Name: Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Keşfedin S1P reseptörlerinin yapı ve fonksiyonlarını kriyojenik elektron mikroskobu ile analiz etme yöntemini. Bu boru hattı, ilaç geliştirme için hedefli tedavilerin temelini oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S1PRs-Gi kompleksinin verileri, Sichuan Üniversitesi'ndeki Batı Çin Cryo-EM Merkezi'nde ve Güney Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'ndeki (SUSTech) Cryo-EM Merkezi'nde toplandı ve Sichuan Üniversitesi'ndeki Duyu Yüksek Performanslı Bilgi İşlem Merkezi'nde işlendi. Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı (32100965 L.C.'ye, 32100988 W.Y.'ye, 31972916 Z.S.'ye) ve Sichuan Üniversitesi tam zamanlı Doktora Sonrası Araştırma Fonu (2021SCU12003'ten L.C.'ye) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Verstockt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+modulation+and+immune+cell+trafficking+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease.</a> Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).</li>
<li>Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+and+its+receptors%3A+structure%2C+signaling%2C+and+influence%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).</li>
<li>Cartier, A., Hla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate%3A+Lipid+signaling+in+pathology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy.</a> Science. 366 (6463), 5551(2019).</li>
<li>Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+sphingosine-1-phosphate+in+cardiovascular+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology.</a> Pharmacological Research. 156, 104793(2020).</li>
<li>Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+receptor+nomenclature+review%3A+IUPHAR+Review+8%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).</li>
<li>Bryan, A. M., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity.</a> Cellular Microbiology. 20 (5), 12836(2018).</li>
<li>Pelletier, D., Hafler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fingolimod+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fingolimod for multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).</li>
<li>Obinata, H., Hla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate and inflammation.</a> International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).</li>
<li>Pyne, N. J., Pyne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Cancer%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate and cancer.</a> Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).</li>
<li>Abu-Farha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lipid+metabolism+in+COVID-19+virus+infection+and+as+a+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544(2020).</li>
<li>Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fingolimod%3A+lessons+learned+and+new+opportunities+for+treating+Multiple+Sclerosis+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).</li>
<li>Murakami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+%28S1P%29+regulates+vascular+contraction+via+S1P3+receptor%3A+investigation+based+on+a+new+S1P3+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist.</a> Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siponimod+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Siponimod for multiple sclerosis.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).</li>
<li>Scott, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siponimod%3A+a+review+in+secondary+progressive+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Drugs%22%5BJournal%5D)">Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis.</a> CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).</li>
<li>Lamb, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozanimod%3A+first+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Ozanimod: first approval.</a> Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).</li>
<li>Scott, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozanimod+%28RPC1063%29+is+a+potent+sphingosine-1-phosphate+receptor-1+%28S1P1%29+and+receptor-5+%28S1P5%29+agonist+with+autoimmune+disease-modifying+activity%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity.</a> British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).</li>
<li>McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SphK-S1P-SIPR+pathway+as+a+potential+therapeutic+approach+for+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189(2020).</li>
<li>O'Sullivan, C., Dev, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+function+of+the+S1P1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure and function of the S1P1 receptor.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
<li>Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).</li>
<li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+an+activated+GPCR-G+protein+complex+in+lipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).</li>
<li>Renaud, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+in+drug+discovery%3A+achievements%2C+limitations+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).</li>
<li>Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+G+protein-coupled+receptors%3A+new+opportunities+from+XFELs+and+cryoEM%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM.</a> Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors%3A+structure-+and+function-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7(2021).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+signaling+complexes+of+lipid+receptors+S1PR1+and+S1PR5+reveal+mechanisms+of+activation+and+drug+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition.</a> Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+sphingosine-1-phosphate+recognition+and+ligand+selectivity+of+S1PR3-Gi+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes.</a> Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+sphingosine-1-phosphate+receptor+1+activation+and+biased+agonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism.</a> Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).</li>
<li>Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+cAMP+synthesis+by+Gi-coupled+receptors+upon+ablation+of+distinct+Galphai+protein+expression.+Gi+subtype+specificity+of+the+5-HT1A+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).</li>
<li>Buccioni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+functional+cAMP+assay+for+studying+G+protein-coupled+receptors%3A+application+to+the+pharmacological+characterization+of+GPR17%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signalling%22%5BJournal%5D)">Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17.</a> Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).</li>
<li>Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase-based+GloSensor+cAMP+assay%3A+Temperature+optimization+and+application+to+cell-based+kinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies.</a> Methods. , (2021).</li>
<li>Audet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+approach+for+precrystallization+screening+in+GPCR+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography.</a> Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).</li>
<li>Sgro, G. G., Costa, T. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+grid+preparation+of+membrane+protein+samples+for+single+particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74(2018).</li>
<li>White, J. B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+cryo-electron+microscopy%3A+from+sample+to+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62415(2021).</li>
<li>Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+pre-processing+and+on-the-fly+analysis+of+data+for+high-resolution%2C+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).</li>
<li>Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+approach+to+single-particle+processing+in+RELION%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">A pipeline approach to single-particle processing in RELION.</a> Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Brilot, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam-induced+motion+of+vitrified+specimen+on+holey+carbon+film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film.</a> Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gctf%3A+Real-time+CTF+determination+and+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Gctf: Real-time CTF determination and correction.</a> Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+selection+of+cryo-EM+particles+in+RELION-1.3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3.</a> Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+mechanisms+of+lipid+GPCRs+by+lysophosphatidic+acid+and+sphingosine+1-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate.</a> Nature Communications. 13 (1), 731(2022).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+an+activated+VIP1+receptor-G+protein+complex+revealed+by+a+NanoBiT+tethering+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4121(2020).</li>
<li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+%28cryo-EM%29+processing+workflow+with+cryoSPARC%2C+RELION%2C+and+Scipion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387(2022).</li>
<li>Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassays+of+adenosine+cyclic+3%27%2C5%27-monophosphate+and+guanosine+cyclic+3%27%2C5%27-monophosphate+using+acetylcholinesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3',5'-monophosphate and guanosine cyclic 3',5'-monophosphate using acetylcholinesterase.</a> Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).</li>
<li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate%2FG13+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Bu protokol, S1PR'lerin yapılarını kriyo-EM ile belirlemek ve Gi-aracılı cAMP inhibisyon testi ile S1PR'lerin aktivasyon gücünü ölçmek için birincil bir boru hattını açıklamaktadır. Bazı adımlar deneyin başarısı için çok önemlidir.
S1PRs-Gi kompleksini saflaştırmak için, virüsün kalitesine ve sf9 hücrelerinin sağlığına daha fazla dikkat edilmelidir. Reseptörün ekspresyonu, zayıf sf9 hücrelerinde önemli ölçüde azalır. Sf9 hücrelerinin sağlığı, çapları ölçülerek değerl...

