Name: İyonlaştırıcı Işınlamaya Yanıt Olarak Bağırsak Epitelyal Rejenerasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Keşfedin, fare modelinde gama ışınlaması sonrası bağırsak epitel rejenerasyonunu. Hücre aktivasyonu, farklılaşması ve göçü incelenerek kanser tedavisi sonrası iyileşme mekanizmaları anlaşılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, doku örneği hazırlama konusunda uzman yardımı için Stony Brook Kanser Merkezi Histoloji Araştırma Çekirdeği'ne ve hayvan bakımı ve kullanımı konusunda yardım için Stony Brook Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Bölümü'ne teşekkür etmek istemektedir. Bu çalışma, Agnieszka B. Bialkowska'ya verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri DK124342 ve Dr. Vincent W. Yang'a verilen DK052230 hibeleriyle desteklenmiştir.

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Bu protokol, sağlam ve tekrarlanabilir bir radyasyon hasarı modelini tanımlar. Yaralanma sonrası 7 gün boyunca bağırsak epitelindeki değişikliklerin hassas analizine izin verir. Önemli olarak, seçilen zaman noktaları yaralanmanın önemli aşamalarını yansıtır ve bağırsakta belirgin değişiklikler (yaralanma, apoptoz, rejenerasyon ve normalleşme aşamaları) ile karakterize edilir60. Bu ışınlama modeli, radyoterapi gören hastaların yaşadığı taklit yaralanmasının uygun bir tezahürünü gösteren<sup class="...

