Name: Ortaya Çıkan Antibiyotikleri Test Etmek için Yeni Bir Yüksek Verimli Ex Vivo Küçükbaş Hayvan Cilt Yara Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Keşfedin, Staphylococcus aureus ile enfekte edilmiş ex vivo koyun derisi yara modeli kurulumunu. Bu yöntem, yeni antimikrobiyallerin etkinliğini test etmek için geleneksel tekniklere göre daha fizyolojik olarak uygun bir platform sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar EPSRC'ye (EP/R513313/1) finansman için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Calow, Chesterfield'daki R.B Elliot ve Son Mezbaha'ya, kuzu başlarını sağladıkları ve projenin ilk aşamalarında bu kadar uzlaşmacı oldukları için, Kasia Emery'ye bu protokolün geliştirilmesi boyunca verdiği destek için ve Sheffield Üniversitesi Enfeksiyon, Bağışıklık ve Kardiyovasküler Hastalıklar Bölümü'nden Fiona Wright'a histoloji örneklerini işledikleri ve bu proje boyunca inanılmaz derecede yardımcı oldukları için teşekkür etmek istiyorlar.

Bu projede deri örneklerinin kaynağı olarak R.B Elliott ve Son Mezbaha'dan kuzu başları kullanılmıştır. Bütün kuzular yiyecek olarak tüketilmek üzere kesildi. Kafaları atmak yerine, bunlar araştırma için yeniden tasarlandı. Doku mezbahalardan atılan atıklardan kaynaklandığı için etik onay gerekli değildi.
1. Sterilizasyon
<ol><li>Kafaları toplamadan önce forsepsleri temiz forseps alarak ve 1 saat boyunca 200 °C'de bir fırında kuru ısı sterilizasyonu yaparak dezenfekte edin. Tüm cam eşyaları kullanmadan önce 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın.</li>
	<li>Tarif edilen tüm çalışmaları bir mikrobiyoloji sınıf 2 kabini içinde gerçekleştirin. Tüm reaktifleri üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.</li>
</ol>2. Örnek toplama
<ol><li>Mezbahada, Swaledale kuzuları elektrik veya esir cıvatalı tabanca kullanılarak çarpıcı bir şekilde kesildi ve exsanguined edildi. Kuzu kafalarını kesim sonrası en fazla 4 saat toplayın.</li>
</ol>3. Kafaların hazırlanması
<ol><li>Kuzunun alın kısmını, numune alanına yaklaşık 100 mL 200 ppm klor dioksit çözeltisi dökerek dezenfekte edin. Başın alın kısmını elektrikli makaslar kullanarak tıraş edin ve alanı 200 mL 200 ppm klor dioksit çözeltisi ile yıkayın.</li>
	<li>Alanı etanol ve mavi rulo ile silin ve numune alanını 35 dakika boyunca epilasyon kremi ile örtün. Bir kazıma aleti kullanarak epilasyon kremini nazikçe kazıyın ve numune alanını değerlendirin. Önemli miktarda saç kalırsa, epilasyon işlemini tekrarlayın.</li>
	<li>Alanı durulamak için 200 mL klor dioksit çözeltisi kullanın ve ardından etanol ile durulayın ve mavi bir rulo ile silin.</li>
	<li>Steril 8 mm biyopsi punch kullanarak, hazırlanan bölgeden 8 mm cilt örneklerini kesin. Steril forseps ve 15 bıçaklı bir neşter kullanarak numuneleri çıkarın ve tüm kutanöz yağların çıkarılmasını sağlayın.</li>
	<li>Numuneleri steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş steril bir 0,5 L kavanoza yerleştirin ve ardından 50 mL 200 ppm klor dioksit çözeltisi içeren steril 50 mL tüplere aktarın, iki kez ters çevirin ve 30 dakika sterilize etmeye bırakın.</li>
	<li>Numuneleri klor dioksit çözeltisinden çıkarın ve 40 mL steril PBS ile doldurulmuş 50 mL'lik bir tüpe yerleştirerek yıkayın. Yıkandıktan sonra, her bir cilt örneğini 24 delikli bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna yerleştirin.</li>
	<li>Numuneyi hava-sıvı arayüzünde tutarken 350 μL önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Ortamın bileşimi aşağıdaki gibidir: MK ortamı (Hanks'in tuzları, L-glutamat ve 1.75 mg / mL sodyum bikarbonat ile Orta 199) ve Ham'ın F12'si, FBS (% 10 v / v), EGF (10 ng / mL), insülin (5 μg / mL), penisilin-streptomisin (100 U / mL) ve amfoterisin B (2.5 μg / mL) eklenmiştir.</li>
