Name: Kemirgen Miyositlerde Kardiyak Kasılma Disfonksiyonu ve Ca2+ Geçicilerinin Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Öğrenin, kemirgen kardiyomiyositlerinde sarkomer uzunluğu ve kalsiyum geçişleri ölçerek kontraksiyon fonksiyonunu değerlendirin. Bu yöntem, kalp yetmezliği mekanizmalarını ve tedavi stratejilerini anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe R01 HL144777 (MVW) tarafından desteklenmektedir.

Kemirgenler üzerinde yapılan çalışmalar, İnsancıl Bakım ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmet Politikası'nı izlemiş ve Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için, miyositler 3-34 aylık Sprague-Dawley ve ≥ 200 g5 ağırlığındaki F344BN sıçanlarından izole edildi. Hem erkek hem de kadın oranları kullanıldı.
1. Kasılma fonksiyonu çalışmaları için miyosit pacing
<ol><li>Her bir izole miyosit seti için taze M199 bazlı ortamlar yapın (Malzeme Tablosu). Tempodan 1 gün önce, plaka 2 x 104 Ca 2+ toleranslı, çubuk şeklindeki miyositler 22 mm2 laminin kaplı cam kapaklar (CSs), daha önce açıklandığı gibi8.</li>
	<li>Odaları hazırlamak için, her odayı 1 saat boyunca% 10 ağartıcıya batırın. Daha sonra, odaları 30-45 dakika boyunca akan musluk suyuyla yıkayın, ardından 30 dakika boyunca her 5 dakikada bir değiştirilen damıtılmış su, ardından 30 dakika boyunca her 5 dakikada bir değiştirilen deiyonize su ve deiyonize suda son bir durulama.</li>
	<li>Odaları temiz bir yüzeyde 20-30 dakika kurutun (Ek Şekil 1A-C). Daha sonra, UV odaları bir biyogüvenlik kabininde her yönde 5 dakika boyunca (toplam = 20 dakika) işlemden geçirir. Önceden sterilize edilmiş odalar için bu adıma gerek yoktur. DİKKAT: UV ışınlarına maruz kalmayı en aza indirmek için bölgeyi terk edin.</li>
	<li>Kapağı hazneden çıkarın, her bir oyuğa 3 mL M199 bazlı ortam ekleyin (Ek Şekil 1B'ye bakınız), kapağı değiştirin ve odayı %5 CO 2 ve %20 O2 ile 37 °C'lik bir inkübatörde önceden ısıtın.</li>
	<li>Forsepsleri sıcak boncuk sterilizatöründe 250 °C'de 20-25 s için sterilize edin. Önceden ısıtılmış stimülasyon odasını inkübatörden bir biyogüvenlik kabinine aktarın.</li>
	<li>Kardiyak miyositler içeren her bir kapak kaymasını (CS), steril forseps kullanarak stimülasyon odasındaki bireysel kuyucuklara aktarın. CSs'yi bir seferde dört kez aktarın, ardından ortam sıcaklığını korumak için kalan dört CS'nin aktarılmasından önce 10 dakika ısıtılır.</li>
	<li>Muz krikolarını bir ucundaki stimülasyon odasına (Ek Şekil 1C) ve diğer ucundaki uyarıcıya (Ek Şekil 1D) takın.</li>
	<li>Stimülatör frekansını 0.2 Hz'e ayarlayın ve bir kuyu içindeki çubuk şeklindeki tüm kardiyak miyositlerin ~% 10 -% 20'sinde kasılma sağlamak için voltajı (~ 12 V) ayarlayın. Kasılma miyositlerinin sayısını belirlemek için, odayı 4x ila 10x büyütme ile ters çevrilmiş bir mikroskop altına yerleştirin.</li>
	<li>Stimülasyon odasını 37 °C'de bir inkübatöre% 5 CO2'ye yerleştirin (Ek Şekil 1E). 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde20-25 dakika önceden ısıtılmış ortam kullanarak medyayı her 12 saatte bir değiştirin. Her 12 saatte bir değiştirilen medya ile 3 güne kadar elektriksel stimülasyona devam edin.</li>
</ol>2. Erişkin sıçan kardiyak miyositlerinin kontraktil fonksiyon analizi
<ol><li>Deneyden önce bir jel paketini ve ortamı 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca önceden ısıtın.</li>
	<li>Malzeme Tablosunda listelenen ve Ek Şekil 2'de gösterilen kasılma fonksiyonu platform bileşenlerini, derin kırmızı (590 nm) filtreli ters çevrilmiş bir mikroskopla titreşim önleyici bir tablo (Ek Şekil 2A-1) ve bir CCD denetleyicisine bağlı CCD kamerayı (Ek Şekil 2A-4) içeren temel bileşenlere özel dikkat göstererek açın (Ek Şekil 2A-5 ve Ek Şekil 2C-5) ve bir PC bilgisayarla entegre edilmiştir (Ek Şekil 2B-14).</li>
