><td>N-WASP parçası WWA (aa400&ndash; 501, VCA-His)VCA-His</td><td></td><td></td><td>, laboratuvar protokolü kullanılarak saflaştırılır. Protokol makul talepler üzerine sağlanabilir</td></tr>: <tr><td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Fosfoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>O12650</td><td>DHPE</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma</td><td>7447407</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td>sükroz</td></tr> <tr><td>ve beta; - Sığır sütünden kazein</td><td>Sigma</td><td>C6905-250MG</td><td></td></tr></tbody></table>

İn vitro aktin hücre İskeletinin dev unilameller veziküller İçinde yeniden sulandırılması

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Hücredeki başlıca mekanik mekanizma olan aktin sitoiskeleti, hücre deformasyonu, bölünme, göç ve yapışma dahil olmak üzere çok sayıda temel fiziksel hücresel aktiviteye aracılık eder. Bununla birlikte, aktin ağının dinamiklerini ve yapısını in vivo olarak incelemek , canlı hücrelerdeki biyokimyasal ve genetik düzenleme ile karmaşıktır. Hücre içi biyokimyasal düzenlemeden yoksun minimal bir model oluşturmak için, aktin dev unilamellar veziküllerin (lipozomlar olarak da adlandırılan GUV'lar) içinde kapsüllenir. Biyomimetik lipozomlar hücre büyüklüğündedir ve sitoiskelet ağının mekanik ve dinamik özelliklerine nicel bir bakış açısı kazandırarak aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji için uygun bir yol açar. Kapsülleme için lipozomlar üretmek için, çeşitli hücre taklit sistemleri hazırlamak için karmaşık çözeltileri lipozomlara kapsüllemek için en başarılı tekniklerden biri olan ters emülsiyon yöntemi (emülsiyon transfer yöntemi olarak da adlandırılır) kullanılır. Bu yöntemle, daha sonra tek katmanlı lipit damlacıkları oluşturmak için fosfolipit içeren bir mineral yağ çözeltisinde emülsifiye edilen iç tampona ilgili proteinlerin bir karışımı eklenir. İstenilen lipozomlar, lipit/yağ-su arayüzünden geçen tek katmanlı lipit damlacıklarından üretilir. Bu yöntem, konsantre aktin polimerlerinin istenen lipit bileşenleri ile lipozomlara kapsüllenmesini sağlar ve biyomimikting bir sitoiskelet ağının in vitro olarak yeniden sulandırılmasının yolunu açar.

İnverted emülsiyon tekniğine dayalı lipozomların hazırlanması Şekil 1'de grafiksel ve şematik olarak gösterilmiştir.
İlk olarak, fosfolipid (EPC) ve floresan lipidden (DHPE) oluşan boş (çıplak) lipozomlar (~5-50 μm çapında) hazırlandı. Parlak, çok kırmızı bir floresan boya, bir kontrol deneyi olarak çıplak lipozomların içinde kapsüllendi. Damlacığın periferiğinde bir lipit tek katmanının başarılı bir şekilde oluşup oluşmadığı, Şekil 2A'da</str...

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Bu önlem, karmaşık biyokimyasal düzenlemelerden yoksun hücrenin minimum bir modelini oluşturur. Kullanılan teknik, yüksek miktarda lipozom üretebilir ve sitoiskelet proteinleri için yüksek kapsülleme verimliliğine sahip olabilir. Bu önlem, çeşitli proteinlerin ve mikropartiküller ve kendi kendini hazırlayan mikro yüzücüler gibi büyük nesnelerin kapsüllenmesine uygulanabilir.Bir birey ilk birkaç girişim için lipozom verimini arttırmak için mücadele ediyor. Verimi artırmak için daha fazla ayrıntı için makalenin düzenli olarak tartışılması önerilir. Başlamak için, 0.1 milimolar CACL iki, 10 milimolar HEPES, bir milimolar DTT, 0.5 milimolar DAPCO, 320 milimolar sakkaroz ve 0.2 milimolar ATP'yi karıştırarak sulu iç polimerizasyon tamponunu toplam beş mililitre hacimde hazırlayın.Protein karışımını, polimerizasyon içermeyen iç tampona dört santigrat derecede proteinler ekleyerek hazırlayın. Bir aktin tabakası oluşturmak için, protein karışımına 100 nanomolar gellcalin, dört mikromolar coughalin ve 2.2 mikromolar VCA HEZ ekleyin. Bir kontrol deneyi olarak, protein karışımını mililitre floresan boya başına 100 mikrogram ile değiştirin.Sulu iç polimerizasyon tamponunu, 100 milimolar potasyu