Hücre zarındaki sfengolipidlerin metabolik bir ürünü olan Sfengosin-1-fosfat (S1P), lenfosit kaçakçılığı, vasküler gelişim, endotel bütünlüğü ve kalp atış hızı 1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik aktiviteleri içeren her yerde bulunan bir lizofosfatidik sinyal molekülüdür. S1P, çeşitli fizyolojik etkilerini beş S1P reseptör alt tipi (S1PRs 1-5) aracılığıyla uygular; S1PR'ler çeşitli dokularda bulunur ve aşağı akış G proteinleri için benzersiz tercihler sergiler 4,5. S1PR1 öncelikle daha sonra cAMP üretimini inhibe eden Gi proteini ile birleştirilir; S1PR2 ve S1PR3, Gi, Gq ve G12/13 ile birleştirilir ve S1PR4 ve S1PR5, Gi ve G12/136 üzerinden sinyal dönüştürür.
S1P-S1PR sinyalizasyonu, otoimmün bozukluklar7, inflamasyon8, kanser 9 ve hatta COVID-1910 dahil olmak üzere birçok hastalık için kritik bir terapötik hedeftir. 2010 yılında, fingolimod (FTY720), nüks multipl sklerozu (MS) 11'i tedavi etmek için S1PR'leri hedefleyen birinci sınıf bir ilaç olarak lisanslanmıştır. Bununla birlikte, S1PR2 hariç tüm S1PR'lere bağlanabilirken, S1PR3'e spesifik olmayan bağlanma, serebral korteksin ödemi, vasküler ve bronşiyal daralma ve akciğer epitel sızıntısı12 ile sonuçlanır. Terapötik seçiciliği arttırmak için alternatif bir strateji olarak, reseptör için alt tipe özgü ligandlar üretilmiştir. Siponimod (BAF312) 2019 yılında nüks MS tedavisi için onaylanmıştır13; S1PR1 ve S1PR5'i etkili bir şekilde hedeflerken, S1PR3 için afinitesi yoktur, klinik uygulamada daha az yan etki gösterir14. 2020 yılında, ABD Gıda ve İlaç İdaresi, MS tedavisi için ozanimod'u yetkilendirdi15. Ozanimod'un S1PR1 için S1PR516'dan 25 kat daha fazla seçiciliğe sahip olduğu bildirilmiştir. Özellikle, mevcut COVID-19 pandemisi bağlamında, S1PR'leri hedef alan agonist ilaçların, immünomodülatör tedavi teknikleri kullanılarak COVID-19'u tedavi etmek için kullanılabileceği keşfedilmiştir17. Fingolimod ile karşılaştırıldığında, ozanimod COVID-19 hastalarında semptomları azaltmada üstünlük göstermiştir ve şimdi klinik çalışmalardan geçmektedir10. S1PR'lerin yapısal temelini ve işlevini anlamak, S1PR'ler18'i seçici olarak hedefleyen bir ilaç geliştirmek için önemli bir temel oluşturur.
X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) ve elektron mikroskobu (EM) dahil olmak üzere biyomakromoleküllerin yapısal bilgilerini araştırmak için birçok teknik kullanılmaktadır. Mart 2022 itibariyle, Protein Veri Bankası'na (PDB) yatırılan 180.000'den fazla yapı var ve bunların çoğu X-ışını kristalografisi ile çözüldü. Bununla birlikte, Yifan Cheng ve David Julius tarafından 201319'da bildirilen TPRV1'in ilk atomik çözünürlüğe yakın yapısı (3.4 şçözünürlük) ile, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) protein yapıları için ana akım bir teknik haline gelmiştir ve EM PDB yapılarının toplam sayısı 10.000'den fazlaydı. Kritik atılım alanları, doğrudan elektron algılama kameraları ve yeni görüntü işleme algoritmaları olarak bilinen görüntüleme için yeni kameraların geliştirilmesidir. Cryo-EM, son on yılda yapı biyolojisinde ve yapı tabanlı ilaç keşfinde devrim yarattı20. Makromoleküler komplekslerin canlı hücredeki karmaşık rollerini nasıl yerine getirdiklerini anlamak, biyolojik bilimlerde merkezi bir tema olduğundan, kriyo-EM, özellikle transmembran proteinleri için dinamik moleküler komplekslerin konformasyonlarını ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir21. G-protein eşleşmiş reseptörleri (GPCR'ler), transmembran proteinlerinin en büyük süper ailesidir ve şu anda pazarlanan ilaçların% 30'undan fazlasının hedefleridir22. Kriyo-EM'nin gelişimi, GPCR-G protein komplekslerinin