İnsan bağırsak epiteli, tamamen düz1 yerleştirilirse yaklaşık yarım badminton kortunun yüzeyini kaplar. Bunun yerine, insanları bağırsaklarının içeriğinden ayıran bu tek hücre tabakası, bağırsakların yüzey alanını en üst düzeye çıkaran bir dizi parmak benzeri çıkıntı, villus ve girinti, kriptlere sıkıştırılır. Epitelin hücreleri bir kript-villus ekseni boyunca farklılaşır. Villus öncelikle besin emici enterositlerden, mukus salgılayan kadeh hücrelerinden ve hormon üreten enteroendokrin hücrelerden oluşurken, kriptler öncelikle savunma üreten Paneth hücreleri, aktif ve rezerv kök hücreler ve progenitör hücrelerdenoluşur 2,3,4,5. Ayrıca, bu hücrelerin altta yatan mezenkimal kompartmanın stromal ve immün hücreleri ve lümenin mikrobiyotası ile sahip olduğu çift yönlü iletişim, bağırsak homeostazını koruyan ve yaralanma sonrası iyileşme için kritik olan karmaşık bir etkileşim ağı oluşturur 6,7,8.
Bağırsak epiteli, insan vücudunda en hızlı kendini yenileyen dokudur ve 2-6 günlük bir devir hızı 9,10,11'dir. Homeostaz sırasında, lösin bakımından zengin tekrar içeren G-protein eşleşmiş reseptör 5'in (LGR5) ekspresyonu ile işaretlenmiş bağırsak kriptlerinin tabanındaki aktif kök hücreler (kript baz sütunlu hücreler), hızla bölünür ve diğer tüm bağırsak epitel soylarına farklılaşan progenitör hücreler sağlar. Bununla birlikte, yüksek mitotik oranları nedeniyle, aktif kök hücreler ve acil progenitörleri gama radyasyonu hasarına karşı özellikle hassastır ve ışınlama sonrası apoptozauğrarlar 5,12,13,14. Kayıpları üzerine, bağırsak kriptleri içindeki kök hücreleri ve kök olmayan hücreleri (progenitörlerin alt popülasyonu ve bazı terminal olarak farklılaşmış hücreler) aktivasyona uğrar ve bazal kript bölmesini yeniler, bu da daha sonra villusun hücre popülasyonlarını yeniden oluşturabilir ve böylece bağırsak epiteli15'i yenileyebilir. Soy izleme tekniklerini kullanan çok sayıda araştırma grubu, rezerv (sessiz) kök hücrelerin aktif kök hücrelerin kaybı üzerine rejenerasyonu destekleyebildiğini göstermiştir 13,16,17,18,19,20,21,22. Bu hücreler, polycomb kompleks protein 1 onkogen (Bmi1), fare telomeraz ters transkriptaz geni (mTert), Hop homeobox (Hopx) ve lösin bakımından zengin tekrar protein 1 geninin (Lrig1) varlığı ile karakterize edilir. Ek olarak, kök olmayan hücrelerin yaralanma üzerine bağırsak kriptlerini yenileyebildiği gösterilmiştir 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Özellikle, salgı hücrelerinin ve enterositlerin progenitörlerinin yaralanma üzerine dediferansiyasyona uğradığı, kök benzeri hücrelere geri döndüğü ve bağırsak epitelinin yenilenmesini desteklediği gösterilmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, yaralanma üzerine kök benzeri özellikler kazanma kapasitesine sahip çoklu belirteçleri eksprese eden hücreleri tanımlamıştır (DLL +, ATOH1 +, PROX1 +, MIST1 +, DCLK1 + gibi)32,33,34,35,36. Şaşırtıcı bir şekilde, Yu ve ark. olgun Paneth hücrelerinin (LYZ +) bile bağırsak yenilenmesine katkıda bulunabileceğini göstermiştir37. Ayrıca, intestinal epitel hücrelerinin apoptozuna neden olmanın ve epitel bariyer fonksiyonunu bozmanın yanı sıra, ışınlama bağırsak florasının disbiyozu, immün hücre aktivasyonu ve pro-inflamatuar yanıtın başlatılması ve mezenkimal ve stromal hücrelerin aktivasyonu ile sonuçlanır38,39.
Gama radyasyonu, kanser tedavisinde, özellikle kolorektal tümörler için değerli bir terapötik araçtır40. Bununla birlikte, ışınlama, hücrelere zarar vererek bağırsak homeostazını önemli ölçüde etkiler ve bu da apoptoza yol açar. Radyasyona maruz kalma, hastanın iyileşmesini yavaşlatan çoklu pertürbasyonlara neden olur ve akut fazda mukozal yaralanma ve iltihaplanma ve ishal, idrar kaçırma, kanama ve uzun vadede karın ağrısı ile işaretlenir. Bu tezahür panoply, gastrointestinal radyasyon toksisitesi olarak adlandırılır. Ek olarak, transmural fibroz ve / veya vasküler sklerozun radyasyona bağlı ilerlemesi ancak tedaviden yıllar sonra ortaya çıkabilir38,41. Yaralanmanın kendisiyle eşzamanlı olarak, radyasyon bağırsak hücrelerinde rejenerasyonu başlatmaktan ve düzenlemekten sorumlu sinyal yollarını aktive eden bir onarım tepkisi indükler42. Radyasyona bağlı ince bağırsak hastalığı, diğer organlara (serviks, prostat, pankreas, rektum gibi) verilen pelvik veya abdominal radyoterapiden kaynaklanabilir41,43,44,45,46. Bu nedenle intestinal ışınlama hasarı önemli bir klinik konudur ve ortaya çıkan patofizyolojinin daha iyi anlaşılması, radyoterapi ile ilişkili gastrointestinal komplikasyonları hafifletmek için müdahalelerin geliştirilmesini ilerletebilir. Bağırsak epitelinin rejeneratif amacını radyasyondan ayrı olarak araştırmaya izin veren başka teknikler de vardır. Enflamasyonu ve daha sonra rejenerasyonu incelemek için transgenik ve kimyasal murin modelleri geliştirilmiştir47. Dekstran sodyum sülfat (DSS) bağırsakta iltihaplanmaya neden olur ve enflamatuar bağırsak hastalığınınkine benzer özelliklerin gelişmesine yol açar48. DSS tedavisinin pro-kanserojen bileşik azoksimetan (AOM) ile kombinasyonu, kolit ile ilişkili kanserin gelişmesine neden olabilir48,49. İskemi reperfüzyonuna bağlı yaralanma, bağırsak epitelinin rejeneratif potansiyelini incelemek için kullanılan başka bir yöntemdir. Bu teknik tecrübe ve cerrahi bilgi gerektirir50. Ayrıca, yukarıda belirtilen teknikler radyasyondan farklı yaralanma türlerine neden olur ve farklı rejenerasyon mekanizmalarının dahil olmasına neden olabilir. Ek olarak, bu modeller zaman alıcıdır, radyasyon tekniği ise oldukça kısadır. Son zamanlarda, bağırsak ve kolondan üretilen enteroidleri ve kolonoidleri kullanan in vitro yöntemler, bağırsak rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için radyasyon hasarı ile birlikte kullanılmıştır51,52. Bununla birlikte, bu teknikler modelledikleri organı tam olarak özetlemez53,54.
Sunulan protokol, tamoksifen tedavisini takiben, rezerv kök hücre popülasyonundan (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Bu model, rezerv kök hücreleri aktive etmek için yeterince önemli bağırsak hasarına neden olan 12 Gy toplam vücut ışınlamasını kullanırken, yaralanmadan sonraki 7 gün içinde bağırsak rejeneratif kapasitesinin daha sonra araştırılmasına izin verir55.