	<li>24 delikli plakaları gaz geçirgen bir plaka contası ile kapatın ve nemlendirilmiş% 5 CO 2 doku inkübatöründe24 saate kadar 37 ° C'de inkübe edin.</li>
</ol>4. Cilt örneklerinin bakımı
<ol><li>Kuluçkadan sonra, kültür ortamını çıkarın ve numuneleri 500 μL steril PBS içinde durulayın. Her numuneye antibiyotik içermeyen ortamlar ekleyin ve numunedeki artık antibiyotikleri çıkarmak için nemlendirilmiş% 5 CO2 doku inkübatöründe 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>24 saat sonra antibiyotiksiz ortamda bulanıklık veya mantar enfeksiyonu gelişirse, numuneyi atın.</li>
</ol>5. İnokulumun hazırlanması
<ol><li>10 mL steril triptik soya suyu ile 50 mL'lik bir tüp hazırlayın. Taze bir agar tabağı S. aureus alın ve birkaç koloniyi et suyuna aktarmak için bir çubuk kullanın. 150 rpm'de 37 °C'de 18 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>3 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 10 mL steril PBS içinde yeniden askıya alın. Hücrelerin yeterli şekilde yıkanmasını sağlamak için iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>İnokulumu, steril PBS'de 0,6 OD600'e ayarlayın. Manuel uygulanabilir plaka sayımı yaparak inokulum yükünü onaylayın.</li>
</ol>6. Cilt örneklerinin enfeksiyonu
<ol><li>400 μL önceden ısıtılmış antibiyotik içermeyen ortam içeren taze bir 24 delikli plaka hazırlayın ve steril forseps kullanarak 24 delikli eklere ekleyin.</li>
	<li>Ortamı cilt örneklerinden çıkarın, 500 μL steril PBS ile yıkayın ve yıkamayı çıkarın. Numuneyi yavaşça kuyucuğun dibine tutmak için steril forseps kullanın.</li>
	<li>Merkezi bir yara flebi yapmak için 4 mm'lik bir punch biyopsisi kullanın, 1-2 mm'lik kaba bir derinliğe kadar delin. Daha sonra, yara kapağının üst tabakasını çıkarmak için 15 bıçaklı bir neşter ve steril dişli allis doku forseps kullanın. Yara boyutlarındaki değişkenlik enfeksiyonun sonucunu ve son nokta koloni oluşturan birimleri (CFU) etkileyebilir.</li>
	<li>Tüm numuneler yaralandıktan sonra, steril forseps kullanarak 24 delikli eklere aktarın. Pipet, bakteri inokulunun 15 μL'sini yara yatağına sokar. Daha sonra, nemlendirilmiş% 5 CO 2 doku inkübatöründe 37 ° C'de24 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Daha uzun inkübasyon süreleri gerekiyorsa, ortamı çıkarın ve her 24 saatte bir taze ortamla değiştirin ve aynı koşullarda inkübe edin.</li>
</ol>7. Bakteri yükünün belirlenmesi
<ol><li>Ortamları kuyucukların dibinden çıkarın. Steril forsepslerde, her numuneyi 1 mL steril PBS ile doldurulmuş ayrı bir 50 mL tüpe aktarın.</li>
	<li>Numunenin yüzeyini homojenize etmek için ince uçlu bir homojenizatör kullanın. Yara yatağının homojenizatörün ucu ile doğrudan temas halinde olmasına dikkat edin.</li>
	<li>Her numuneyi orta/yüksek frekansta 35 sn homojenize edin. Homojenizatör, bakteri yükünün numaralandırılmasına izin vermek için bakterileri yara yatağının yüzeyinden ayırır.</li>
	<li>Tüm numuneler işlendikten sonra, pipetlemeden önce sırayla her numuneyi vorteksleyin. Bu, bakteriyel homojenatın karıştırılmasını sağlamak içindir.</li>
	<li>Pipet, 180 μL steril PBS içeren 96 delikli bir plakanın karşılık gelen kuyucuğuna 20 μL vortekslenmiş homojenat.</li>
	<li>Her numune homojenatını 1 x 10−7'ye kadar seri olarak seyreltin ve seyreltilmiş homojenatın 10 μL'lik pipetini triptik soya agar plakasına üçlü olarak seyreltin.</li>
	<li>Agar plakasını 37 °C'de 18 saat boyunca inkübe edin. Ardından, her örnek için CFU'yu belirlemek üzere koloni sayısını sayın.</li>
</ol>