yüksek çözünürlüklü yapılarının patlamasına katkıda bulunarak, ilaç tasarımında X-ışını kristalografik analizi için hala erişilemeyen 'inatçı' hedefler için yapısal belirlemeyi mümkün kılmıştır23. Bu nedenle, kriyo-EM uygulaması, GPCR'lerin üç boyutlu yapısını, atomik çözünürlük24'e yakın doğal koşullarda belirleme şansı sağlar. Kriyo-EM'deki ilerlemeler, GPCR stimülasyonunun veya inhibisyonunun mekanik temellerini görselleştirmeyi mümkün kılmakta ve GPCR hedefli ilaç üretimi için yeni bağlanma bölgelerinin ortaya çıkarılmasında daha fazla fayda sağlamaktadır25.
Kriyo-EM teknolojisinin muazzam adımlarına dayanarak, son zamanlarda26,27 olan acı çeken S1PR1-, S1PR3- ve S1PR5-Gi sinyal komplekslerinin yapılarını belirledik. İnsanlarda, S1PR'ler çeşitli dokularda bulunur ve aşağı akış G proteinleri 4,5 için benzersiz tercihler sergiler. S1PR1 öncelikle Gi proteini ile birleştirilir ve bu da daha sonra 3′,5′-siklik adenozin monofosfat (cAMP) üretimini inhibe eder. S1PR3 ve S1PR5 ayrıca Gi 6,28 ile birleşebilir. Gi-kuplajlı reseptör aktivasyonu cAMP29'un üretimini azalttığından, fonksiyonel değişiklikleri yakalamak için cAMP inhibisyon etkilerini ölçmek için bir Gi-inhibisyon cAMP testi tanıtıldı26,27. Bir cAMP bağlayıcı protein parçasının yerleştirildiği Photinus pyralis luciferase'in mutant bir versiyonunu kullanarak, bu cAMP testi, hücre içi cAMP konsantrasyonundaki değişiklikler yoluyla GPCR aktivitesini izlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sunar30. Hassas ve radyoaktif olmayan fonksiyonel bir testtir ve ilaç keşfi amacıyla çok çeşitli GPCR'lerin gerçek zamanlı aşağı akış sinyalizasyonunu izlemek için uygulanabilir31.
Burada, öncelikle kriyo-EM manipülasyonları ve bir Gi-inhibisyon cAMP testi dahil olmak üzere, S1PR'lerin aktivasyon ve ilaç tanıma modlarının çözümünde kritik yöntemlerin bir özeti verilmiştir. Bu makale, GPCR'lerin yapı ve işlevlerine yönelik daha ileri araştırmalar için kapsamlı deneysel rehberlik sağlamayı amaçlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>% 0.05 tripsin-EDTA</td><td>GIBCO</td><td>Kedi # 25300054</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mikro; M filtresi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat # 42213-PS</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa kesme yoğunlaştırıcı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat # 88533</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>Cat # 43016</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>Cat # 3917</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # 9087-70-1</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>NEB</td><td>Cat # M0398S</td><td></td></tr><tr><td>Bakulovirüs transfeksiyon reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific Cat</td><td># 10362100</td><td>P0 baculovirus</td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # B6506</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # C6512</td><td></td></tr><tr><td>CryoSPARC</td><td>Punjani, A., et al., 2017</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td></tr><tr><td>DH5 & alfa; yetkili E.coli</td><td>Thermo Fisher Bilimsel Kedi</td><td># EC0112</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin-Potasyum Tuzu</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Kedi # 50227</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Kedi # D2438</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Termo Fisher Bilimsel Kedi</td><td># S311-500</td><td></td></tr><tr><td>ESF921 hücre kültürü</td><td>ortamı İfade Sistemleri Kedi</td><td>#& nbsp; 96-001</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>microsoft</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>F12 