<table><tbody><tr><td>1 mL şırınga</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>309659-16G Yeniden Kullanılabilir Küçük Hayvan Besleme İğneleri: Düz</td><td>VWR</td><td>20068-630-27G</td><td></td></tr> <tr><td>x 1/2 "iğne</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>305109-28G x 1/2" Monoject 1mL insülin şırıngası</td><td>Covidien</td><td></td><td></td> 1188128012-5-Etinil-2</tr> <tr><td>ve prim;-deoksiüridin (EdU)</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc284628A</td><td>steril DMSO'da 10 mg/mL: su (1:4 v/v), alikot ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Azer Bilimsel&nbsp; % 10 Nötr Tamponlu Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-213-B6.129X1-Gt</td><td></td></tr> <tr><td>(ROSA) 26Sortm1 (EYFP) Cos / J</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>Suşu #: 006148</td><td></td></tr><tr><td>B6; 129-BMI1tm1 (cre / ERT) Mrc / J</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>Suşu #:010531</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin Fraksiyonu V, ısı şoku</td><td>Millipore-Sigma</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk anti-GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 görüntüleme kiti, Invitrogen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10638-Mısır</td><td></td></tr> <tr><td>yağı</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C8267-Decloaking</td><td></td></tr> <tr><td>Odası</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012-Dimetil</td><td></td></tr> <tr><td>sülfoksit (DMSO)</td> <td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td>ışığa duyarlı</td></tr><tr><td>DNaz içermeyen proteinaz K</td><td>DPBS'de 25 kat seyreltilmiş</td><td>Invitrogen</td><td>C10618H</td></tr><tr><td>Donkey anti-tavuk AF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-605-155</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-031-CV-Eosin</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S176</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Mikroskobu Nikon Eclipse 90i Parlak ve akıcı ışık, objektiflerle: 10X, 20X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Sulu Montaj Ortamı</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Gama Hücresi 40 Eksaktör</td><td>Best Theratronics Ltd.</td><td>-</td><td>0.759 Gy min-1</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen Çözeltisi, Solungaç No. 3</td><td>Millipore-Sigma</td><td>GHS332</td><td></td></tr><tr><td>HM 325 Thermo Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-900-668'den</td><td></td>Döner Mikrotom</tr><tr><td>Hoechst 33258, Pentahidrat (bis-Benzimid)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3569</td><td>seyreltme 1:1000</td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit Çözeltisi, ACS, %29-32, Spectrum Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-603-252-Yerinde</td><td></td></tr> <tr><td>Hücre Ölümü Tespit Kiti, Floresein (Roche)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>11684795910</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Engelleyici Süper PAP KALEMİ, Mini</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>Lityum Karbonat (Toz/Sertifikalı ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>L119-500</td><td>0.5g/1L dH2O</td></tr><tr><td>Luer-Lok Şırınga steril, tek kullanımlık, 10 mL</td><td>VWR</td><td>89215-218-Metanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Pharmco Ürünleri&nbsp; Etil alkol, 200 KANIT</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Asetik Asit ACS Sınıfı</td><td>Capitol Scientific</td><td>AAP-281000ACSCSLT-Tavşan</td><td></td></tr> <tr><td>anti-Ki67</td><td>BioCare Medical</td><td>CRM325</td><td></td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Montaj Ortamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>65 derecede slaytları pişirmek için Scientific Industries Incubator-Genie</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-728-103</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Sitrat Dihidrat</td><td>Fisher</td><td>Scientific S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Diseksiyon Kiti</td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus mikro slaytlar [boyut: 25 x 75 x 1 mm]</td> <td>VWR</td> <td>ve nbsp; 48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksifen</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T5648</td><td>steril mısır yağında 30 mg / mL, tercihen -20 ° C'de taze veya kısa süreli depolama; C, Işığa</td></tr><tr><td>Duyarlı Tissue-Tek 24 Sürgülü Tutucu Çıkarılabilir Saplı</td><td>Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&nbsp; Accu-Edge&nbsp; Düşük Profilli Bıçaklar</td><td>Sakura</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&nbsp; Manuel Slayt Boyama Seti</td><td>Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Boyama Kabı, Yeşil Kapaklı</td><td>Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Boyama Kabı, Beyaz Kapaklı</td><td>Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Unisette İşleme Kasetleri</td><td>VWR</td><td>87002-292-VWR</td><td></td></tr> <tr><td>Mikro Kapaklı Gözlükler</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