	<li>Boruyu peristaltik pompaya monte edin (Ek Şekil 2A-8; Ek Şekil 2A-8), önceden ısıtılmış jel paketini tüp tutucuya aktarın (Ek Şekil 2A-9) ve vakumu açın (Ek Şekil 2A-11) ve hücre uyarıcısına güç (Ek Şekil 2B-13).</li>
	<li>Yalıtımlı tüp tutucusuna ortam içeren 50 mL'lik bir tüp yerleştirin (Ek Şekil 2A-9) ve peristaltik pompa borusundan ~ 0,5 mL / dak'da perfüzyona başlayın (Ek Şekil 2E-8).</li>
	<li>Küçük bir tartım teknesine (~2 mL) az miktarda önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Miyositler içeren bir CS'yi stimülasyon odasından tartım teknesine aktarın. %5 CO2 inkübatöründe stimülasyon odasını 37 °C'ye geri döndürün.</li>
	<li>CS'yi tartım teknesinden çıkarın ve alt tarafı nazikçe silin. CS'yi yeni yağlanmış bir CS odasına aktarın (Ek Şekil 2A, F-10; siyah ok) ve CS'ye nazikçe bir damla ortam (~ 200 μL) ekleyin.</li>
	<li>CS'nin üzerine bir platin elektrot montajı yerleştirin (Ek Şekil 2F; gri ok) ve forseps kullanarak üstüne yeni bir CS yerleştirin. CS sandviçinin üzerine bir üst montaj (Ek Şekil 2F; beyaz ok) yerleştirin ve ardından haznenin montajını bitirmek için iki veya dört #0 pan başlı vida takın.</li>
	<li>Medya pompa borusu boyunca mevcut olduğunda, boruyu ön ısıtıcıya takın ve ardından ön ısıtıcıyı adım 2.7'de monte edilen CS odasına bağlayın. Perfüzyona 0,5 mL / dak'da başlayın ve sızıntı olmadığından emin olmak için odanın altına bir mendil mendil yerleştirin.</li>
	<li>CS odasını sahne alanı adaptörüne yerleştirin. Perfüze edilmiş ortam, odanın karşı ucunda, bir vakum sistemine bağlı boru ile toplanır. Isıtma sistemini açın (Ek Şekil 2A, D-7) ve 37 ° C'lik sabit bir ortam sıcaklığı elde etmek için odayı, hedefi ve ön ısıtıcıyı ~ 5-10 dakika boyunca dengeleyin. Bu denge süresi boyunca mikroskopta 40x suya daldırma hedefi ile miyositleri görselleştirin.</li>
	<li>Voltajı, çubuk şeklindeki hücrelerin% 80'inin büzülmesi için gereken ayarın 1.5 katına ayarlayarak pacing stimülatörü etkinleştirin (Ek Şekil 2B-13), tipik olarak 35-40 V. Kasılma fonksiyonunu ve miyosit sağkalımını optimize etmek için stimülasyon frekansını 0.2 Hz'ye ayarlayın.</li>
	<li>Sürekli perfüze edilmiş ve tempolu miyositlerden kontraktil kısalma ve yeniden uzatma izlerini toplayın. Kısaltma ölçümlerini toplamak için, bir CCD denetleyicisine bağlı bir CCD kamera (Ek Şekil 2A-4) (Ek Şekil 2B-5,C) ve G/Ç denetleyici kartına sahip özel bir bilgisayar kullanın (Ek Şekil 2B-14; bkz. Platform, sıçan miyositlerinde sarkomer kısalmasını ölçer, ancak benzer sonuçlar miyositlerin uzunlamasına kenarlarından toplanan miyosit ölçümlerinden elde edilir (bkz.</li>
	<li>Sarkomer kısaltma izlerini toplamak için, bilgisayarda yazılımı açın, Tamam'ı seçin ve ardından Dosya Yeni>. Sarcomere Uzunluğu > İzlemeler > Kullanıcı Sınırlarını Düzenle'yi seçip ardından genellikle 2,0 μm ile 1,5 μm arasında olan maksimum ve minimum değerleri ayarlayarak bir ekran şablonu hazırlayın. Miyositlerde ölçüm yapmadan önce CCD kamerayı 0,01 mm gratikül ile kalibre edin (Şekil 1D).</li>
	<li>Sarkomer uzunluğu izlerini kaydetmek için Dosya > Yeni'yi seçin. Kasılma yapan bir miyositi tanımlayın ve miyositi kameranın uzunlamasına ekseni boyunca konumlandırın, böylece çizgilenme paterni dikey olur (Şekil 1B).</li>
	<li>İlgi alanı (ROI) kutusunu (pembe kutu) miyositin üzerine yerleştirmek için bilgisayar faresini kullanın (Şekil 1C). Kasılma işlevini kaydetmek için Topla ve Başlat'ı seçin. Düşük stimülasyon frekanslarında (≤0.5 Hz) her miyositten 60 s kısalmayı kaydedin.</li>
