Name: Monosit-Makrofaj Soy Hücrelerinin Sıçan Kemiklerinden İkincil Aderans Yöntemi ile İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 19 s
Description: Keşfedin: Sıçan kemik iliğinden ikincil aderans yöntemiyle monosit-makrofaj hücrelerinin izolasyonu. Bu teknik, osteoklast farklılaşması ve osteoporoz araştırmaları için güvenilir bir hücre modeli sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe no. LY19H060001) ve Zhejiang Geleneksel Çin Tıbbı Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (no. 2022ZB093).

Bu çalışmadaki tüm deneyler, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Araştırma Merkezi'nin hayvan deneyi kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Onay No: IACUC-20181029-11).
1. Hücre ekstraksiyonu
<ol><li>Sprague-Dawley sıçanlarını (SD sıçanları, 1-10 günlük, erkek veya dişi) CO2 ile dolu ötenazi kafeslerine% 30-70 konteyner hacmi / dakika arasında dengeli bir oranda koyun. Sıçanlar bilincini kaybettikten sonra (20-60 dakika), ağrısız bir ölüm sağlamak için sıçanı servikal çıkık ile ötenazi yapın.</li>
	<li>Sıçanları dezenfeksiyon için 10 dakika boyunca% 75 alkole batırın.</li>
	<li>Sıçanın tüm uzuvlarını makas ve forseps ile dikkatlice çıkarın, bir pipet kullanarak PBS ile aspire edin ve uzuvlara yapışan kanı temizleyin.</li>
	<li>500 mL DMEM'e 5 mL penisilin / streptomisin çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. 50 mL'lik steril bir santrifüj tüpü alın, 5 mL FBS ve 45 mL DMEM ortamı ekleyin ve% 1 penisilin / streptomisin çözeltisi içeren% 10'luk bir FBS DMEM elde etmek için iyice karıştırın. Yukarıdaki kültür ortamının 2 mL'sini 5 mL'lik bir tüpe ekleyin.</li>
	<li>Uzuv kemiklerini 5 mL tüpe aktarın. Tüpteki uzuv kemiklerini küçük parçalara (1-3 mm) kesmek için makas kullanın ve kemik iliği hücrelerini kültür ortamına yeniden askıya almak için homojenatı karıştırın. Doku parçaları tüpün dibine yerleşene kadar 5 dakika bekletin.</li>
	<li>100 mm'lik bir kültür kabına 10 mL'lik %10 FBS DMEM ekleyin ve ardından süpernatantı kültür kabına aktarın. Süpernatanı aspire ederken, doku kalıntılarını kültür kabına aktarmaktan kaçının.</li>
	<li>Yaklaşık 24 saat boyunca 37 °C'de ve %5 CO2'de inkübe edin. Bu kuluçka süresinden sonra, mezenkimal kök hücrelerin çoğunluğu kültür çanak duvarına yapışacak ve yavaş büyürken, çoğu BMM hala kültür ortamında askıya alınacaktır.</li>
	<li>100 mm'lik kültür kabındaki hücre süspansiyonunu yeni bir 25cm2 şişeye aktarın ve hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de ek bir 24 saat boyunca yetiştirmeye devam edin. Eski ortamı dikkatlice çıkarın ve BMM'ler şişe duvarına yapıştıktan sonra taze ortamla değiştirin.</li>
	<li>Şişedeki hücreler% 80-90 akıcılığa ulaştığında alt kültür. NOT: Tüm hücreler 37 °C ve% 5 CO2'de kültürlendi. Kültür sırasında, hücre morfolojisi yavaş yavaş birleştirildi. Hücreler büyüktü, düzensiz şekilliydi, radyal olarak büyüyordu ve şişeye çoklu çekirdeğin gözlemlenebildiği bir disk şeklinde bağlanmıştı.</li>
</ol>2. Hücrenin FACS boyanması
<ol><li>Tripsin, 37 ° C'de 1-2 mL ticari tripsin ve 5 dakika boyunca% 5 CO2 kullanarak sindirilir ve 100.000 / numunelik bir nihai hücre sayımı sağlamak için ikincil yapışkan hücreleri sayın (Neubauer hemositometreli hücreleri sayın).</li>
	<li>Hücreleri üç gruba ayırın (500 μL PBS 100.000 hücre içerir): (1) lekesiz hücreler içeren boş kontrol grubu; (2) izotip kontrol grubu; ve (3) deney grubu (CD11b/c boyama).</li>