İyonlaştırıcı işınlamaya yanıt olarak bağırsak epitelyal rejenerasyonu

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Bağırsak epiteli, tek bir hücre katmanından oluşur, ancak bağırsak kriptlerinin dibinde bulunan bağırsak kök hücrelerinin aktif çoğalmasıyla üretilen çok sayıda terminal farklılaşmış hücre türü içerir. Bununla birlikte, akut bağırsak hasarı olayları sırasında, bu aktif bağırsak kök hücreleri hücre ölümüne uğrar. Gama ışınlaması, terapötik olarak etkili olsa da, aktif kök hücre havuzunu tüketmenin yan etkisine sahip olan, yaygın olarak kullanılan bir kolorektal kanser tedavisidir. Gerçekten de, hastalar kısmen aktif kök hücre tükenmesi nedeniyle radyoterapi görürken sıklıkla gastrointestinal radyasyon sendromu yaşarlar. Bağırsak kriptlerindeki aktif bağırsak kök hücrelerinin kaybı, tipik olarak sessiz rezervli bağırsak kök hücrelerinden oluşan bir havuzu aktive eder ve sekretuar ve enterosit öncü hücrelerinin farklılaşmasını indükler. Bu hücreler için olmasaydı, bağırsak epiteli radyoterapi ve diğer büyük doku hakaretlerinden kurtulma yeteneğinden yoksun olurdu. Soy izleme teknolojilerindeki yeni gelişmeler, rejenerasyon sırasında hücrelerin aktivasyonunun, farklılaşmasının ve göçünün izlenmesine izin verir ve bunu bağırsakta incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu çalışma, radyasyon hasarını takiben fare bağırsak epiteli içindeki hücrelerin analizi için bir yöntem göstermeyi amaçlamaktadır.

Murin genetik soy takibi ile kombinasyon halinde 12 Gy toplam vücut ışınlamasının (TBI) kullanılması, bağırsaktaki radyasyon hasarının sonuçlarının kapsamlı bir analizine izin verir. Başlamak için, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP fareleri, bir Bmi1 + rezerv kök hücre popülasyonunda gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) ekspresyonunu indükleyen tek bir tamoksifen enjeksiyonu aldı. Tamoksifen enjeksiyonundan iki gün sonra, farelere ışınlama veya sahte ışınlama uygulandı. Ötanaziden üç saat ...

Gastrointestinal sistem, radyoterapötik kanser tedavileri üzerine yaralanmaya karşı en hassas organlardan biridir. Aynı zamanda, bu tür hakaretleri takiben en yüksek rejeneratif kapasitelerden birine sahip bir organ sistemidir. Sunulan protokol, bağırsak epitelinin rejeneratif kapasitesini incelemek için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.