orta</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # 11765</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hücre Kutusu</td><td>Kedi # SAG-01U-02</td><td></td></tr><tr><td>Bayrak reçine</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat # A4596</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>APExBIO</td><td>Cat # B1421</td><td></td></tr><tr><td>Gctf</td><td>Zhang, 2016</td><td>&nbsp; https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td><td></td></tr> <tr><td>GDN</td><td>Anatrace</td><td>Cat# GDN101</td><td></td></tr><tr><td>Jel filtrasyon sütunu</td><td>GE healthcare</td><td>Cat# 28990944</td><td></td></tr><tr><td>Gen5 3.11</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Solarbio</td><td>Cat# L1312</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor cAMP test kiti</td><td>Promega</td><td>Cat# E1291</td><td>Gi-inhibisyon cAMP test kiti</td></tr><tr><td>GloSensor plazmid</td><td>Promega</td><td>Cat# E2301</td><td>Sensör plazmid</td></tr><tr><td>Grace' s orta</td><td>GIBCO</td><td>Kedi # 11595030</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prizma 8</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Bilimsel Kedi</td><td># 88284</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat # H4034</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME Reaktif</td><td>Polyplus Transfeksiyon</td><td>Kedi # 114-15</td><td>transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Janamisin</td><td>Solarbio</td><td>Kedi # K1030</td><td></td></tr><tr><td>LB orta</td><td>Invitrogen</td><td>Kedi # 12780052</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedi # L2884</td><td></td></tr><tr><td>LMNG</td><td>Anatrace</td><td>Kedi # NG310</td><td></td></tr><tr><td>MotionCor2</td> <td>(Zheng ve diğerleri, 2017)</td><td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td><td></td></tr><tr><td>NanoCab</td><td>Thermo Fisher Bilimsel Kedi</td><td># 1121822</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-G&alpha; i</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBacdual-G&beta; 1&gama; 2</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plazmid Miniprep Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# K210003</td><td>Plazmitlerin ve P0 bakulovirüsün hazırlanması için</td></tr><tr><td>Q5 bölgeye yönelik Mutajenez kiti</td><td>NEB</td><td>Cat# E0554S</td><td>Plazmitlerin hazırlanması için</td></tr><tr><td>Quantifoil</td><td>Quantifoil</td><td>Cat# 251448</td><td></td></tr><tr><td>RELION-3.1</td><td>(Zivanov ve diğerleri, 2018)</td><td></td><td></td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</tr><tr><td>S1PRs cDNA</td><td>addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>scFv16</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 703976</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>İfade Sistemleri</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Siponimod</td><td>Selleck Cat</td><td># S7179</td><td></td></tr><tr><td>sodyum kolat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # C1254</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 mikroplaka okuyucu</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sentetik T4L DNA (dizi)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt<br/& Gt; atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacaccacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Kedi # 77720</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>Solarbio</td><td>Kedi # T8180</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific N</td><td>/A</td><td></td></tr></tbody></table>