	<li>Birincil antikorları (boş kontrol grubu için antikor yok; izotip kontrol grubu için anti-CD11 izotip kontrolü, 0.6 μL antikor/numune, 1 μg/örnek; deney grubu için anti-CD11b/c, 1 μL antikor/örnek, 1 μg/örnek) 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>5 dakika boyunca 300-350 x g'de santrifüj yapın, süpernatanı atın ve hücreleri 500 μL PBS ile yeniden askıya alın. Bağlanmamış birincil antikorların yıkandığından emin olmak için yukarıdaki prosedürü bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>Karşılık gelen sekonder antikoru (boş kontrol grubu için antikor yok; izotip kontrolü ve deney grupları için keçi anti-tavşan IgG, 0.25 μL antikor / örnek, 1: 2.000) karanlıkta buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>5 dakika boyunca 300-350 x g'de santrifüj yapın, süpernatanı atın ve hücreleri 500 μL PBS ile yeniden askıya alın. Bağlanmamış ikinci antikorların yıkandığından emin olmak için yukarıdaki prosedürü bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>CD11b/c pozitif hücrelerini akış sitometrisi ile tespit edin (10.000 hücre/örnek) ve verileri yazılımla analiz edin (örneğin, FlowJo 7.5). NOT: CD11b/c+ hücrelerinin son yüzdesini elde etmek için aşağıdaki formül kullanılmıştır: Deney grubundaki CD11b / c + hücrelerinin yüzdesi - izotip kontrol grubundaki CD11 + hücrelerinin yüzdesi.</li>
</ol>3. Wright-Giemsa boyama
<ol><li>35mm2 hücre tırmanma tabakalarına (1 × 106 hücre / kuyu) ve kültüre 37 ° C'de ve% 5 CO2'ye 24 saat boyunca üç kez geçirilen yapışkan ikincil hücreleri tohumlayın.</li>
	<li>Kültür ortamını atın ve PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Wright-Giemsa boya çözeltisini (0,5 mL-0,8 mL) hücre tırmanma tabakasına 1 dakika boyunca ekleyin.</li>
	<li>Boyayı damıtılmış suyla (0,5 mL-0,8 mL) pamuklu çubukla karıştırın ve 10 dakika bekletin.</li>
	<li>Boya çözeltisini damıtılmış suyla yıkayın ve ardından 1-3 dakika kurutun. Mikroskop altında gözlemleyin.</li>
</ol>4. TRAP boyama
<ol><li>35mm2 hücre tırmanma tabakalarına (1 × 106 hücre / kuyu) ve kültüre 37 ° C'de ve% 5 CO2'ye 24 saat boyunca üç kez geçirilen yapışkan ikincil hücreleri tohumlayın.</li>
	<li>Eski ortamı, nükleer faktör-κB ligandının (RANKL) 50 ng / mL reseptör aktivatörü ve 30 ng / mL makrofaj kolonisi uyarıcı faktörü (M-CSF) ve 37 ° C'de kültür ve% 5 CO2 ile desteklenmiş% 10 FBS DMEM veya osteoklast indüksiyon ortamı ile değiştirin.</li>
	<li>TRAP boyama kiti ile hücreleri üreticinin protokolüne göre lekeleyin ve mikroskop altında gözlemleyin. NOT: TRAP-pozitif hücreler, ışık mikroskobu altında mor olan osteoklastlar olarak tanımlandı. TRAP-pozitif hücrelerin sayısı ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü.</li>
</ol>5. Batı lekesi
<ol><li>35mm2 hücre tırmanma tabakalarına (1 × 106 hücre / kuyu) ve kültüre üç kez geçirilen yapışkan ikincil hücreleri 24 saat boyunca tohumlayın.</li>
	<li>Eski ortamı taze% 10 FBS DMEM veya osteoklast indüksiyon ortamı (50 ng / mL RANKL ve 30 ng / mL M-CSF) ve kültür ile 37 ° C'de 7 gün daha ve% 5 CO2 ile değiştirin.</li>
	<li>Toplam hücresel proteinleri RIPA tamponu ile ekstrakte edin,% 10 SDS-PAGE ile ayırın ve poliviniliden florür membranlarına aktarın18,19.</li>
	<li>2 saat boyunca% 5 yağsız süt tozu (25 mL) ile bloke edin ve TBS-Tween 20 (TBST) ile her seferinde 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.</li>
	<li>Primer antikorları gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin (anti-β-aktin, anti-TRAP ve anti-kathepsin K; tüm primer antikorlar 1:1.000, 10 mL seyreltilmiş antikor / bant olarak seyreltildi) ve TBST ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Sekonder antikoru (keçi anti-tavşan IgG, 1:2.000 seyreltme, 10 mL seyreltilmiş antikor/bant) oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin ve TBST ile üç kez yıkayın. Gelişmekte olan bir çözüm kullanarak protein bantlarını görselleştirin. NOT: Yukarıdaki proteinlerin ekspresyon seviyeleri β-aktin'e normalleştirildi.</li>
</ol>