İyonlaştırıcı Işınlamaya Yanıt Olarak Bağırsak Epitelyal Rejenerasyonu

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Gama ışınlaması, kolorektal kanser için yaygın olarak kullanılan bir tedavidir. Terapötik olarak etkili olmasına rağmen, gastrointestinal sistem üzerinde olumsuz etkileri vardır. Sunulan protokol, radyasyon hasarından sonra rejenerasyon sırasında hücrelerin aktivasyonunu, farklılaşmasını ve göçünü incelemek için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.Bu protokol, sağlam ve tekrarlanabilir bir radyasyon hasarı modelini tanımlar. Önemli olarak, bu model yaralanma sonrası bağırsak hücresi kaderini izlemeye izin verir ve böylece spesifik hücre alt popülasyonunun rejeneratif kapasitesinin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Bu teknik, gerçek zamanlı davranışı ve yaralanma sonrası hücrelerin çeşitli alt popülasyonlarının etkileşimini incelemek için farklı soy izleme hayvan modellerini kullanabilir.Bu protokoldeki küçük değişiklikler, radyasyon hasarı üzerine mikrobiyota ile farklı epitelyal, stromal ve immün hücre popülasyonları arasındaki ilişkilerin araştırılmasına izin vermelidir. Başlamak için, tamoksifen tozunu steril mısır yağında mikrolitre başına 30 mikrogramlık bir konsantrasyonda tekrar askıya alın. % 60 genlik ile 30 saniye açma-kapama döngülerinde üç dakika boyunca sonikasyon.Oda sıcaklığında bir saat boyunca karanlıkta dönerek karıştırın. Ardından, EdU tozuna steril DMSO ekleyerek EdU'yu hazırlayın. Toplam hacmin 1 / 5'ini ekleyin ve kalan steril ultra saf su hacmini yavaşça ekleyin.Tamamen çözündüğünde, aliquot ve 20 santigrat derecede saklayın. Sudaki %70 etanol, dört santigrat dereceye kadar soğutulmuş DPBS, Bouin'in fiksatif tamponu ve %10 tamponlu formalin gibi doku toplama ve fiksasyon için reaktifler hazırlayın. Daha sonra, bir fare diseksiyon kiti, Petri tabakları, 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 16 gauge gavage iğnesi ve histolojik kasetler gibi gerekli ekipmanı hazırlayın.Gama ışınlamasına maruz kalmadan iki gün önce, deney hayvanlarını tamoksifen enjeksiyonu için hazırlayın. Her hayvanı tartın ve gerekli dozu hesaplayın. Karın bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin.Daha sonra, Cre aracılı rekombinasyonu indüklemek için bir mililitrelik bir şırıngaya bağlı 27 gauge iğne kullanarak intraperitoneal olarak tek bir tamoksifen dozu uygulayın. Potansiyel tamoksifen toksisitesini dışlamak için önümüzdeki 48 saat boyunca hayvanları gözlemleyin. 48 saat sonra, hayvanları ışınlama odasına aktarın.Gama ışınlayıcısındaki numune odasını %70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin. Emici paspası ve hayvanları numune odasının içine yerleştirin. Kapağı yerleştirin ve odayı kapatın.Gama ışınlayıcısını, hayvanları 12 gri toplam vücut ışınlamasına maruz bırakacak şekilde programlayın. Ardından, anahtarı başlangıç konumuna getirin ve pozlamayı başlatmak için başlat tuşuna basın. Aktif pozlama süresi için odayı terk edin.