<ol><li>Claeys, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+application+of+published+risk+factors+for+methicillin-resistant+S.+aureus+in+acute+bacterial+skin+and+skin+structure+infections%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).</li>
<li>Rahim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+contribution+in+chronicity+of+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Bacterial contribution in chronicity of wounds.</a> Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).</li>
<li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costs+and+outcomes+in+evaluating+management+of+unhealed+surgical+wounds+in+the+community+in+clinical+practice+in+the+UK%3A+A+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study.</a> BMJ Open. 8 (12), 022591(2018).</li>
<li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+A+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li>
<li>Wilcox, M. H., Dryden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+epidemiology+of+healthcare-acquired+bacterial+infections%3A+Focus+on+complicated+skin+and+skin+structure+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).</li>
<li>Han, G., Ceilley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wound+healing%3A+A+review+of+current+management+and+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chronic wound healing: A review of current management and treatments.</a> Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).</li>
<li>Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+tolerance+and+the+significance+of+persister+cells+in+recalcitrant+chronic+wound+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Dheman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+antibacterial+drug+development+trends+in+the+United+States%2C+1980-2019%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019.</a> Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).</li>
<li>MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tissue-engineered+skin+and+oral+mucosa+for+clinical+and+experimental+use%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+ex+vivo+porcine+skin+explant+model+for+the+assessment+of+mature+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).</li>
<li>Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+skin+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).</li>
<li>Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+murine+model+for+delayed+wound+healing+using+a+biological+wound+dressing+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).</li>
<li>Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+human+tissues+for+research%3A+What+investigators+need+to+know%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+to+Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">The use of human tissues for research: What investigators need to know.</a> Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).</li>
<li>Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+human+skin+model+for+studying+skin+barrier+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair.</a> Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).</li>
<li>Torres, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+murine+skin+model+for+B.+burgdorferi+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm.</a> Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).</li>
<li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+wound+healing+in+diabetic+%28db%2Fdb%29+mice+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+challenge%3A+A+model+for+the+study+of+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds.</a> Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).</li>
<li>Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+biofilms+impair+wound+healing+by+delaying+reepithelialization+in+a+murine+cutaneous+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).</li>
<li>Trøstrup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB%2Fc+mice+in+a+novel+chronic+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li>
<li>Thompson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+gallium+citrate+formulations+against+a+multidrug-resistant+strain+of+Klebsiella+pneumoniae+in+a+murine+wound+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).</li>
<li>Maboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+skin+explant+model+to+study+anaerobic+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404(2017).</li>
<li>Macneil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+opportunities+for+tissue-engineered+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progress and opportunities for tissue-engineered skin.</a> Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).</li>
<li>Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+preclinical+antibacterial+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The global preclinical antibacterial pipeline.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).</li>
<li>Miethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+sustainable+discovery+and+development+of+new+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics.</a> Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).</li>
<li>Guedes, G. M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+situ+model+of+biofilm-associated+wounds%3A+Providing+a+host-like+environment+for+the+study+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).</li>
<li>Johnson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmenting+the+activity+of+chlorhexidine+for+decolonization+of+Candida+auris+from+porcine+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin.</a> Journal of Fungi. 7 (10), 804(2021).</li>
<li>Horton, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+auris+Forms+High-Burden+Biofilms+in+Skin+Niche+Conditions+and+on+Porcine+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin.</a> mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).</li>
<li>Ashrafi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+biofilm+formation+on+human+skin+wound+models+and+demonstration+of+clinically+translatable+bacteria-specific+volatile+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures.</a> Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).</li>
<li>Brackman, G., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+biofilm+wound+models+and+their+application%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo biofilm wound models and their application.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).</li>
<li>Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRumbaugh%2C+KP+%22Biofilm+Infections%22">Biofilm Infections</a>. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).</li>
<li>Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sheep+model+to+investigate+the+role+of+fungal+biofilms+in+sinusitis%3A+Fungal+and+bacterial+synergy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Forum+of+Allergy+%26+Rhinology%22%5BJournal%5D)">A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy.</a> International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).</li>
<li>Williams, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+of+biofilm+implant-related+osteomyelitis+to+test+combination+biomaterials+using+biofilms+as+initial+inocula%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).</li>
<li>Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+sheep+models%3A+From+asthma+to+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines.</a> Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).</li>
<li>Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+replacement+skin%3A+The+crossroads+of+biomaterials%2C+wound+healing%2C+embryonic+development%2C+stem+cells+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration.</a> Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).</li>
<li>Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogenous+skin+fibroblast+transplantation+enhances+excisional+wound+healing+following+alloxan+diabetes+in+sheep%2C+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial.</a> International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).</li>
<li>Martinello, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+mesenchymal+stem+cells+improve+the+wound+healing+process+of+sheep+skin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Roberts, C. D., Windsor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+pain+management+solutions+in+animals+may+provide+improved+wound+pain+reduction+during+debridement+in+humans%3A+An+opinion+informed+by+veterinary+literature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature.</a> International Wound Journal. 16 (4), 968(2019).</li>
<li>Mazzone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+and+in+utero+transplantation+of+fetal+skin+in+the+sheep+model%3A+A+crucial+step+towards+clinical+application+in+human+fetal+spina+bifida+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).</li>
<li>Olkowska, E., Gržinić, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909(2022).</li>
<li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Antimikrobiyallerin geliştirilmesi, yaklaşık 1 milyar dolara mal olduğu ve tamamlanması yaklaşık 15 yıl sürdüğü tahmin edilen önemli ama pahalı bir girişimdir. Antimikrobiyal ilaç keşfinin ve antimikrobiyal ilaç etkinliğinin klinik öncesi çalışmalarının% 90'ından fazlası, akademik araştırmacılar ve tipik olarak 50'den az çalışanı olan küçük ve orta ölçekli şirketler tarafından yürütülmektedir22. Bu ekipler finansal olarak çok kısıtlıdır, bu da translasyonel araştırmanın sonraki aşamalarında kurşun...

