Fizyolojik Koşullar Altında Alfa-Sinüklein Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Milisaniye Hidrojen / Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi

Tüm organizmaların proteomlarında bozukluk vardır,% 33'e kadar tahmin edilmektedirBu bölgeler hidrojen / döteryum değişim kütle spektrometrisi ile gözlemlenebilir, ancak sadece milisaniye zaman aralığında. Protokolümüz size bunu nasıl başarılı bir şekilde yapacağınızı gösterecektir. Bu tam otomatik bir analitik tekniktir.

Sadece her şeyi ayarlarsınız, istediğiniz zaman ölçümlerini programlayın, git ve uzaklaşın. Bu teknik, alfa-sinüklein gibi özünde düzensiz proteinlerin spesifik onaylarını stabilize eden bileşiklerin taranması için heyecan verici bir fırsat sunar. Peptit haritalaması için numune hazırlamaya başlamak için, önce eksi 80 santigrat derece dondurucudan depolanmış alfa-sinüklein protein stoğundan bir şişe alın.

Çözüldükten sonra, 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin. Daha sonra, Beer-Lambert yasasını kullanarak protein konsantrasyonunu belirlemek için çözeltinin 218 nanometredeki emiciliğini ölçün ve proteini denge tamponu ile beş mikromolar'lık son konsantrasyona kadar seyreltin. Daha sonra, otomatik örnekleme robotunu kurmak için, toplam geri kazanım şişesine beş mikromolar protein çözeltisinden 50 mikrolitre ekleyin ve şişeyi, kütle spektrometresine uygun olarak hidrojen / döteryum değişiminin veya HDX, robotiğin sağ odasındaki numune konumuna yerleştirin.

Daha sonra, sol odaların bir, dört ve beş reaktif pozisyonuna bir şişe denge tamponu ve iki şişe pepsin yıkama tamponu ve HDX sağ haznesinde bir reaktif pozisyonuna bir şişe söndürme tamponu koyun ve Peltier sıcaklık kontrol cihazını kullanarak sıcaklığı 20 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, sırasıyla HDX sol haznesinin ve HDX sağ haznesinin aynı reaksiyon pozisyonlarına eşit sayıda toplam geri kazanım şişesi ve maksimum geri kazanım şişesi ekleyin. Ardından, zamanlama yazılımında uygun LC ve MS yöntemleriyle bir örnek liste oluşturun ve zamanlamayı başlatın.

Son peptid kapsama haritasını elde etmek için DynamX HDX veri analizi yazılımında izotopik atamaları manuel olarak düzenleyin. Fast HDX prototip cihazını temizledikten sonra, sistemi başlatmak için uyumlu HDX yazılımının grafik kullanıcı arabirimini açın. Numune odası ve söndürme odası sıcaklıkları olarak sırasıyla 20 santigrat derece ve 0,5 santigrat derece girin, ardından yeni sıcaklıkları uygulamak için ayarlanan tıklamayı tıklayın.

Cihazı temizlemek ve hazırlamak için santrifüj tüplerini tüm girişlerde LC/MS sınıfı suyla ayarlayın, ardından titratör sıhhi tesisat dağıtım sekmesinde hem sol hem de sağ şırıngaları kontrol edin ve tüplerdeki tüm gizli hava kabarcıkları gidene kadar prime tıklamaya devam edin. Şırıngalar için tüm kutuları işaretlemek için, önce makrolar sekmesine gidin ve şırıngaların ev konumunu kalibre et'e tıklayın, ardından önce şırınga yük döngüsünü yıka, ardından tüm karıştırma döngüsü hacimlerini yıka. Bir tampon şırıngada herhangi bir kabarcık varsa, şırıngayı ayırın ve kabarcığı dikey olarak çıkararak gazını çözün.

Sıfır konumuna yeniden kalibre etmeden önce, şırıngayı değiştirin. HDX deneyleri için Hızlı HDX prototip cihazını ayarlamak üzere önce sol titrasyon giriş tüpünü toplam geri kazanım şişesine takın. Sıcaklığa bağlı oligomerizasyonu ve kümelenmeyi önlemek için, tüpü bir masa üstü buzdolabına yerleştirin.