	<li>CS başına 5-10 hücreden sarkomer kısalmasını kaydedin. Çalışmalar agonistler / antagonistlerle tedaviyi içeriyorsa, 1 hücre / CS'de ölçümler yapın. Önceden ısıtılmış ayrı bir ortam ve çok kanallı bir peristaltik pompaya yüklenen farklı, özel bir perfüzyon borusu parçası hazırlayın ve 2.9.-2.14 adımlarını izleyin. ilaç veya nörohormon iletiminin miyosit kontraktil fonksiyonu üzerindeki etkisini ölçmek.</li>
	<li>Bir frekans aralığında kısalmayı ölçmek için,5'i kaydetmeden önce kararlı durum kısalması elde etmek için her frekansta miyositleri hızlandırın. Bu çalışmalar için, perfüzyon hızını iki katına çıkarın ve 0.2 Hz ve 2 Hz aralığındaki frekanslar için tutarlı kararlı durum kontraktil yanıtları elde etmek için yeni bir frekansta stimülasyondan sonra 15-20 s kaydetmeye başlayın. tipik olarak, verilen stimülasyon frekansları aralığında kısaltmak için en fazla 2 miyosit / CS kaydedin.</li>
	<li>Kayıtları analiz ederken güvenilir sinyal ortalamalı veriler elde etmek için en az 7 kasılma/hücre kaydedin (bkz. adım 3.).</li>
</ol>3. İzole miyositlerde kontraktil fonksiyonun veri analizi
<ol><li>Başlamak için Dosya'yı seçin, kaydedilmiş bir izleme seçin ve ardından Aç'ı seçin. Temel izlemenin Sekme 1'ini (sol taraf) seçin ve ardından izlemenin üst kısmındaki sarı paneli Sarc Uzunluğu olarak ayarlayın. İzlemeler'i ve adım 2.12'de hazırlanan ekran şablonunu seçin.</li>
	<li>Bir analiz şablonu hazırlamak için, t0'ın Tanımı kutusunda İşlemler, Monotonik Geçici Analiz Seçenekleri, TTL Olay İşareti'ni ve menüden aşağıdaki seçenekleri seçin: Temel (dinlenme sarkomer uzunluğu), t0'a göre kalkış hızı (dep v), Tepe (tepe yüksekliği ve %tepe yüksekliği/taban çizgisi veya bl%peak h), tPeak'e göre dönüş hızı (ret v), t0 kullanarak Zirveye Ulaşma Süresi %50 (TTP %50) ve tPeak kullanarak Taban Çizgisine Kadar Olan Süre %50 (TTR%50). Şablonlar > Analiz Şablonunu tanımlayıcıyla kaydet'i seçerek bu analiz seçeneklerini kaydedin. Her izlemeyi çözümlemeden önce bu çözümleme şablonunu yükleyin.</li>
	<li>Veri analizine başlamak için İşaretler > Kapısı'nı seçin > Olay İşareti > Analiz Aralığından Geçici > Dönüştür Ekle'yi seçin. Şimdi 0,2 Hz'de tempolu miyositler için -0,01 s ile 1,20 s arasında zaman aralığını ayarlayın (Şekil 2A, ham izin alt kısmındaki kırmızı işaretler). Daha yüksek frekanslarda uyarılan miyositler için daha kısa bir zaman aralığı seçin.</li>
	<li>İşlemler > Ortalama Olaylar'ı seçerek sinyal ortalamalı bir izleme oluşturun. Sinyal ortalamalı bir kayıt, orijinal temel izlemenin altında görünür.</li>
	<li>Sinyal ortalaması alınan izlemenin (ekranın sol tarafı) Sekme 1'ini seçin ve ardından üst menüden İşaretler'i ve ardından Geçici Ekle'yi seçin. Sinyal ortalamalı görüntüleme panelinde temel sarkomer uzunluğu, tepe yüksekliği, bl%peak h, dep v, ret v, TTP %50 ve TTR%50 için sinyal ortalaması değerlerini görüntülemek üzere üst menüden İşlemler'i ve Monotonik Geçici Analiz'i seçin.</li>
	<li>Her sarkomer geçici analizini, Pano Akımı > Monotonik Geçici Analizi Dışa Aktar'ı seçerek çoklu miyositlerin kompozit analizi > bir elektronik tabloya aktarın. Her izleme için bu verileri e-tabloya yapıştırın.</li>
	<li>Sinyal ortalamalı izlemeyi kopyalamak için, Geçerli İzleme > Pano > Seçenekleri> Dışa Aktar'ı seçin ve ondalık basamakları 5 olarak ayarlayın, ardından Sekmeler Sınırlayıcısı'nı seçin ve Tamam'ı ve Tamam'ı tıklatın. Her miyosit kaydı için sinyal ortalamalı izleri ikinci bir elektronik tabloya yapıştırın.</li>
</ol>4. Sıçan yetişkin kardiyak miyositlerinde Ca2+ geçicilerinin kaydedilmesi
<ol><li>Ca 2+ geçicilerini ölçmeden önce, adım 2.2.'de açıklanan platform bileşenlerini ek floresan görüntüleme bileşenleriyle birlikte açın (Malzeme Tablosundaki Ca 2+ görüntüleme analizi için ek bileşenlere bakın; Ek Şekil 2A-5,6; 2B-12).</li>