<ol><li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).</li>
<li>Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+mechanisms%2C+and+significance+of+macrophage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.</a> Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Ono, T., Nakashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+osteoclast+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in osteoclast biology.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%C3%9F-catenin-mediated+p53+suppression+is+indispensable+for+osteogenesis+of+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells.</a> Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).</li>
<li>Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-206+is+required+for+osteoarthritis+development+through+its+effect+on+apoptosis+and+autophagy+of+articular+chondrocytes+via+modulating+the+phosphoinositide+3-kinase%2Fprotein+kinase+B-mTOR+pathway+by+targeting+insulin-like+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).</li>
<li>Li, Z., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+investigating+how+bone+marrow+adipocytes+influence+bone+and+hematopoietic+cellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research.+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity.</a> Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).</li>
<li>Horowitz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes.</a> Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+frommice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).</li>
<li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).</li>
<li>Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+interstitial+macrophages+from+the+lungs+using+different+digestion+enzymes+and+staining+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).</li>
<li>Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+culture+approach+to+study+osteoclast+differentiation+from+nonadherent+porcine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).</li>
<li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consistent+method+to+identify+and+isolate+mononuclear+phagocytes+from+human+lung+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).</li>
<li>Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+osteoclast+precursor+populations+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-speed+western+blot+using+immunoreaction+enhancing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycyrrhizic+acid+suppresses+osteoclast+differentiation+and+postmenopausal+osteoporosis+by+modulating+the+NF-%CE%BAB%2C+ERK%2C+and+JNK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmocology%22%5BJournal%5D)">Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways.</a> European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRc17+controls+BMSC+senescence+via+mitophagy+and+inhibits+the+therapeutic+effect+of+BMSCs+on+ovariectomy-induced+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss.</a> Redox Biology. , (2021).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioacetamide+promotes+osteoclast+transformation+of+bone+marrow+macrophages+by+influencing+PI3K%2FAKT+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways.</a> Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).</li>
</ol>

Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Osteoklastlar, kemik hastalıklarının ortaya çıkmasında ve gelişmesinde rol oynayan en önemli hücre tiplerinden biridir ve kemik hastalığı araştırmalarının birincil hedeflerinden biridir20. Monosit / makrofajlar osteoklastlara farklılaşabilir. Mononükleer makrofajlar (RAW264.7 hücreleri) satın almak için çok pahalı olduğundan ve kültür sırasında kolayca aktive edildiğinden, bu hücre hattını kullanarak in vitro farklılaşma deneyleri yapmak zordur. Kemik iliğinden monositlerin/makrofajların ...