sfengozin 1-fosfat reseptörlerinin yapılarını ve sinyal yollarını araştırmak İçin bir boru hattı

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

Lizofosfolipitler (LPL'ler), sfengozin 1-fosfat (S1P), lizofosfatidik asit vb. İçeren biyoaktif lipitlerdir. Hücre zarındaki sfengolipidlerin metabolik bir ürünü olan S1P, sfengozin 1-fosfat reseptörlerinin (S1PR'ler) aracılık ettiği sinyal yolları aracılığıyla çeşitli hücresel fizyolojik yanıtları düzenleyen en iyi karakterize LPL'lerden biridir. Bu, S1P-S1PR sinyal sisteminin, multipl skleroz (MS), otoimmün bozukluklar, kanser, inflamasyon ve hatta COVID-19 dahil olmak üzere bozukluklar için dikkate değer bir potansiyel terapötik hedef olduğunu göstermektedir. A sınıfı G-protein eşleşmiş reseptör (GPCR) ailesinin küçük bir alt kümesi olan S1PR'ler beş alt tipten oluşur: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 ve S1PR5. Bununla birlikte, ayrıntılı yapısal bilgi eksikliği, S1PR'leri hedef alan ilaç keşfini engellemektedir. Burada, S1P-S1PR kompleksinin yapısını çözmek için kriyo-elektron mikroskobu yöntemini uyguladık ve hücre bazlı fonksiyonel tahliller kullanarak aktivasyon, seçici ilaç tanıma ve G-protein eşleşmesi mekanizmasını aydınlattık. Diğer lizofosfolipid reseptörleri (LPLR'ler) ve GPCR'ler de bu strateji kullanılarak incelenebilir.

S1PRs-Gi kompleksinin numunesini dondurmadan önce, saflaştırılmış numunenin boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile ayrılması ve jel filtrasyon kromatografisi ile analiz edilmesi gerekir. Şekil 2 , örnek olarak S1PR3-Gi kompleksini göstermektedir. Homojen GPCR-G protein kompleksinin tepe fraksiyonu genellikle boyut dışlama kromatografisinin ~ 10.5 mL'sinde bulunuyordu (Şekil 2A). S1PR3-Gi kompleksinin SDS sayfası analizi (Şekil 2B), ...

S1P, çeşitli fizyolojik etkilerini S1P reseptörleri (S1PR'ler) alt ailesi aracılığıyla uygular. Burada, S1PR'lerin yapılarını ve işlevlerini açıklamak için bir boru hattı açıklanmaktadır.

Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

S1PRS'nin mürettebat, EM manipülasyonları ve GI inhab durumu A M P A tarafından aktivasyonu ve ilaç yeniden hesaplama ruh hallerini ele aldık ve S1PRS'yi sağlam bir şekilde hedefleyen bir ilaç geliştirmek için daha az önemli bir temel oluşturduk GP ZR stimülasyonu veya yerleşiminin magnisistik alt resimlerini virülize etmeyi mümkün kılan ilerlemeler ve T BCR hedefli ilaç üretimi için normal bağlanma bölgelerinin ortaya çıkarılmasında daha fazla fayda sağladık. Numunenin kalitesi, doğru EM deneyindeki her şeyin temelidir. Basit hazırlık için gerekli faktörler arasında SF hattı satışının çeşitli ürün durumu ve bir N g konsantrasyonu Prosedürün gösterilmesi, benim seviyemden bir yüksek lisans öğrencisi olan Heli Wang olacaktır.Protein saflaştırma için bu parmak sahnesini bir fosfat reseptörü veya S bir P R S G protein kompleksi çözeltisini, dört santigrat derecede dakikada 0,5 mililitrelik bir akış hızında S E C tamponu ile önceden dengelenmiş bir boyut dışlama kromatografisine veya S E C jel filtrasyon kolonuna yükler. Toplanan fraksiyonları kriyo elektron mikroskobu için kullanmak için, dört santigrat derecede 1.300 XG'de 100 kilodaltonluk bir kesme yoğunlaştırıcısı kullanarak konsantre edin. Parçacıkların ön sınıflandırmasında 2B sınıflandırma için veri işleme sırasında, Güvene Güvenin yazılımındaki 2B sınıflandırma işlevini seçin ve G/Ç seçeneğindeki giriş görüntüleri yıldız dosyasının sağına göz at'ı tıklatın.Ardından particles.star'ı seçin. Ardından, optimizasyon seçeneğinde, sınıf sayısını 100 ve maske çapı A'yı 140 olarak ayarlayın. Hesaplama seçeneğinde, havuza alınmış parçacık sayısını 10 olarak ayarlayın ve parçacığı çizik kopyalama dizini alanına hızlı, hızlı bir yerel sürücüden dizini girin.Daha hızlı işleme için, kullanılmış GPU hızlandırma için evet'i seçin. İyi 2B sonuçların şablon olarak alt küme seçimi için, alt küme seçim işlevinin GÇ seçeneğine gidin ve model.star'dan seçilen sınıfların sağına göz atın. Ardından, run_it025_model'yi seçin.giriş olarak yıldız verin ve açılır pencerede çalıştır'a tıklayın, görüntüleri sıralayın ve ters sıralayın. Ardından ekrana tıklayın. Otomatik toplama işlevinin referansı için referans olarak iyi temsili 2D sonuçları seçtikten sonra, Sağ tıklayın ve seçilen sınıfları kaydet'i seçin.Şablonu otomatik toplamanın ikinci turunda kullanmak için, otomatik toplama işlevinin GÇ seçeneğine gidin. Otomatik seçim için giriş mikrograflarının sağına göz at'ı tıklatın ve micrographs.star'ı seçin. Ardından 2D referansların sağına göz atın ve class_averages.star'ı seçin.Ayrıca, Gaussian'da leplossian için hayır'ı seçin veya kullanın. Ardından, kablo alt çizgi sonekini kullanarak parçacık çıkarma işlemini gerçekleştirin auto pick.star alt çizgisini kullanın. Parçacıkları kullanarak 2B sınıflandırma gerçekleştirin.yıldız, ardından alt küme seçimi kullanılarak çalıştırma alt çizgisi sıfır 20 five_optimizer. star Parçacık çıkarma için, IO seçeneğinde mikrograf yıldız dosyasının sağına gözat'ı tıkladıktan sonra mikrografları seçin. yıldız ekleyin ve rafine edilmiş parçacıklar için evet'i seçin veya yeniden ayıklayın.Rafine parçacıklar yıldız dosyasının sağına göz at'ı tıklattıktan sonra, parçacıkları seçin. İlk 3B model ve referans haritası oluşturmak için yıldız, G/Ç seçeneğindeki giriş görüntüleri yıldız dosyasının sağındaki 3B başlangıç modeline göz atmayı tıklayın ve önceki particles.star'ı seçin. Ardından optimizasyon seçeneğinde, sınıf sayısını bire ve maske çapı A'yı 140 olarak ayarlayın.3B sınıflandırma ve parçacıkları seçtikten sonra bir ön 3B harita oluşturmak için. daha önce gösterildiği gibi yıldız, referans haritasının sağına göz atın ve ilk alt çizgi modeli nokta mrc'yi seçin. Ardından, en iyileştirme seçeneğinde, sınıf sayısını dört ila altı ve maske çapı A'yı 140 olarak ayarlayın.Maske oluşturmak için, GÇ seçeneğinde giriş olarak iyi bir 3B eşleme seçtikten sonra, ilk