Önceden ayarlanmış süre geçtikten sonra, makine otomatik olarak durur ve bip sesi çıkarmaya başlar. Anahtarı durma konumuna getirerek makineyi kapatın. Numune haznesini açın ve kapağı çıkarın.Hayvanları kafese aktarın ve numune odasını% 70 etanol ile dezenfekte edin. Hayvanları geleneksel barınma odasına geri aktarın ve tedavi sonrası durumlarını gözlemleyin. Hayvanların ağırlığını her gün izleyin.Planlanan ötenaziden üç saat önce, karın bölgesini dezenfekte edin ve farelere 28 gauge insülin şırıngası kullanarak 100 mikrolitre EdU stok çözeltisi ile intraperitoneal olarak enjekte edin. Hayvanı ötenazi yaptıktan sonra, proksimal bağırsakları ışınlama sonrası farklı zaman noktalarında toplayın. İnce bağırsağın proksimal kısmını diseke edin ve bağlı dokuları çıkarın.10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 16 gauge düz besleme iğnesi kullanarak dokuyu soğuk DPBS ile yıkayın ve dokuyu Bouin'in fiksatif tamponu ile sabitleyin. Bağırsakları uzunlamasına kesin ve Swiss-roll tekniğini kullanarak proksimal bağırsakları yuvarlayın. Dokuları% 10 tamponlu formalin içeren bir kaba histolojik bir kaset içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin.İnkübasyondan sonra, histolojik kasetleri% 70 etanol'e aktarın ve dokuyu parafine gömün. Gömdükten sonra, histolojik kasetleri en az bir saat boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ardından, bir mikrotom kullanarak beş mikron kalınlığında yatay bölümleri kesin.Doku bölümlerini 45 santigrat dereceye kadar ısıtılmış bir su banyosuna aktarın ve bölümleri yüklü slaytlara yerleştirin. Slaytları kuruması için gece boyunca oda sıcaklığında bir rafta bırakın. İnce bağırsak örneklerinin hematoksilin ve eozin görüntüleri, sıfır saatte homeostatik bir bağırsak epiteli gösterdi ve bunu apoptotik faz sırasında kript bölmelerindeki hücrelerin kaybı izledi.Bunu, yüksek proliferatif hücrelerin kriptleri doldurduğu ve yedinci güne kadar normalleşme aşamasına yol açan rejeneratif faz izledi. EYFP tarafından yapılan soy izlemesi, homeostaz sırasında, Bmi1 pozitif rezerv kök hücrelerinden kaynaklanan hücrelerin, kriptler içindeki artı dört ila artı altı pozisyonla sınırlı olduğunu göstermiştir. EdU ve Ki-67 boyaması, sahte ışınlanmış farelerde, aktif kök hücrelerden transit yükseltici bölgeye kadar uzanan normal bağırsak homeostazı gösterdi.Apoptotik faz sırasında, radyasyon hasarının neden olduğu proliferatif hücrelerin kaybı ile birlikte EYFP-pozitif hücrelerin sayısı azaldı. Rejeneratif fazda, rezerv kök hücrelerin aktivasyonu ve Bmi1-pozitif hücrelerin hızlı proliferasyonu gözlendi. Daha fazla proliferasyon ve migrasyon bağırsak epitel bütünlüğünü yeniden sağladı.TUNEL boyaması, homeostaz sırasında apoptotik hücrelerin bulunmadığını gösterdi. Apoptotik fazda geç dönemde TÜNEL boyamasında artış gözlendi. Rejeneratif faz sırasında, TUNEL boyaması, rejenere kriptler içinde istikrarlı bir şekilde azaldı ve kriptolar normalleştiğinde neredeyse hiç yoktu.Bu teknik, yaralanma sonrası bağırsak rejenerasyonu sırasında spesifik hücre soylarının rolü hakkında daha derinlemesine bilgi toplamak için RNA dizileme, tek hücreli RNA dizileme, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama veya proteomik analiz ile birleştirilebilir. Araştırmacılar, bağırsak epitelinin rejeneratif kapasitesinin anlaşılmasını genişletmek için bağırsak rejenerasyonunda mikrobiyota ve epitelyal, stromal ve bağışıklık hücresi popülasyonları arasındaki etkileşimleri araştırabilirler.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Insanlarda akut böbrek hasarı (AKI), böbrek nefron oluşturan epitel hücrelerin zarar görmesine neden olduğu yaygın bir klinik sorundur ve AKI, yüksek ölüm oranları% 50-70 ile...