	<li>Dimetilsülfoksit (DMSO) içinde 1 mM Fura-2AM artı 0.5 M probenecid içeren Fura-2AM stok çözeltisini hazırlayın. Probenecid, Fura-2AM sızıntısı15'i en aza indirir.</li>
	<li>Stok çözeltisini, 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda 2,5 mL ortamda 5 μM Fura-2AM ve 2,5 mM probenecid'e kadar seyreltin (bkz. Plakadaki üç ek kuyucuğa tek başına 2,5 mL ortam ekleyin (Fura-2AM yok), plakayı alüminyum folyo ile örtün ve ortamı önceden 37 ° C'ye ısıtın.</li>
	<li>Pacing odasından Fura-2AM içeren kuyuya miyosit içeren bir CS aktarın, örtün ve plakayı 4 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatöre geri koyun. Perfüzyon pompasına boru monte edin ve adım 2.4'te açıklandığı gibi Fura-2AM yükleme süresi boyunca medya ile perfüze edin.</li>
	<li>Floresan fotobeyazlatmayı azaltmak ve floresan sinyalini optimize etmek için oda ışıklarını kapatın veya en aza indirin. 6 delikli plakayı inkübatörden çıkarın ve ardından CS'yi yalnızca ortam içeren üç kuyucuğun her birinde 10 s yıkayın. CS'yi önceden ısıtılmış ortam içeren küçük bir tartım teknesine aktarın (Fura-2AM eklenmemiştir).</li>
	<li>CS'nin alt tarafını nazikçe sildikten sonra CS'yi yeni yağlanmış CS odasına monte edin. CS'ye nazikçe bir damla ortam ekleyin ve ardından elektrot montajını CS üzerine monte edin, ardından ikinci bir CS ve üst montaj yapın. Adım 2.6.-2.7'de açıklandığı gibi, hücre odasını monte etmeyi bitirmek için #0 pan başlı vidaları kullanın.</li>
	<li>Ortamla doldurulmuş pompa borusunu ön ısıtıcıya bağlayın, ön ısıtıcıyı CS odasına bağlayın ve adım 2.8'de açıklandığı gibi bir sahne adaptörüne yerleştirin. Ortamı vakum boru sistemi ile toplayın ve 2.8.-2.9 adımlarında açıklandığı gibi odayı 37 ° C'ye dengelemek için ısıtma sistemini açın (Ek Şekil 2A, D-7).</li>
	<li>Adım 2.10'da açıklandığı gibi 35-40 V ve 0,2 Hz'ye ayarlanmış hız uyarıcısını (Ek Şekil 2B-13) etkinleştirin.</li>
	<li>Ca2+ geçici kayıt yapmadan önce, klavyeyi görmenize yardımcı olması için bilgisayar klavyesinin yanına monte edilmiş küçük bir el fenerini veya kitap ışığını açın. Ek olarak, floresan arka planını kardiyak miyositlerin olmadığı bir alanda kaydedin. Başlamak için, adım 2.12'de açıklandığı gibi Dosya > Başlat > Yeni'yi seçin.</li>
	<li>Bir YG seçin ve ham pay için bir sekme (veya izleme çubuğu, sol taraf) ve ham payda için her sekmenin üst merkezinde tanımlanan ikinci bir sekme ayarlayın. Arka planı 10-20 s için kaydedin. Ham sinyal ortalamasına sahip pay ve payda değerlerini elde etmek için fareyi sağ tıklatın ve bir izleme çubuğu panelinin üzerine sürükleyin. İşlemler > sabitlerini seçerek bu değerleri girin ve ham değerleri girin.</li>
	<li>Hem kısaltma hem de Ca2+ geçicileri toplamak için yeni bir ekran şablonu hazırlayın. Sarkomer uzunluğu için Sekme 1'i seçin ve adım 2.13'te açıklandığı gibi aynı işlemi kullanın. Ca2+ görüntüleme için, genellikle 1 ile 5 arasında ayarlanan oran için minimum ve maksimum düzeyleri ayarlamak üzere Sekme 2 > Oranı (sekmenin üst ortası) > İzlemeler > Kullanıcı Sınırlarını Düzenle'yi seçin. 3. ve 4. sekmelerin (sol taraf) payda ve payda aralıklarını tanımlamak için aynı işlemi kullanın.</li>
	<li>Adım 2.14'te açıklandığı gibi bir ROI kutusunu miyosit görüntüsünün üzerine yerleştirin. Dosya > New > Collect'i seçin. Şimdi kısaltma ve ratiometric Ca2+ verilerini toplamak için Başlat'ı seçin. Sinyal ortalamalı analiz için ≥7 kasılma/hücre kaydedin.</li>
	<li>Adım 4.10'da açıklanan arka plan izleme kaydını yineleyin. 2-4 miyosit kaydettikten sonra. Tipik olarak, arka plan okumasında önemli değişiklikler varsa, 4-5 miyosit / CS veya daha az miyosit kaydedin.</li>
</ol>5. İzole miyositlerde Ca2+ geçicilerinin veri analizi.