ikili eşleme eşiğini 0,05 olarak ayarlayın ve ikili eşlemeyi bu kadar piksele üç piksele genişletin. Ardından, maske seçeneğine gidin ve ayarlayın. Bu kadar piksele sekize yumuşak kenar ekleyin.Sonraki işlemler için Trino Spark yazılımını açın, yeni bir çalışma alanı oluşturun ve ilk iş için iş oluşturucuya tıklayın. Parçacık yığınını içe aktarmak için, parçacık meta yolu alanına parçacık yolunu ve parçacık veri yolu alanına film yolunu girin. Ardından, birim veri yolunda daha önce oluşturulan en iyi 3B birimin yolunu girerek ve içe aktarılan birimin türü için maskeyi seçerek 3B birimleri içe aktarın.Düzgün olmayan arıtma için, daha önce oluşturulmuş içe aktarılan alt çizgi parçacıklarını, düzgün olmayan arıtmalar parçacıkları parçacığının girdisi olarak sürükleyin. İçe aktarılan alt çizgi hacmi, tekdüze olmayan iyileştirmeler hacmi hacminin girdisi olarak birinin altını çizin ve içe aktarılan alt çizgi maskesi, tekdüze olmayan iyileştirmeler maskesinin girdisi olarak bir alt çizgi maskesinin altını çizer. Maske. Ardından, işlemeye başlamak için Q'yu tıklatın ve iyi bir çözüm elde etmek için yordamı tekrarlayın.S1PRGI 3D harita. Plazmid yapımı ve geçici transfeksiyon için hazırlıktan sonra, 200 mikrolitre transfeksiyon reaktif tamponuna iki mikrogram hazırlanmış DNA ekleyin. 10 saniye boyunca vorteks yaparak karıştırın ve kullanmadan önce karışımı kısa bir süre döndürün.Dört mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi vorteks ve eğirme ile karıştırın. Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ettikten sonra, 200 mikrolitre transfeksiyon karışımını CHOK bir hücre içeren altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna yavaşça bırakın ve plakayı veya iyice karıştırın. Dört ila altı saatlik inkübasyondan sonra, plakayı inkübatöre geri döndürmeden önce transfeksiyon ortamını F 12 ortamı ve% 10 fbs'den oluşan hücre büyüme ortamı ile değiştirin.Hücrelerin transeksiyon hasadından 24 ila 48 saat sonra, hücreleri D lusiferyen potasyum tuzu ile bir SA tamponunun üç mililitresinde askıya alın. Daha sonra çok kanallı bir pipet kullanarak, hafifçe karıştırılmış 96 kuyucuklu bir plakanın her bir oyuğuna 90 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 40 dakika boyunca inkübe edin. Floresan sinyal tayini için, İlk olarak, D M S O.'da siponimod'un 10 milimolar stok çözeltilerini hazırlayın.Daha sonra 25 mikromolar forskalin içeren H B S S tamponunda seri seyreltme yapın ve hücreleri 30 dakika boyunca bu agonist çözeltinin çeşitli konsantrasyonlarında 10 mikrolitre ile uyarın.Ardından, algılama yöntemi için lüminesansı seçerek bir mikroplaka okuyucudaki lüminesans sinyalini sayın. Okuma türü için uç nokta ve ilgili yazılımdaki optik türü için lüminesans fiber. Ayrıca, optik kazancını 255 olarak ayarlayın.Ardından, elde edilen floresan sinyal değerlerini bir elektronik tablo programına aktarın ve doğrusal olmayan regresyon eğrisi uygun doz yanıtı işlevini kullanarak verileri işleyin. S1PRS GI kompleksi, SDS sayfası tarafından doğrulanan boyut dışlama kromatografisi ile başarıyla saflaştırılabilir. Ayrıca, bu çalışmada izlenen elektron mikroskobu protokolü, açık ve iyi tanımlanmış 2D sınıfları ve düşük kaliteli parçacıkları olan S1PRSGI parçacıkları arasında ayrım yapmada etkili olmuştur.Ayrıca, iyi bir çözünürlüğe sahip S1PR3 GI'nin elektron mikroskobu haritası, düzgün olmayan arıtma yoluyla kürk kabuğu korelasyonu ile üretilebilir. Yapısal analizden sonra, S bir P R üç için fonksiyonel testler, C H O K bir hücrenin reseptör ve sensör plazmidleri ile transfeksiyonu ile yapıldı, bu da reseptör plazmidinin sensör plazmidine oranının bir ila üç arasında optimum sonuçlar verdiğini ortaya koydu. Bununla birlikte, sonuçlar heck 2 93 hücrelerinde daha az gerçekçiydi Bu işlemede, parçacık bölümündeki algoritmaların seçimi ve 2B ve 3B sınıflandırma bölümü, özellikle sızıntıları ve ecf'leri modellemek için MPS G protein komplekslerini çözmek için önemlidir.