Cilt enfeksiyonları, dünyadaki sağlık hizmeti sağlayıcılarına büyük ekonomik maliyetler getiren önemli bir küresel sorundur. Patojenler tarafından çoklu ilaç direncinin ve biyofilm oluşumunun gelişmesi, iyileşmeyen yaraların prevalansında kilit rol oynar 1,2,3,4. Bunun bir sonucu olarak, cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları, uzun süreli hastanede yatış ve ardından yeniden kabul için daha yaygın nedenlerden biridir5. Yara iyileşmesindeki gecikmeler hem hasta hem de sağlık hizmeti sağlayıcıları için maliyetlidir ve bazı tahminler ABD'de yılda yaklaşık 6,5 milyon hastanın etkilendiğini göstermektedir. İngiltere'de, cilt enfeksiyonları ve ilişkili komplikasyonlar yılda yaklaşık 75.000 ölümle sonuçlanmaktadır 2.4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) sıklıkla hasta yaralarından izole edilen zorlu bir yara patojenidir 2,7. Çoklu ilaç direncinin ortaya çıkma oranı 2000'li yıllarda büyük ölçüde artmıştır. Bu süre zarfında, akut bakteriyel deri ve cilt yapısı enfeksiyonlarının yaklaşık% 60'ı, metisiline dirençli S. aureus1 için kültür pozitifti. Son 2 on yılda Stafilokoklar ve aslında diğer patojenler arasında çoklu ilaca dirençli suşların sayısının artması, direncin üstesinden gelebilecek yeni etki biçimlerine sahip antibiyotiklerin hızlı bir şekilde geliştirilmesine acil bir ihtiyaç olduğunu göstermektedir.
Bununla birlikte, 2000'li yılların başından bu yana, antibiyotik keşif programlarına daha uzun gelişim süreleri ve düşük başarı oranları hakim olmuştur ve ABD'deki klinik çalışmalara giren yeni antibiyotiklerin sadece% 17'si pazar onayını almıştır8. Bu, ortaya çıkan antibiyotiklerin in vitro testlerinden elde edilen sonuçlar ile klinik sonuçları arasında bir eşitsizlik olduğunu göstermektedir. Bu eşitsizliğin büyük ölçüde in vivo enfeksiyonlar sırasında ve in vitro preklinik aşamalarda antibiyotiklerin etkinliğini test ederken geleneksel mikrobiyolojik yöntemler sırasında bakteriyel fizyolojideki farklılıklardan kaynaklandığı iddia edilebilir. Bu nedenle, antibiyotik keşif programlarındaki başarı oranlarını artırmak için enfeksiyon sırasında bakteriyel fizyolojiyi daha iyi temsil eden yeni laboratuvar yöntemlerine ihtiyaç vardır.
Cilt enfeksiyonlarını incelemek için mevcut yöntemler arasında canlı hayvanlar (örneğin, fareler), ex vivo cilt modelleri (örneğin, domuz) ve 3D doku mühendisliği cilt modelleri (örneğin, insan) 9,10,11,12 üzerinde yapılan çalışmalar bulunmaktadır. Canlı hayvanlardaki çalışmalar sıkı bir şekilde düzenlenir ve nispeten düşük verime sahiptir. Hayvan modellerinde, yaralanma ve enfeksiyon hayvanlar için önemli sıkıntılara neden olur ve etik kaygıları gündeme getirir. Ex-vivo veya doku mühendisliği yapılmış insan derisi modelleri, etik onay, yerel ve küresel mevzuata (İnsan Dokusu Yasası, Helsinki Deklarasyonu) uygunluk gerektirir ve bazı taleplerin yerine getirilmesi yıllar süren dokuların elde edilmesinde zorluklar vardır.13,14. Her iki model türü de emek yoğundur ve deneysel başarıyı sağlamak için önemli uzmanlık gerektirir. Bazı mevcut ex vivo cilt enfeksiyonu modelleri, enfeksiyonu sağlamak için yara yatağı için önceden aşılanmış diskler ve katkı maddeleri gerektirir; Bu modeller inanılmaz derecede yararlı olsa da, katkı maddeleri yara yatağının besin kaynağı olarak kullanımını sınırladığı için enfeksiyon sürecinde sınırlamalar vardır10,15,16,17. Bu çalışmada açıklanan model, yara yatağına hiçbir katkı maddesi kullanmamakta, bu da enfeksiyon patolojisinin ve canlı hücre sayımlarının, yara yatağının tek besin kaynağı olarak doğrudan kullanılmasının bir sonucu olmasını sağlamaktadır.
Yeni laboratuvar yöntemlerine duyulan ihtiyaç göz önüne alındığında, ortaya çıkan antibiyotiklerin etkinliğini değerlendirmede kullanılmak üzere cilt enfeksiyonlarının yeni bir yüksek verimli ex vivo küçükbaş modeli geliştirilmiştir. Cilt enfeksiyonu çalışmaları birçok zorlukla karşı karşıyadır: yüksek maliyetler, etik kaygılar ve tam bir resim göstermeyen modeller20,21. Ex vivo modeller ve 3D eksplant modelleri, hastalık sürecinin daha iyi görselleştirilmesini sağlar ve etki tedavileri klinik olarak daha alakalı bir modelden sahip olabilir. Burada, basit, tekrarlanabilir ve klinik olarak alakalı ve yüksek verime sahip yeni bir küçükbaş hayvan cilt modelinin kurulumu açıklanmaktadır. Koyun, in vivo enfeksiyonlara verilen yanıtları modellemek için yaygın olarak kullanılan büyük memelilerden biri olduğu için küçükbaş hayvan derisi seçilmiştir. Dahası, mezbahalardan kolayca temin edilebilirler, araştırma için sürekli bir cilt kaynağı sağlarlar ve karkasları haşlanmaz, bu da iyi doku kalitesi sağlar. Bu çalışmada örnek patojen olarak S. aureus kullanılmıştır; ancak, model diğer mikroorganizmalarla iyi çalışır.