<ol><li>Analiz için istediğiniz dosyayı açın ve kısaltma için Şablonlar > Ekran Şablonu artı Ca2+ geçicileri seçin. Ardından, sırasıyla sarkomer uzunluğunu ve Ca 2+ oranını göstermek için sekme 1 ve2'yi (solda) seçin. İşlemler > Sabitleri'ni seçin ve Ca2+ arka plan izlemesinden pay ve payda değerlerini girin.</li>
	<li>Kısaltma için analiz şablonları ve Ca2+ geçici veriler hazırlayın. Sekme 1'i (sol taraf) seçin ve adım 3.2'de açıklandığı gibi aynı işlemi kullanın. Sarkomer uzunluk analizi şablonunu ayarlamak için.</li>
	<li>Sekme 2'yi (sol taraf) seçin ve t0 tanımı kutusunda İşlemler, Monotonik Geçici Analiz Seçenekleri, TTL olay işaretini ve menüden aşağıdaki seçenekleri seçin: Temel (bazal oran), t0'a göre kalkış hızı (dep v), Tepe (tepe yüksekliği ve %tepe yüksekliği/taban çizgisi veya bl%peak h), tPeak'e göre bozunma hızı (ret v), t0 kullanarak Zirveye Ulaşma Süresi %50 (TTP %50) ve tPeak kullanarak Taban Çizgisine Kadar Olan Süre %50 (TTR%50). Şablonlar ve Analiz Şablonunu yeni bir tanımlayıcı adı kullanarak Kaydet'i seçerek bu analiz seçeneklerini kaydedin. Her izlemeyi çözümlemeden önce bu çözümleme şablonunu yükleyin.</li>
	<li>Adım 3.3.-3.6'da açıklandığı gibi aynı işlemi kullanın. sinyalin ortalamasını almak ve ardından sarkomer uzunluğunu analiz etmek, ardından Ca2 + geçicileri için aynı adımları izlemek. Sarkomer uzunluğu ve Ca2+ geçici oran izi için ayrı işaretler ayarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Reihle, C., Bauersachs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+models+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Small animal models of heart failure.</a> Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).</li>
<li>Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+cardiac+myocyte+in+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Biology of the cardiac myocyte in heart disease.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).</li>
<li>Rossman, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+frequency-dependent+responses+represent+the+pathophysiologic+signature+of+contractile+failure+in+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).</li>
<li>McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+myofilament+contractile+function+in+human+donor+and+failing+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 468(2020).</li>
<li>Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+contractile+dysfunction+and+protein+kinase+C-mediated+myofilament+phosphorylation+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging.</a> The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).</li>
<li>Chaudhary, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+myocardial+Ca2%2B+cycling+after+left+ventricular+assist+device+support+in+failing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).</li>
<li>Walker, C. A., Spinale, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+function+of+the+cardiac+myocyte%3A+A+review+of+fundamental+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).</li>
<li>Lang, S. E., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).</li>
<li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+heart+performance+by+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Designing heart performance by gene transfer.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).</li>
<li>Sweitzer, N. K., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+loaded+shortening+velocity+in+single+cardiac+myocytes+permeabilized+with+a-hemolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin.</a> Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unloaded+shortening+increases+peak+of+Ca2%2B+transients+but+accelerates+their+decay+in+rat+single+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).</li>
<li>Racca, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+developing+human+fetal+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle.</a> The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).</li>
<li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+expression+and+basal+lamina+remodeling+in+human+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure.</a> Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).</li>
<li>Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody+effects+on+cellular+function+of+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e4237(2013).</li>
<li>Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+future+of+probenecid%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The history and future of probenecid.</a> Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Sakthivel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+analysis+of+cardiac+troponin+I+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B-ATPase+during+progression+of+left+ventricular+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy.</a> The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).</li>
<li>Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+basis+of+Starling%27s+law+of+the+heart%3A+the+role+of+the+sarcomere+is+determining+ventricular+size+and+stroke+volume%5BTitle%5D)+AND+%22American+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume.</a> American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).</li>
<li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).</li>
<li>Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+myofibrillar+proteins+in+the+normal+and+hypertrophic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart.</a> Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).</li>
<li>Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shortening+and+%5BCa2%2B%5D+dynamics+of+left+ventricular+myocytes+isolated+from+exercise-trained+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).</li>
</ol>

Yazarların rakip finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Adım 1'de özetlenen kronik pacing protokolü, izole miyositleri incelemek ve daha uzun tedavilerin etkisini değerlendirmek için yararlı süreyi uzatır. Laboratuvarımızda kronik tempolu miyositlerde sarkomer uzunluğu kullanılarak kontraktil fonksiyon ölçülürken izolasyondan 4 gün sonrasına kadar tutarlı sonuçlar elde edilmiştir. Bununla birlikte, miyositleri hızlandırmak için 1 haftadan daha eski medya kullanıldığında miyosit kontraktil fonksiyonu hızla bozulur.