Kemik iliğinde bulunan monosit-makrofaj soy hücrelerinin kan monositlerine ve doku makrofajlarına farklılaşabileceği bildirilmiştir 1,2. Kemik büyümesini ve gelişimini dengelemek için osteoklastlara farklılaşabilen yukarıdaki hücreler, in vivo 3,4 osteoklastlarını indüklemek için yaygın olarak bir hücre modeli olarak kullanılır. Kemik iliği, kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri (BMM'ler), hematopoetik kök hücreler, endotel hücreleri ve bağışıklık hücrelerini içeren ancak bunlarla sınırlı olmayan birkaç farklı hücre türü içeren özel bir dokudur. Aslında, önceki birkaç çalışma, uzun kemiğin kemik iliği boşluğundan dışarı fırlayan yapışkan hücrelerin osteoblastlara, osteoklastlara, kondrositlere veya adipositlere 5,6,7,8 olarak farklılaşabileceğini öne sürdü. Farklı homojen hücre popülasyonları üretmek için farklı izolasyon ve kültür yöntemleri kullanılmış olsa da, BMM'leri çeşitli farklı hücre tiplerinden izole etmek ve kültürlemek için hala büyük zorluklar vardır.
Kemik iliği mononükleer makrofajlarını (BMSC'ler) çıkarmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğunluğu karmaşıktır 9,10,11. Örneğin, yoğunluk gradyanı santrifüjleme özel bir kit gerektirir ve işlem zaman alıcı ve hantaldır. Bu yöntem, BMM'lerin yüksek hacimli kan örneklerinden izole edilmesi için uygundur, ancak kemik iliği örneklerinden 9,12,13 için uygun değildir. Ek olarak, kollajenaz sindirimi kullanarak doku örneklerinin çıkarılması karmaşık ve zaman alıcı bir prosedürdür; BMM'lerin kemik iliği örneklerinden izolasyonu için bu yöntem önerilmez14,15. Ek olarak, akış ayrımı yüksek oranda saflaştırılmış monosit/makrofaj popülasyonlarına neden olabilse de, çok büyük numune boyutları ve yüksek cihaz ve ekipman gereksinimleri gerektirir10,16. Ek olarak, mikroboncuk zenginleştirme yöntemi son derece pahalıdır ve genel bir laboratuvarda uygulanabilir değildir17.
Bu nedenle, mevcut çalışmada, mononükleer makrofajların kemik iliğinden izole edilmesi için uygun, hızlı ve ucuz bir yöntem önerilmiştir. Farklı zaman noktaları için yapıştırılan kemik iliği hücreleri, ikincil bir aderans yöntemi kullanılarak BMM'leri izole etmek için kullanıldı. Yukarıdaki yöntemle ekstrakte edilen BMM'ler, in vitro osteoklastların oluşumunu indükleyebilir, böylece in vitro osteoporozun gelecekteki çalışması için basit ve kullanışlı bir hücre modeli sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>35 mm 2 hücre tırmanma dilimleri</td><td>NEST Biotechnology</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-katepsin K</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-CD11 izotip kontrolü</td><td>Abcam</td><td>ab172730</td><td>1 & mu; g / test, 1.675 mg / Ml</td></tr><tr><td>Anti-CD11b / c</td><td>Absin</td><td>abs124232</td><td>&nbsp; 1&mu; g / test, 1 mg / mL</td></tr><tr><td>Anti-TRAP</td><td>Abcam</td><td>ab191406</td><td>1: 1.000</td></tr><tr><td>Anti-&beta; -aktin</td><td>Beyotime</td><td>&nbsp; AF5003</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Hücre tırmanma dilimleri</td><td>NEST Biyoteknoloji</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü kabı</td><td>corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi</td><td>corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr>IF için <td>keçi anti-tavşan</td><td>Abcam Abcam</td><td>ab150077</td><td>, WB için 1: 2.000</td></tr><tr><td>keçi anti-tavşan IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>, 1: 2.000</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Pepro teknolojisi</td><td>400-28</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Pepro teknolojisi</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>SD sıçan</td><td>Şangay SLAC Laboratuvar Hayvanı Co, Ltd</td><td></td><td>1-10 günlük</td></tr><tr><td>SDS-PAGE jel hazırlama kiti</td><td>Solarbio</td><td>P1200</td><td></td></tr><tr><td>TRAP/ALP Boyama Kiti</td><td>Wako</td><td>294-67001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Biosharp</td><td>BL512A</td><td></td></tr><tr><td>Wright-Giemsa çözümü</td><td>Keygen Biotech</td><td>KGA225-1</td><td></td></tr></tbody></table>