<table><tbody><tr><td>24 Kuyu Eşlik Plakası</td><td>SLS&nbsp;</td><td></td><td></td>353504</tr><tr><td>4 mm Biyopsi Punch</td><td>Williams Medical</td><td>D7484</td><td></td></tr><tr><td>50 ml santrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10788561</tr><tr><td>8 mm Biyopsi Punch</td><td>Williams Medical</td><td>D7488</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B solüsyonu, steril</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Colour Pro Style Kablosuz Saç Kesme Makinesi</td><td>Wahl</td><td>9639-2117X</td><td>Saç Kesme</td></tr> Makinesi <tr><td>Çift Fırın İnkübatörü</td><td>SLS</td><td>OVe1020</td><td>Sterilizasyon fırını</td></tr><tr><td>Epidermal büyüme faktörü ve nbsp;</td><td>SLS</td><td>E5036-200UG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Honeywell</td><td>458600-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>F12 HAM</td><td>Sigma</td><td>N4888</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Labtech International</td><td>CA-115/500</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>15307805</td><td></td></tr><tr><td>Tüy Dökücü Krem</td><td>Veet</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i</td><td>Thermo Scientific</td><td>15373212&nbsp;</td><td>Doku kültürü inkübatörü</td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R</td><td>VWR</td><td>521-2242</td><td>Santrifüj</td></tr><tr><td>Homojenizatör 220, El Tipi</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575809</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör 220, plastik karıştırma konileri</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15585819</tr><tr><td>Bireysel 24 kuyulu 0.4um membran</td><td>VWR International</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Insülin, rekombinant İnsan</td><td>SLS</td><td>91077C-1G</td><td></td></tr><tr><td>Orta 199 (MK ortamı)</td> <td>Sigma</td><td>M0393</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka, hücre kültürü Costar 96 kuyulu</td><td>Fisher Scientific</td><td>10687551</td><td></td></tr><tr><td>Multitron</td><td>Infors</td><td>Uygulanamaz</td><td>Bakteriyel kuluçka makinesi</td></tr><tr><td>PBS tabletleri</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>SLS&nbsp;</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Plaka contaları</td><td>Fisher Scientific</td><td>ESI-B-100</td><td></td></tr><tr><td>Güvenli 2020</td><td>Fisher Scientific</td><td>1284804</td><td>Sınıf II mikrobiyoloji güvenlik kabini</td></tr><tr><td>Neşter bıçağı numarası 15</td><td>Fisher Scientific</td><td>O305</td><td></td></tr><tr><td>Neşter Swann</td><td>Morton Fisher Scientific</td><td>11849002</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dişli Allis Doku Forseps</td><td>Rocialle</td><td>RSPU500-322</td><td></td></tr><tr><td>Triptik Soya Agar</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>14432-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Triptik Soya Suyu</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>41298-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Vimoba Tabletler</td><td>Quip Labs</td><td>VMTAB75BX</td><td></td></tr></tbody></table>