Kasılma fonksiyonu çalışmaları içi...

Kardiyak pompa fonksiyonunun analizi, özellikle kalp yetmezliğinin (HF) hayvan modelleri için yeterli içgörü elde etmek için genellikle bir dizi yaklaşım gerektirir. Ekokardiyografi veya hemodinamik ölçümler in vivo kardiyak disfonksiyon1 hakkında fikir verirken, in vitro yaklaşımlar genellikle disfonksiyonun miyofilament ve / veya uyarma eşleşmesinden sorumlu Ca2 + geçici veya kontraktil fonksiyonlu aksiyon potansiyelindeki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için kullanılır (örneğin, uyarma-kasılma [E-C] bağlantısı). İn vitro yaklaşımlar ayrıca, pahalı ve / veya zahmetli in vivo tedavi stratejilerini takip etmeden önce nörohormonlara, vektör kaynaklı genetik değişikliklere ve potansiyel terapötik ajanlara2 fonksiyonel yanıtı tarama fırsatı sunar.
İn vitro kontraktil fonksiyonu araştırmak için, sağlam trabekül3 veya geçirgenleştirilmiş miyositler4'te kuvvet ölçümlerinin yanı sıra, HF 5,6'nın varlığında ve yokluğunda sağlam miyositlerde yüksüz kısalma ve Ca2 + geçicileri de dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar mevcuttur. Bu yaklaşımların her biri, kardiyak pompa fonksiyonu 2,7'den doğrudan sorumlu olan kardiyak miyosit kontraktil fonksiyonuna odaklanmaktadır. Bununla birlikte, hem kasılma hem de E-C eşleşmesinin birlikte analizi, çoğunlukla izole edilmiş, Ca 2 + toleranslı yetişkin miyositlerde kas uzunluğunun ve Ca2 + geçicilerinin kısalmasını ölçerek gerçekleştirilir. Laboratuvar, bu adım8 için miyositleri sıçan kalplerinden izole etmek için ayrıntılı bir yayınlanmış protokol kullanmaktadır.
Hem Ca2+ geçici hem de miyofilamentler, sağlam miyositlerde kısalmaya ve yeniden uzamaya katkıda bulunur ve kontraktil disfonksiyona katkıda bulunabilir 2,7. Bu nedenle, in vitro fonksiyonel analiz, Ca2+ bisiklet makinesini ve miyofilamentleri içeren sağlam bir miyosit gerektirdiğinde bu yaklaşım önerilir. Örneğin, bozulmamış izole miyositler, gen transferi9 yoluyla miyofilament veya Ca2 + döngü fonksiyonunu değiştirdikten sonra kasılma fonksiyonunu incelemek için arzu edilir. Ek olarak, aşağı akış ikinci haberci sinyal yollarının ve / veya terapötik ajanlara yanıtın etkisini incelerken nörohormonların fonksiyonel etkisini analiz etmek için sağlam bir miyosit yaklaşımı önerilmektedir2. Tek miyositlerde yüke bağlı kuvvetin alternatif bir ölçümü, Ca2 + geçici katkısını ortadan kaldırmak ve miyofilamentfonksiyonuna odaklanmak için en sık düşük sıcaklıklarda (≤15 ° C) membran geçirgenliğinden (veya deriden kaplamadan) sonra gerçekleştirilir. Sağlam miyositlerde yüke bağımlı kuvvet artı Ca2 + geçicilerinin ölçümü, özellikle nörohormon sinyallemesine verilen yanıtları ölçmek veya terapötik ajanlar için bir ekran olarak daha yüksek verime ihtiyaç duyulduğunda, yaklaşım11'in karmaşık ve teknik zorluğu nedeniyle nadirdir. Kardiyak trabeküllerin analizi bu teknik zorlukların üstesinden gelir, ancak miyosit olmayan, fibroz ve / veya hücre dışı matriks yeniden şekillenmesinden de etkilenebilir2. Yukarıda açıklanan yaklaşımların her biri, yetişkin miyositleri içeren bir preparat gerektirir, çünkü yenidoğan miyositleri ve indüklenebilir pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilen miyositler, yetişkin miyofilament proteinlerinin tam tamamlayıcısını henüz ifade etmemektedir ve genellikle yetişkin çubuk şeklindeki miyosit2'de bulunan miyofilament organizasyon seviyesinden yoksundur. Bugüne kadar, iPSC'lerdeki kanıtlar, yetişkin izoformlarına tam geçişin kültür12'de 134 günden fazla olduğunu göstermektedir.