monosit-makrofaj soy hücrelerinin sıçan kemiklerinden İkincil aderans yöntemi ile İzolasyonu

Isolation of Monocyte-Macrophage Lineage Cells from Rat Bones by Secondary Adherence Method

Kemik mineral yoğunluğunun azalmasıyla, kemiklerin kırılma olasılığı daha yüksektir, bu nedenle hastanın yaşam kalitesini olumsuz yönde etkiler. Kemiklerin büyümesi ve gelişmesi esas olarak osteoblastlar ve osteoklastlar tarafından düzenlenir. Osteoklastların kemik iliği monosit-makrofaj hücrelerinden (BMM'ler) türetildiği yaygın olarak kabul edilmektedir. BMM'ler ve diğer hematopoetik kök hücreler kemik iliği boşluğunda bulunur. Bu nedenle, tek kararlı BMM'leri farklı ve heterojen hücre popülasyonlarından izole etmek büyük bir zorluktur. Burada, BMM'lerin SD sıçanlardan izolasyonu için ikincil aderans yöntemi olarak adlandırılan bir protokol sunuyoruz. Primer kültürde 24-48 saat kültüre alınan yapışık hücreler toplandı. Akım sitometrik analiz, hücrelerin yaklaşık% 37.94'ünün CD11b / c + (monosit-makrofaj yüzey antijeni) olduğunu göstermiştir. Tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) boyama ve batı leke analizi, BMM'lerin in vitro osteoklastlara farklılaşabileceğini göstermiştir. Yukarıdaki bulgular, sekonder aderans hücrelerinin osteoklast farklılaşma araştırması için uygun bir hücresel model olarak düşünülebileceğini düşündürmektedir.

İkincil aderans hücre popülasyonu stabil ve tekdüzeydi. Sürekli hücre proliferasyonu ile hücrelerin çoğunluğu düzensiz şekilli olarak daha büyük hale geldi ve radyal yapışkan bir diske dönüştü (Şekil 2C, D). Akım sitometrisi, monosit-makrofaj soy hücrelerinin yüzeyinde moleküler bir belirteç olan CD11b/c'yi eksprese eden hücrelerin yüzdesinin yaklaşık 7.94 olduğunu göstermiştir (Şekil 2A,B). CD11...

Burada, BMM'lerin SD sıçanlardan izolasyonu için ikincil aderans yöntemi olarak adlandırılan bir protokol sunuyoruz.

Monosit-Makrofaj Soy Hücrelerinin Sıçan Kemiklerinden İkincil Aderans Yöntemi ile İzolasyonu

With a decrease of bone mineral density, bones are more likely to fracture, thus negatively affecting a patient's quality of life. The growth and ...