ortaya Çıkan antibiyotikleri test etmek için yeni bir yüksek verimli ex vivo küçükbaş hayvan cilt yara modeli

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

Antimikrobiyallerin geliştirilmesi, giderek daha düşük başarı oranlarına sahip pahalı bir süreçtir ve bu da antimikrobiyal keşif araştırmalarına daha fazla yatırım yapmayı daha az çekici hale getirmektedir. Antimikrobiyal ilaç keşfi ve müteakip ticarileştirme, araştırmacıların ilaç tasarımı ve formülasyonu üzerinde daha fazla kontrole sahip oldukları kurşun optimizasyon aşamalarında hızlı ve başarısız ucuz bir yaklaşım uygulanabilirse daha kazançlı hale getirilebilir. Bu makalede, Staphylococcus aureus ile enfekte olmuş bir ex vivo ovine yaralı cilt modelinin kurulumu basit, uygun maliyetli, yüksek verim ve tekrarlanabilir olan açıklanmaktadır. Modeldeki bakteriyel fizyoloji, enfeksiyon sırasında bakteriyel proliferasyon olarak patojenin dokuya zarar verme yeteneğine bağlı olduğunu taklit eder. Yara enfeksiyonunun oluşumu, inoküluma kıyasla canlı bakteri sayımlarında bir artış ile doğrulanır. Bu model, kurşun optimizasyonu aşamasında ortaya çıkan antimikrobiyallerin etkinliğini test etmek için bir platform olarak kullanılabilir. Bu modelin mevcudiyetinin, antimikrobiyaller geliştiren araştırmacılara, sonraki hayvan denemelerinde başarı oranlarını artırmaya yardımcı olacak hızlı ve başarısız ucuz bir model sağlayacağı iddia edilebilir. Model aynı zamanda araştırma için hayvan kullanımının azaltılmasını ve iyileştirilmesini kolaylaştıracak ve sonuçta cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları için yeni antimikrobiyallerin kliniğe daha hızlı ve daha uygun maliyetli bir şekilde çevrilmesini sağlayacaktır.

Yara enfeksiyonu modelini kurmadan önce cildi sterilize etmek için bir yolun belirlenmesi zordu. Buradaki zorluk, farklı cilt katmanlarına zarar vermeden cildi sterilize etmekte yatıyordu, bu da enfeksiyonun sonucunda istenmeyen sonuçlara yol açabilir. Uygun bir sterilizasyon rejimini tanımlamak için, Tablo 1'de belirtildiği gibi, farklı süreler boyunca farklı tedaviler denenmiştir. Kontaminasyon, cilt örneklerini korumak için kullanılan MK ortamında 48 saat sonra bulanıklık gelişimi olarak kaydedildi. D...