a-pipeline-to-investigate-structures-signaling-pathways-sphingosine-1

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Lipofilik boya FM1-43 maruz kalan hücrelerin canlı görüntüleme gözenek oluşturucu toksinler plazma membran kaldırılır hangi kinetiği tam belirlenmesini sağlar. Bu Ca 2 + gereksinimleri, sfingomiyelinaz ve plazma membranı onarım diğer faktörler değerlendirmek için kullanılabilecek bir hassas bir deneydir.

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Fosfoinosititler nispi bolluk hızlıca, çeşitli uyarılara cevap olarak değişen lipidleri işaret ediyor. Bu makalede, ekstre etme ve Deaçillendirme ardından 3 H, miyo -inositol ile metabolik etiketlenmesi hücreleri tarafından fosfoinositidlerde bolluğunu ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Çıkarılan glisero-inositides daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılmıştır ve akış sintilasyon ile nicelendirilir.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

PI (4,5) P2 çeşitli hücresel fonksiyonlarını düzenler, ancak hücre plazma zarı kendi nano örgütü tam olarak anlaşılamamıştır. Etiketleme PI pleckstrin homoloji alanı ile kaynaşmış bir çift renkli flüoresan sonda ile (4,5) P2, biz nanometre ölçeğinde (4,5) p plazma membranında 2 dağılımını PI incelemek için yeni bir yaklaşım tarif .

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Burada, bir protokol ölçmek ve birden çok tepki izleme kullanarak her sphingomyelin tür hak ve MS/MS/MS modu, sırasıyla mevcut.

Sphingomyelin türler Sphingomyelin LC-MS iki kararlı Isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli

Burada, bir proteinin fosfatidiylserine veya fosfatidiliinositol 4-fosfat in vitro'yuayıklayıp taşımadığını belirlemek için floresan lipid sensörleri ve lipozomlar kullanarak protokolleri açıklıyoruz.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Sfengolipidler, insan hastalıklarında iyi bilinen rollere sahip biyoaktif metabolitlerdir. Kütle spektrometresi ile dokulardaki değişikliklerin karakterize edilmesi, hastalık etiyolojisindeki rolleri ortaya çıkarabilir veya terapötik hedefleri tanımlayabilir. Bununla birlikte, biyodepolarda kriyoprezervasyon için kullanılan OCT bileşiği, kütle spektrometrisine müdahale eder. OCT'ye gömülü insan dokularındaki sfingolipidleri LC-ESI-MS / MS ile analiz etme yöntemlerini özetliyoruz.

Kütle Spektrometrisi Analizi için Optimum Kesme Sıcaklığı Bileşiğine Gömülü İnsan Dokularının Hazırlanması

Bu protokol, farmakolojik olarak önemli G proteini bağlantılı reseptör sınıflarından biri olan insan 1A serotonin reseptör proteininin (5-HT1AR) yeniden uzlaştırılması için burada açıklandığı gibi, integral membran proteinlerini (IMP'ler) dev unilamellar lipid veziküllerine (GUVs) dahil etmek için güçlü ve genelleştirilebilir bir teknik olarak agarose şişmesini kullanır.

G-protein Bağlantılı Reseptörleri (GPCR) içeren Model Lipid Membranlarının yapımı

Lipozomal membran geçirgenliğini değerlendirmek için geleneksel tekniklere göre üstün hassasiyet ve çözünürlükle uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Yeni bir kapsüllenmiş ligand ikame reaksiyonu kullanan bu teknik, model membranlarda fosfolipaz A2 ile indüklenen değişiklikleri tespit eder. Standart analizlerle kolayca entegre edilen bu erişilebilir yaklaşım, membran biyofiziği ve toksin etkileşimlerini incelemek için çözünürlüğü artırır.

Fosfatidilinositol Fosfat Gruplarının Venom PLA2'nin Membranotropik Etkisi Üzerindeki Etkilerini Araştırmak için Bir Lipozom Membran Geçirgenlik Testi

Doğal olarak ilgisiz proteinler arasındaki iletişimi indükleyebilecek sentetik 'kimyasal dönüştürücüler' geliştirmek için kılavuzlar sunuyoruz. Ek olarak, bir büyüme faktörünün detoksifiye edici bir enzimi aktive etmesini ve sonuç olarak bir antikanser prodoksifiye edici ilacın bölünmesini düzenlemesini sağlayan spesifik bir 'dönüştürücünün' sentezlenmesi ve test edilmesi için ayrıntılı protokoller sunulmaktadır.

Sinyal Proteinlerin Fonksiyonu taklit: Yapay Sinyal İletimi Tedavisi Doğru

Guanozin trifosfat (GTP) bağlanması, G-Protein-Çiftleşmiş Reseptör (GPCR) aktivasyonundaki en erken olaylardan biridir. Bu protokol, radyo-etiketli GTP analoğu, [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfatın ([35S] GTPyS) bağlanmasını izleyerek spesifik GPCR-ligand etkileşimlerinin farmakolojik olarak nasıl karakterize edildiğini açıklamaktadır. Ilginin bir ligandına cevap.

Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

Keşfedin S1P reseptörlerinin yapı ve fonksiyonlarını kriyojenik elektron mikroskobu ile analiz etme yöntemini. Bu boru hattı, ilaç geliştirme için hedefli tedavilerin temelini oluşturur.

Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı

Daha fazla video keşfet