Bu protokolde kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri sekonder aderans yöntemi ile ekstrakte edilir. Kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri, osteoklastların in vitro çalışması için stabil bir hücre modeli sağlayan osteoklastlara başarılı bir şekilde farklılaşabilir. Bu yöntem küçük kemik iliği örnekleri için uygundur ve kemik iliği monosit-makrofaj hücrelerini kemik iliğinden yüksek teknoloji ürünü laboratuvar ekipmanı gerektirmeden basit ve hızlı bir şekilde çıkarabilir.Osteoklastların artması osteoporozun potansiyel patogenezi olabilir. Kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri, osteoklast öncü hücreleri olarak belirli araştırma değerlerine sahiptir. Başlamak için, ötenazi sıçanları dezenfeksiyon için 10 dakika boyunca% 75 alkole batırın.Sıçanın tüm uzuvlarını makas ve forseps ile dikkatlice çıkardıktan sonra, bir pipet kullanarak PBS ile aspire edin ve uzuvlara yapışan kanı temizleyin. Daha sonra% 10 FBS DMEM'in iki mililitresinde beş mililitrelik bir tüpe dönüşür. Uzuv kemiklerini beş mililitrelik tüpe aktardıktan sonra, tüpteki uzuv kemiklerini küçük parçalara ayırmak için makas kullanın ve kemik iliği hücrelerini kültür ortamına geri püskürtmek için homojenatı karıştırın.Doku parçaları tüpün dibine yerleşene kadar beş dakika bekletin. Daha sonra, 100 milimetrelik bir kültür kabına 10 mililitre% 10 FBS DMEM ekleyin ve ardından süpernatantı kültür kabına aktarın. Yaklaşık 24 saat boyunca% 5 karbondioksitte 37 santigrat derecede inkübe edin.Bu kuluçka süresinden sonra, mezenkimal kök hücrelerin çoğunluğu kültür çanak duvarına yapışacak ve yavaş büyürken, çoğu kemik iliği monosit-makrofaj hücresi hala kültür ortamında asılı kalacaktır. 100 milimetrelik kültür kabındaki hücre süspansiyonunu yeni bir 25 santimetrekarelik şişeye aktarın ve hücreleri 24 saat daha% 5 karbondioksitte 37 santigrat derecede yetiştirmeye devam edin. Eski ortamı dikkatlice çıkardıktan sonra, kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri şişe duvarına yapıştıktan sonra taze ortamla değiştirin.Akım sitometrisi, monosit-makrofaj soy hücrelerinin yüzeyinde moleküler bir belirteç olan CD11b ve c'yi eksprese eden hücrelerin yüzdesinin yaklaşık% 37.94 olduğunu gösterdi Sürekli hücre proliferasyonu ile, hücrelerin çoğunluğu düzensiz şekil içinde büyüdü ve radyal yapışkan bir diske dönüştü. TRAP boyama sonuçları, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, nükleer faktör kappa B ligandı reseptör aktivatörü ve makrofaj kolonisi stimüle edici faktör ile indüklenen hücrelerde hücre içi mor kırmızı granül sayısının anlamlı olarak arttığını göstermiştir. Western blot analizi, osteoklast spesifik proteinleri TRAP ve kathepsin K'nın ekspresyon seviyelerinin, tedavi edilen hücrelerde kontrol grubuna kıyasla anlamlı derecede arttığını göstermiştir.Bu prosedürdeki en önemli şey, birincil kültürün 24 ila 48 saatinde sekonder yapışkan hücrelerin toplanma zamanıdır, kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri tamamen yapışmaya başlar. Bu yöntemle izole edilen kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri, in vitro osteoklastlara indüklenebilir ve osteoporozun incelenmesi için stabil bir hücre modeli sağlar.

isolation-monocyte-macrophage-lineage-cells-from-rat-bones-secondary

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Makrofajlar sıçan karaciğer hücrelerinin primer kültür elde etmek için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, plastik tabaklar, seçici eklenti kültür matara ve arıtma sallayarak kültürün yayılması, makrofajlar kullanır. Bu teknik, karmaşık ekipman ve becerileri verimli olmadan karaciğer makrofajlar sağlar.