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Planaria arasında tanımlanmış ve tutarlı bir büyüklükte doku aşılama için etkili bir yöntem tarif edilmiştir. Ayrıca nakli için kullanılan immobilizasyon tekniği canlı hayvanların kısmi ışınlanması için kurşun kalkanlar, ile birlikte, nasıl uyarlanabileceğini bir açıklama dahildir.

Planarian İmmobilizasyon, Kısmi Işınlama, ve Doku Nakli

Biz X x-ray ışınlanmış Caco-2 ve periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) arasındaki çapraz karışma araştırmak için bir protokol mevcut. Protokol Caco-2 ışınlama ve set-up ortak kültür PBMC ile başlar; daha sonra trans-epitel elektriksel direnç düzenli olarak 48 s ve western blot Caco-2 ve PBMC gerçekleştirilen üzerinden ölçülür.

X-ışını arasında çapraz karışma araştırmak için bir ortak kültür yöntemi Caco-2 hücreleri ve PBMC radyasyona maruz

Burada, küçük bağırsak hasarının önemli uç noktalarını ve proliferatif belirteçleri ve kemoterapi kaynaklı Mukozit modeli kullanılarak telafi edilen hiperproliferasyonu oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Biz bir hücre döngüsü özel marker kullanarak proliferasyon hücrelerin tespiti ve küçük bağırsak ağırlığı kullanarak göstermek, Crypt derinliği, ve uç noktaları olarak villus yüksekliği.

Kemoterapiye bağlı Mukozinin fare modelini kullanarak küçük bağırsak yaralanmasını ve uyarlamasını değerlendirmek için önemli uç noktalar ve proliferatif Işaretçiler

Fare meme bezlerinden geliştirilen organoidler ışınlanmış ve epitelyal özellikleri ve immün hücrelerle etkileşimleri değerlendirmek için karakterize edilmiştir. Işınlanmış organoids daha iyi radyal normal dokuda tümör hücre işe neden olabilir hücre hücre etkileşimleri değerlendirmek için kullanılabilir.

Mammary bezlerinden ışınlanmış Organoidlerin büyüme ve karakterizasyonu

Morfoloji ve tükürük bezlerinin fonksiyonel belirteçleri görselleştirmek için üç boyutlu organotypic kültürler kullanarak radyasyon aşağıdaki doku hasarı mekanizmaları yeni anlayış sağlayabilir. Burada açıklanan bölüm, kültür, ışınlama, leke ve görüntü 50 – 90 μm kalınlığında tükürük bezi bölümleri önce ve iyonlaştırıcı radyasyon maruz aşağıdaki bir protokoldür.

Submandibular ve parotis tükürük bezlerinden Organotipik kültürlerin radyasyon tedavisi anahtar In vivo özellikleri

Bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron karışık ışınıile aktive edilen radyasyona bağlı DNA hasar tepkisi tam olarak belirlenmemiştir. Bu protokol, nötron-karışık ışın ile ışınlama sonra insan kolon kanseri hücre hatlarında immünofloresan boyama tarafından onarım proteinlerinin radyasyonkaynaklı foci (RIF) tespit etmek için adım adım bir prosedür sağlar.

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

Burada, lazerle indüklenen yaralama üzerine bağırsak görüntülerini elde etmek için bir yöntem sunuyoruz. Fare bağırsağını bir multifoton lazere maruz bırakarak, tek veya birden fazla kript (ler) in kaybı yerel olarak indüklenir. Hasarlı bölgeyi aylar boyunca tekrar tekrar görüntüleyerek, bağırsak iyileşmesinin gerçek zamanlı dinamikleri yakalanır.

Bağırsak Yeniden Şekillenmesini İncelemek için Lazer Ablasyon ve İntravital Mikroskopi

3 boyutlu kolonoidlerin gelişimi için murin kolonik kriptlerinin izolasyonunu detaylandıran bir protokol açıklıyoruz. Yerleşik kolonoidler daha sonra, enflamatuar bir meydan okuma almadan veya bir epitelyal tek tabaka oluşturmaya yönlendirilmeden önce konakçı epitelinin hücresel bileşimini yansıtacak şekilde terminal olarak farklılaştırılabilir.

İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi

İmmünofloresan görüntüleme, karmaşık, zamana bağlı biyolojik süreçleri zaman içinde tek bir anlık görüntüde gözlemleme yeteneği ile sınırlıdır. Bu çalışma, hassas kesilmiş fare submandibular bez dilimleri üzerinde yürütülen canlı görüntüleme yaklaşımını özetlemektedir. Bu yaklaşım, homeostaz ve rejenerasyon ve onarım süreçleri sırasında hücre-hücre etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine izin verir.

Tükürük bezindeki hücre-hücre etkileşimlerinin ex vivo canlı hücre görüntüleme ile sorgulanması

Keşfedin, fare modelinde gama ışınlaması sonrası bağırsak epitel rejenerasyonunu. Hücre aktivasyonu, farklılaşması ve göçü incelenerek kanser tedavisi sonrası iyileşme mekanizmaları anlaşılır.

İyonlaştırıcı Işınlamaya Yanıt Olarak Bağırsak Epitelyal Rejenerasyonu

Daha fazla video keşfet