Bu koleksiyonun HF üzerindeki odağı göz önüne alındığında, protokoller, başarısız olan ve başarısız olmayan sağlam miyositlerdeki kontraktil fonksiyonu ayırt etmek için yaklaşımlar ve analizler içerir. Temsili örnekler, daha önce5,13 olarak tarif edilen, böbrek üstü koarktasyondan 18-20 hafta sonra çalışılan sıçan miyositlerinden verilmiştir. Daha sonra sahte muamele görmüş sıçanlardan miyositlerle karşılaştırmalar yapılır.
Burada tarif edilen protokol ve görüntüleme platformu, HF gelişimi sırasında çubuk şeklindeki kardiyak miyositlerde kısalma ve Ca2+ geçicilerindeki değişiklikleri analiz etmek ve izlemek için kullanılır. Bu analiz için, 2 x 104 Ca2 + toleranslı, çubuk şeklindeki miyositler, 22mm2 laminin kaplı cam kapaklar (CSs) üzerine kaplanır ve daha önce açıklandığı gibi gece boyunca kültürlenir8. Bu görüntüleme platformu için monte edilen bileşenler, optimum görüntüleme için kullanılan ortam ve tamponlarla birlikte, Malzeme Tablosunda verilmiştir. Bir yazılım kullanarak veri analizi için bir kılavuz ve temsili sonuçlar da burada sağlanmaktadır. Genel protokol ayrı alt bölümlere ayrılmıştır, ilk üç bölüm izole sıçan miyositlerine ve veri analizine odaklanır, bunu miyositlerde hücresel Ca2 + geçici deneyler ve veri analizi izler.

<table><tbody><tr><td>MEDIA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma (Roche)</td><td>3117057001</td><td>Son konsantrasyon =% 0.2 (a / h)</td></tr> <tr><td>Glutatyon</td><td>Sigma</td><td>G-6529</td><td>Son konsantrasyon = 10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td>Nihai konsantrasyon = 15 mM</td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M-2520</td><td>1 şişe 1 L yapar; pH 7.45</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S-8875</td><td>Nihai konsantrasyon = 4 mM</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Fisher</td><td>15140122</td><td>Son konsantrasyon = 100 U / mL penisilin, 100 & mu; g / mL streptomisin</td></tr><tr><td><güçlü > ÖZELLIKLE CA 2 + GÖRÜNTÜLEME IÇIN REAKTİFLER< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Dimetilsülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma ve nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>İnvitrojen (Moleküler Problar)</td> <td>F1221</td><td>50 & mu; g/şişe; &nbsp; DMSO'da 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid stok çözeltisi hazırlayın; &nbsp; Ortamdaki son Fura2-konsantrasyonu&nbsp; 5 &mu; M</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Invitrogen (Fisher)</td> <td>P36400</td><td>1 mM Fura-2AM stoğuna 7.2 mg probenicid (0.5 M) ekleyin; Ortamdaki nihai konsantrasyon 2,5 mM'dir</td></tr><tr><td><güçlü> SIÇAN MIYOSİT PACING İÇİN MALZEMELER< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td># 1 22 & nbsp; mm 2 cam lameller</td><td>Corning</td><td>2845-22</td><td></td></tr><tr><td>3 x 36 inç muz jaklı kablolar</td><td>Pomona Electronics</td><td>B-36-2</td><td>Ek Şekil 1, panel C</td></tr><tr><td>37oC İnkübatör&nbsp; % 95 O < alt> 2< / alt>:% 5 CO<alt>2< / alt>&nbsp;</td><td>Forma</td><td>3110</td><td>Ek Şekil 1, panel E.