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Burada, translasyonel uygulamalar için heterojen kemik iliğinden büyük miktarlarda murin monositleri üreten bir protokol sunuyoruz. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem, kurban edilen hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olur ve yüksek gradyanlı manyetik hücre ayırma (MACS) gibi pahalı yöntemlerden kaçınarak maliyetleri düşürür.

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

Bu protokol, enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanlı ayırma plastik uyumu ve CD146 + manyetik boncuk seçimi aracılığıyla, sıçanlardan primer akciğer yerleşik mezenkimal stromal hücreler elde etmek için bir izolasyon tekniği tarif etmektedir.

CD146 İzolasyonu<sup&gt; +</supSıçan Akcigerlerinden&gt; Resident Akciğer Mezenkimal Stromal hücreler

Osteokuzlar, hematopoetik kök hücrelerin monosit-makrophaj soylarından elde edilen dokuya özgü makrophaj polykaryonlarındadır. Bu protokol, kemik iliği hücrelerinin nasıl yalıtılmasını açıklar, böylece geleneksel yöntemlerde bulunan kazaların riskini azaltarak büyük miktarlarda osteocsürer elde edilir.

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Bu makalede, sıçan mandibulalarından kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek, yetiştirmek, sıralamak ve tanımlamak için tüm kemik iliği yapışması ve akış sitometrisi sıralamasını birleştiren bir yöntem sunulmaktadır.

Sıçanlarda Mandibuler Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Yetiştirilmesi

Burada sunulan peptid CD47 (pepCD47) polibisfosfonat kimya kullanarak metal stentler için ekiçin bir protokoldür. PepCD47 kullanarak metal stentlerin fonksiyonelleştirilmesi inflamatuar hücrelerin bağlanmasını ve aktivasyonunu önler ve böylece biyouyumluluğunu artırır.

CD47-Türetilmiş Peptid İmmobilizasyonu Ile Metal İmplantlara Kan Yoluyla Bulaşan Hücre Bağlılığının Azaltılması

Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Bu araştırma, sıçan kemik iliğinden bol miktarda nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) izole etmek için iki tekniği özetlemektedir. Bir yöntem, ticari bir nötrofil izolasyon kitini yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile birleştirirken, diğeri yalnızca yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeyi kullanır. Her iki yaklaşım da periferik kan nötrofillerinden daha iyi fonksiyonel NET'ler verir.

Karşılaştırılabilir Kapasiteye Sahip Sıçan Kemik İliği Nötrofillerini İzole Etmek için Benzersiz Yaklaşım

Bu protokol, 7-9 günlük yenidoğan fare kemik iliği hücrelerini izole etmek ve granülosit koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak L929 hücrelerinin bir süpernatantını kullanarak farklılaşmış makrofajlar oluşturmak için enzimatik olmayan ve basit bir yöntemi tanımlar. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, yüzey antijenleri F4/80, CD206, CD11b ve fonksiyonel yeterlilik açısından daha fazla analiz edildi.

Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

Çene kemik iliğinden elde edilen mezenkimal kök hücreler, çeşitli farklılaşma, kendini yenileme ve immün modülasyonda önemli işlevlere sahiptir. Gen terapisi, doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta öncü hücrelerin çok önemli bir rezervuarı olarak ortaya çıkmışlardır. Burada, sıçanlarda çene kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek için benzersiz bir yöntem sunuyoruz.

Sıçan Çene Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü Tekniği

Keşfedin: Sıçan kemik iliğinden ikincil aderans yöntemiyle monosit-makrofaj hücrelerinin izolasyonu. Bu teknik, osteoklast farklılaşması ve osteoporoz araştırmaları için güvenilir bir hücre modeli sunar.

Monosit-Makrofaj Soy Hücrelerinin Sıçan Kemiklerinden İkincil Aderans Yöntemi ile İzolasyonu

Daha fazla video keşfet