Daha sonra, cihazın sağ ve sol odalarındaki ilgili tampon girişlerine 50 mililitre denge, etiketleme, söndürme ve pepsin yıkama tamponları ekleyin, ardından pepsin yıkama girişine 50 mililitre kolon yıkama tamponu ekleyin. Protein ve kolon yıkama hatlarını astarlamak için, titratör sıhhi tesisat dağıtım sekmesindeki sağ ve sol şırıngaları kontrol edin ve bir kez astar'a tıklayın. Daha önce gösterildiği gibi şırıngalar için tüm kutuları işaretledikten sonra, gerekli ayarları girmek için manuel söndürme akışı sekmesine gidin.

Bir zaman kursu denemesinde, süreleri milisaniye cinsinden girmek için sembolik nokta düğmesini kullanın. Ardından tuzak süresini üçe ayarlayın ve HPLC'nin tuzak süresini artı çalışma süresini artı 1,5 dakika olarak bekleyin. Örnek çalıştırmalar arasında boş denemeler çalıştırılırsa, her örnek çalıştırmadan sonra boş çalıştırma için alma yazılımında bir girdi sağladıktan sonra boş çalıştır kutusuna tıklayın.

Örnek liste hazır olduğunda ve uygun girişler vurgulandığında, yazılımda oynat ve Hızlı HDX'e tıklayarak çalıştırmayı başlatın. Veri işleme için, peptid haritalama deneylerinden spektral olarak atanmış peptitler dosyasının dosya menüsünü açın ve DynamX yazılımında aç'a tıklayın, ardından ham dosyaları DynamX yazılımına aktarın. Veri menüsünü açtıktan sonra, MS Files'a tıklayın.

İncelenen her protein koşulu için durumlar oluşturmak üzere, yeni duruma tıklayın. Her HDX zaman noktasını eklemek için yeni pozlama'yı ve ardından yeni raw'u tıklayın. Ham dosyaları içe aktarmak için, her dosyayı doğru konuma sürükleyin ve bittiğinde Tamam'ı tıklatın.

İzotopları otomatik olarak atadıktan sonra, yüksek veri kalitesi sağlamak için izotopik atamayı manuel olarak düzenleyin. Küme verilerini, makalede açıklandığı gibi sütun sırasına göre csv dosyasında dışa aktarın. Kütle ölçüm yazılımındaki veri menüsünü açın ve küme verilerini dışa aktar'a tıklayın.

Veri analizi için, önce dışa aktarılan kümelenmiş verileri HDX analiz yazılımı HDfleX'e yükleyin. Tüm deneyler ve durumlar için deneysel verileri sığdırmak üzere, HDX reaksiyonu için gözlemlenen hız sabitlerini elde etmek üzere uygun geri değişim düzeltme yöntemlerini seçin. Ardından, HDfleX'te tercih edilen bir yöntemi kullanarak küresel bir anlamlılık eşiği hesaplayın ve karşılaştırılan eyaletler arasındaki önemli farklılıkları belirlemek için hibrit anlamlılık testi gerçekleştirin.

Alfa-sinüklein üzerindeki haritalama deneyi, protein dizisinin% 100'ünü kapsayan ve ortalama 3.79 fazlalık ile bir peptid kapsama haritası oluşturdu. Dahası, bu protokol, alfa-sinükleinin farklı peptitleri için döteryum alım eğrilerinin üretilmesini sağladı ve bunlar daha sonra takılı ve geri değişim düzeltilmiş grafikler olarak ifade edildi. Alfa-sinükleindeki hidrojen / döteryum değişiminin çoğunun bir saniye içinde yapıldığı açıktı.

Alfa-sinükleinin A ve B durumları arasındaki konformasyonel fark, hem peptit hem de amino asit seviyelerinde B durumu tarafından daha yüksek döteryum alımından da belirgindi. Böyle hassas bir teknik için, verileri karşılaştırırken sağlam istatistiksel anlamlılık testleri kullanmak önemlidir. Burada yazılımımız HDfleX'i kullandık.