Protokol, Staphylococcus aureus ile enfekte olmuş bir ex vivo küçükbaş yaralı cilt modeli oluşturmak için adım adım bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yüksek verimli model, geleneksel mikrobiyoloji tekniklerine kıyasla enfeksiyonları in vivo olarak daha iyi simüle eder ve araştırmacılara ortaya çıkan antimikrobiyallerin etkinliğini test etmek için fizyolojik olarak ilgili bir platform sunar.

Ortaya Çıkan Antibiyotikleri Test Etmek için Yeni Bir Yüksek Verimli Ex Vivo Küçükbaş Hayvan Cilt Yara Modeli

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Bu model, kritik klinik öncesi aşamalardaki araştırmacıların yeni formülasyonların antimikrobiyal etkinliğini daha doğru bir şekilde belirlemelerini sağlayacak ve araştırmacılara ilaç tasarımı ve formülasyonu üzerinde daha fazla kontrol sağlayacaktır. Bu model, temsili bir yara ortamında hızlı tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Amaç için yetiştirilmiş hayvanlara olan ihtiyacı azaltır ve yara enfeksiyonları için topikal antimikrobiyallerin kliniğe daha hızlı çevrilmesini kolaylaştırır.Başlıca zorluklar kontaminasyon ve el becerisidir. Sıkı bir aseptik teknik ve doku işleme konusunda sabır esastır; Bu yöntemin başarısı için hassas ve amaçlı flep çıkarılması gereklidir. Forsepslerin dezenfeksiyonu ile başlayın, bir saat boyunca 200 santigrat derecede kuru ısı sterilizasyonuna maruz bırakın.Tüm cam eşyaları kullanmadan önce 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklavlayın. Örnek alana yaklaşık 100 mililitre 200 PPM klor dioksit çözeltisi dökerek lambanın alın bölümünü dezenfekte edin. Alın bölümünü elektrikli makaslar kullanarak tıraş edin, ardından 200 mililitre 200 PPM klor dioksit çözeltisi ile yıkayın.Alanı etanol ve mavi bir rulo kullanarak silin ve numune alanını epilasyon kremi ile örtün. 35 dakika sonra, bir kazıma aleti kullanarak epilasyon kremini nazikçe kazıyın ve numune alanını değerlendirin. Önemli miktarda saç kalırsa epilasyon işlemini tekrarlayın.Temiz numune alanını 200 mililitre klor dioksit çözeltisi ve ardından etanol ve mavi bir rulo ile durulayın. Hazırlanan alandan sekiz milimetrelik bir cilt örneğini kesmek için steril sekiz milimetrelik bir biyopsi punch kullanın. Daha sonra steril forseps ve 15 numaralı bıçaklı neşter kullanarak numuneyi çıkarın ve tüm kutanöz yağların alındığından emin olun.Numuneleri steril PBS ile doldurulmuş 0,5 litrelik steril bir kavanoza yerleştirin. Daha sonra bunları 50 mililitre 200 PPM klor dioksit çözeltisi ile doldurulmuş steril 50 mililitrelik tüplere aktarın. Tüpü iki kez ters çevirin ve 30 dakika sterilize etmeye bırakın.Numuneleri 40 mililitre steril PBS ile doldurulmuş 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. PBS yıkamasından sonra, her cilt örneğini 24 delikli bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna yerleştirin. Önceden ısıtılmış ortamın 350 mikrolitresini bir kuyucukta eklerken, numuneyi hava-sıvı arayüzünde tutun.Kuluçka plakasını nemlendirilmiş bir doku inkübatörüne 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede yerleştirmeden önce 24 kuyucuklu plakaları gaz geçirgen bir plaka contası ile kapatın. Kuluçkadan sonra, kültür ortamını çıkarın ve numuneleri 500 mikrolitre steril PBS'de durulayın. Artık antibiyotikleri, 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede antibiyotiksiz ortamlarla tedavi ederek numuneden çıkarın.Antibiyotik içermeyen ortamda bulanıklık veya mantar enfeksiyonu gelişirse, numuneyi atın. Daha sonra, 10 mililitre steril Triptik Soya Suyu ile 50 mililitrelik bir tüp hazırlayın. Daha sonra birkaç Staphylococcus aureus kolonisini taze bir agar S.aureus plakasından et suyuna aktarın ve tüpü 18 saat boyunca 37 santigrat derece ve 150 RPM'de inkübe edin.Tüpleri üç dakika boyunca 4.000 G'de santrifüj ettikten sonra, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 10 mililitre steril PBS'de yeniden askıya alın. Steril PBS kullanarak inokülumu 600 nanometre dalga boylarında 0.6 optik yoğunluğa ayarlamadan önce PBS yıkamasını iki kez tekrarlayın. İnokulum yükünü manuel uygulanabilir bir plaka sayımı ile onaylayın.Cilt örneğini enfekte etmek için, 400 mikrolitre önceden ısıtılmış antibiyotik içermeyen ortam içeren taze bir 24 delikli plaka hazırlayın ve steril forseps kullanarak 24 kuyucuklu ekleri ekleyin. Ortamı cilt örneklerinden çıkarın. 500 mikrolitre steril PBS ile yıkayın ve yıkamayı çıkarın.Numuneyi yavaşça kuyucuğun dibine tutmak için steril forseps kullanın. Cilt örneğini bir ila iki milimetrelik kaba bir derinliğe delmek ve merkezi bir yara kapağı yapmak için dört milimetrelik bir punch biyopsisi kullanın. Daha sonra yara kapağının üst tabakasını çıkarmak için 15 numaralı bıçaklı neşter ve steril dişli Allis doku forseps kullanın.Tüm numuneler yaralandıktan sonra, steril forseps kullanarak bunları 24 kuyu ekine aktarın. Pipet, nemlendirilmiş bir doku inkübatöründe 37 santigrat derecede 24 saat kuluçkaya yatmadan önce yara yatağına 15 mikrolitre bakteri inokülumu. Daha uzun inkübasyon süreleri için, ortamı çıkarın, her 24 saatte bir taze ortamla değiştirin ve plakaları aynı koşullar altında inkübe edin.Bakteri yükünü belirlemek için, ortamı kuyucukların dibinden çıkarın. Steril forseps kullanarak, her numuneyi bir mililitre steril PBS ile doldurulmuş ayrı bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Daha sonra, numune yüzeyini ince uçlu bir homojenizatör ile homojenize ederek bakterileri yara yatağının yüzeyinden ayırın.Yara yatağının homojenizatörün ucu ile doğrudan temas halinde olduğundan emin olun. Tüm numuneler işlendikten sonra, 20 mikrolitre homojenatı 180 mikrolitre steril PBS içeren 96 delikli bir plakanın ilgili kuyucuğuna aktarmadan önce her numuneyi vorteksleyin. Her numune homojenatını 1 kat 10'dan negatif 7'ye kadar seri olarak seyreltin ve seyreltilmiş homojenatın 10 mikrolitresini üçlü olarak bir Triptik Soya Agar plakasına pipetle seyreltin.Triptik Soya Agar plakasını 37 santigrat derecede inkübe edin ve 18 saat sonra, her örnek için koloni oluşturan birimleri veya CFU'yu belirlemek için koloni sayısını sayın. Farklı süreler boyunca farklı tedaviler kullanılarak uygun bir cilt sterilizasyon rejimi tanımlandı. Doku bütünlüğü histoloji ile izlendi, ardından tedaviden hemen sonra hematoksilin ve eozin ile boyandı.Klor dioksit ile 30 dakikalık bir tedavi, doku bütünlüğünü korurken cilt dokusunu tekrar sterilize ederek en etkili tedaviydi. Yara yatağında beyaz bir film, enfeksiyondan 48 saat sonra dokuda belirgindi. Çizik modeli 24 saat sonra daha yüksek bir ortalama CFU sayısına sahip olmasına rağmen, flep çıkarma yaralama tekniği daha tutarlı sonuçlar verdi.48 saat sonra, yaralı dokudan inoküluma kıyasla yaklaşık 100 kat daha fazla bakteriyel CFU geri kazanıldı ve bu da başarılı bir enfeksiyonu gösterdi. Enfekte olmuş dokunun gram lekeli histoloji bölümleri, enfekte olmamış doku bölümlerinde bulunmayan yara yatağında S.aureus hücrelerinin varlığını gösterdi. Bu prosedürü takiben, doku yanıtını incelemek için immünohistokimya, bakteriyel lokalizasyonu görselleştirmek için modifiye gram boyası ve antimikrobiyal etkinliği test etmek için antimikrobiyal maruziyetten sonra uygulanabilir plaka sayıları gerçekleştirilebilir.Yeni antimikrobiyaller geliştiren araştırmacılar için bu model, kurşun optimizasyonunun daha fazla kontrolünü sağlayacak, pahalı ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş hayvan denemelerine olan bağımlılığı azaltacak ve antimikrobiyallerin kliniğe hızlı bir şekilde çevrilmesini sağlayacaktır.