in-vitro-reconstitution-actin-cytoskeleton-inside-giant-unilamellar

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

electroformation ve jel destekli şişme - dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Yüksek oranda paketlenmiş mikrometre boyutunda bileşenler içeren dev kesecikler kullanışlı hücre modelleridir. Yağda su emülsiyonu santrifüjleme yöntemi, kapsüllenmiş malzemelerle dev veziküllerin hazırlanması için basit ve güçlü bir araçtır.

bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması

Erken endosome fonksiyonları F-aktin polimerizasyon üzerinde bağlıdır. Burada, böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi biyokimyasal ve genetik mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklamak manipülasyonlar.

Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

Çoğu protein hücredeki hissediyorum ve membran eğriliği neden. Membran nanotüpler lipid veziküller eğri membranlar içinde vitroetkileşim proteinler veya herhangi bir eğrilik aktif molekül çalışmaya üzerinden çekmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

Bu makalede, kapsüllenmiş sitoiskelet proteinleri ile dev unilamellar veziküllerin hızlı üretimi için basit bir yöntem tanıtılmaktadır. Yöntemin, hapsetmede ve sitoiskelet-membran etkileşimlerinde sitoiskelet yapılarının aşağıdan yukarıya doğru resulaştırılmasında yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

Yeniden Yapılandırılmış Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Hızlı Kapsüllenmesi

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Bu protokol, bir model membran proteininin lipid çift tabakasına sentezinin ve dahil edilmesinin araştırılması için dev bir unilamellar vezikül (GUV) içinde bir hücresiz ekspresyon (CFE) sistemini kapsüllemek için kullanılan ters emülsiyon yöntemini tanımlar.

Bakteriyel Glutamat Reseptör Kanalının, Hücresiz Bir Ekspresyon Sisteminin Kapsüllenmesi ile Sulandırılması

Bu makale, iç, halka ve dış bölgelerde özelleştirilmiş elektriksel iletkenliğe sahip, vezikül içinde vezikül yapısına sahip bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin (cGUV'ler) hazırlanması için bir yöntem sunar. Elektroformasyon, ozmotik şok yoluyla stomatositlere ve cGUV'lara dönüştürülen basit GUV'leri sentezler ve çekirdekli hücrelerin biyofiziğini incelemek için değerli bir model sağlar.

Bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin Sentezi: Çekirdek Hücrelerin Biyomimetik Bir Modeli

Bu makale, fazla ayrılmış dev veziküller içindeki hücre iskeleti ağlarının basit bir tek kap sulandırmasını tanıtmaktadır. Yöntem genelleştirilebilir ve çok çeşitli biyomoleküllerin kapsüllenmesi veya hapsedilmesi için uygulanabilir.

Laboratuvar ortamında Fazla Ayrılmış Dev Unilamellar Veziküller (GUV'ler) İçindeki Hücre İskeleti Ağlarının Sulandırılması

Bu yazıda veziküller, transkripsiyon ve çeviri makine kapsülleme ve protein üretiminin izlenmesi hazırlanması için basit bir yöntem tarif eder. Elde edilen hücre-içermeyen sistemler gittikçe daha karmaşık hücresel taklit oluşturmak için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir.

Hücresel Mimics İnşası için Veziküller Hücre-ücretsiz Transkripsiyon ve Çeviri Makine Sarma

Öğrenin, F-aktin hücre iskeletini dev unilameller veziküllere kapsüllendirme yöntemini. Bu teknik, biyomimetik korteks katmanı oluşturarak hücre mekaniği araştırmalarına katkı sağlar.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Daha fazla video keşfet