a-novel-high-throughput-ex-vivo-ovine-skin-wound-model-for-testing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: de Vries, C. R. , et.al. Kronik Pseudomonas aeruginosa yara enfeksiyonunun gecikmiş aşılama modeli. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, parlak bir film pansı ile kaplı iki tam kalınlıkta dorsal deri yarası taşıyan bir fareye parlayan Pseudomonas aeruginosa'nın gecikmeli aşılanmasını gösteriyor. Bu, biyofilm oluşumunu ve kronik enfeksiyonun oluşmasını kolaylaştırır. Düzenli biyolüminesans izleme, bakteri yükünün nicelendirilmesini ve enfeksiyon ilerlemesinin zamanla izlenmesini sağlar.

Kronik Pseudomonas aeruginosa cilt yarası enfeksiyonunun fare modeli geliştirilmesi 

Bu videoda, domuz gözünden diseke edilen bir korneoskleral düğme kullanarak bakteriyel keratit için bir ex vivo model oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Aşılanmış bakteriler, altta yatan stromayı istila etmek ve in vivo enfeksiyonu taklit eden kornea dokuları içinde bir enfeksiyon oluşturmak için kornea epitel insizyonlarını geçer.

Domuz Ex vivo Kornea Bakteriyel Keratit Modeli: Kornea Epitel Hücrelerinde Bakteriyel Enfeksiyon Oluşturma Tekniği

Bu videoda, cilt yarası enfeksiyonunun bir fare modeli oluşturmak için bir teknik gösterilmektedir. Nötrofillerde bir floresan proteini eksprese etmek için tasarlanmış fareleri, patojenik bir bakteri olan genetik olarak değiştirilmiş bir biyolüminesan Staphylococcus aureus ile enfekte ettikten sonra. Enfeksiyon bölgesindeki bakteri yükü ve nötrofil alım dinamikleri, tüm hayvan görüntülemesi kullanılarak incelenebilir.

Bakteriyel Bir Patojene Karşı Bağışıklık Tepkisini İncelemek için Bir Murin Deri Yarası Enfeksiyonu Modeli

Video, Staphylococcus aureus ile enfekte olmuş bir ex vivo küçükbaş hayvan derisi modelinin oluşumunu göstermektedir. Bu, bir kuzunun alın derisi biyopsi bölümünün antibiyotiklerle tedavi edilmesini, bir yara yatağı oluşturulmasını, antibiyotik içermeyen bir ortamla çok kuyulu bir plakada geçirgen bir zar üzerine yerleştirilmesini ve cilt yarasında bakteriyel enfeksiyon oluşturulmasını gerektirir.

Bakteriyel Patojen ile Enfekte Ex Vivo Küçükbaş Hayvan Yaralı Cilt Modelinin Oluşturulması

Burada gerçek zamanlı, non-invaziv, kollarındaki Pseudomonas aeruginosabiyofilm yara enfeksiyonları izleme için tüysüz fareler kullanan bir roman diyabetik fare modeli açıklar. Bu yöntem diğer bakteri ve genetiği değiştirilmiş mikroorganizmalar, çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere enfeksiyon değerlendirmek ve antibiofilm stratejileri etkinliğini test etmek için adapte edilebilir.

Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların

Eski bir protokol vivo kornea organ kültür model çalışmaları şifa yara açıklanan için yararlı. Bu modeli sistem rejeneratif iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ajanlar veya ilaç toksisitesi organize 3D çok hücreli ortamında etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları

Burada, biri hücresel ve sitokin yara iyileştirici yanıtlarını değerlendirmek, diğeri ise yara kapatma oranını ölçmek için tasarlanmış iki murine yara iyileşmesi modeli tanımlanmıştır. Bu yöntemler, kötü yara iyileşmesiçeşitli yönlerini mekanizmaları belirlemek için diyabet gibi karmaşık hastalık modelleri ile kullanılabilir.

Dorsal Subkutan Polivinil Alkol Sünger İmplantasyonu ve Eksizyonal Kuyruk Deri Yara Modelleri kullanılarak Akut Yara İyileşmesinin Değerlendirilmesi.

Bu makalede, bakteriyel keratitin ex vivo porcine modelini kurmak için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Pseudomonas aeruginosa prototipik bir organizma olarak kullanılır. Bu yenilikçi model in vivo enfeksiyonu taklit eder, çünkü bakteri çoğalması bakterinin kornea dokusuna zarar verme yeteneğine bağlıdır.

Bakteriyel Keratite Karşı İlaç Tedavilerini İncelemek İçin Porcine Ex Vivo Kornea Modeli Kurulması

Burada, ex vivo insan derisini kullanarak yara onarımını değerlendirmek için optimize edilmiş bir teknik ve tam montajlı bir boyama yaklaşımı sergiliyoruz. Bu metodoloji, potansiyel yara tedavilerinin değerlendirilmesi için klinik öncesi bir platform sağlar.

Cilt Onarımını Doğru Değerlendirmek için İnsan Ex vivo Yara Modeli ve Tam Montajlı Boyama Yaklaşımı

Antibiyotiklere dirençli kronik yaralar sağlık sistemi için büyük bir tehdittir. Biyofilm enfeksiyonları inatçı ve düşmancadır ve fonksiyonel yara kapanmasının yetersiz olmasına neden olabilir. Biyofilm ile enfekte tam kat kronik yaraların klinik olarak anlamlı bir domuz modelini sunuyoruz. Bu model, mekanik çalışmalar için olduğu kadar müdahaleleri test etmek için de güçlüdür.

Biyofilm Enfeksiyonu ve Görünmez Yaraların Domuz Modeli

405 nm mavi ışık LED cihazı, kolajen bazlı sentetik cilt modelinde değerlendirildiğinde geniş bir yara patojenlerine karşı antimikrobiyal etkinlik göstermektedir. Bu basitleştirilmiş in vitro yaklaşım, ışık temelli antimikrobiyal tedavilerin erken aşama değerlendirmesi için tekrarlanabilir ve etik açıdan uygulanabilir bir alternatif sunar.

Kolajen Bazlı Sentetik Cilt Modeli Kullanarak Yara Patojenlerini Bastırmak İçin Mavi Tışık LED Cihazının Araştırılması

Keşfedin, Staphylococcus aureus ile enfekte edilmiş ex vivo koyun derisi yara modeli kurulumunu. Bu yöntem, yeni antimikrobiyallerin etkinliğini test etmek için geleneksel tekniklere göre daha fizyolojik olarak uygun bir platform sağlar.

Ortaya Çıkan Antibiyotikleri Test Etmek için Yeni Bir Yüksek Verimli Ex Vivo Küçükbaş Hayvan Cilt Yara Modeli

Daha fazla video keşfet