&nbsp; Birden fazla model uygundur</td></tr><tr><td>Sınıf II A/B3 UV lambalı biyogüvenlik kabini</td><td>Forma</td><td>1286</td><td>Birden fazla model uygundur</td></tr><tr><td>Forseps - Dumont #5 5/45</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Sıcak boncuk sterilizatörü</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>1800-45</td><td></td></tr><tr><td>Düşük büyütmeli ters mikroskop</td><td>Leica</td><td>DM-IL&nbsp;</td><td>Bu mikroskobu inkübatöre bitişik olarak konumlandırın, böylece tempolu miyositleri pacing başlangıcında ve ortam değişikliklerinden sonra kasılma açısından izleyin; &nbsp; 4X ve 10X hedefleri önerilir</td></tr><tr><td>Pacing odası</td><td>Özel</td><td></td><td>Ek Şekil 1, panel A. Ionoptix C-pace sistemi ticari olarak temin edilebilen bir alternatiftir veya bakınız 22</td></tr><tr><td>Stimülatör</td><td>Ionoptix</td><td>Myopacer</td><td>Ek Şekil 1, panel D.</td></tr><tr><td><KASILMA FONKSİYONU İÇİN GÜÇLÜ>MALZEMELER ve/veya Ca2+ GÖRÜNTÜLEME ANALİZİ</td><td></td><td></td><td>ID Ek Şekil 2 & Alternatifler/Önerilen Seçenekler</td></tr><tr><td>Ca2+ görüntüleme analizi için ek bileşenler</td><td>Ionoptix</td><td>Essential sistem bileşenleri: -- Foton sayma sistemi&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; --&nbsp; Çift uyarma ışık kaynağı ile Xenon güç kaynağı&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; --&nbsp; Floresan arayüzü</td><td>&nbsp;- Foton sayma sistemi bir fotoçoğaltıcı (PMT) tüpü ve dikroik ayna içerir ve CCD kameranın yanına monte edilir&nbsp; (panel A #4).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Ksenon ampul ışık kaynağı için güç kaynağı (bkz. panel A #5 ve panel C, solda), panel A #6'da gösterilen çift uyarma arayüzü (340/380 nm&nbsp; uyarma ve 510 nm emisyon) ile entegre edilmiştir. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Bilgisayar arasındaki floresan arayüzü ve&nbsp; ışık kaynağı panel B, #12'de gösterilmiştir.</td></tr><tr><td>Görüntü toplama&nbsp; donanım ve yazılıma sahip CCD kamera (240 kare/sn)</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td>CCD denetleyicili Myocam&nbsp;</td><td>Myocam ve CCD denetleyicisi Ek Şekil 2, panel A #4&nbsp; ve&nbsp; panel A #5 & panel C #5'te (sağda) sırasıyla gösterilmiştir.&nbsp; Kontrolör bir PC bilgisayar sistemi ile entegre edilmiştir (panel B #14).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Oda stimülatörü</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td>Miyopak</td><td>Panel B, #13; Alternatif:&nbsp; Çim modeli S48</td></tr><tr><td>Lamel montajlı perfüzyon haznesi</td><td>22 mm 2 için özel hazne, silikon adaptörlü lamel ve 2-4 Phillips tava başlı #0 vida&nbsp; (ok, panel F)</td><td></td><td>Panel A #10 & panel F; &nbsp; &nbsp; Oda sıcaklığı, bir TH-10Km probu ve TC2BIP sıcaklık kontrolörü kullanılarak 37oC'ye kalibre edilir (bkz. sıcaklık kontrol cihazı).&nbsp; Ticari alternatifler:&nbsp; Ionoptix FHD veya C-stim hücresi&nbsp; odalar; Cell MicroControls kültür stimülasyon sistemi</td></tr><tr><td>Fonksiyon/Ca2+ geçici akımlarının veri toplama ve analizi için özel bilgisayar ve yazılım</td><td>Ionwizard</td><td>PC kartı ve yazılımı ile Ionoptix PC</td><td>Panel B, #14; Kasılma fonksiyonu, IonWizard yazılımının SarcLen (sarkomer uzunluğu) veya SoftEdge (miyosit uzunluğu) edinme modülleri kullanılarak ölçülür. Ionwizard yazılımı ayrıca ratiometric&nbsp; için PMT edinim yazılımını da içerir; Fura<2AM yüklü myoyctes'te Casup>2+ görüntüleme. - Somputer ve hücre stimülatörünü barındırmak için 4 direkli elektronik raf montajlı kabin ve raflar önerilir.&nbsp; Ca2+ görüntüleme için floresan arayüzü de bu kabine yerleştirilmiştir (aşağıya bakın).</td></tr><tr><td>Forseps - Dumont #5 TI</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-40</td><td>Panel F</td></tr><tr><td>Medya için yalıtımlı tüp tutucu</td><td>Özel</td><td></td><td>Panel A # 9; Bu tutucu, strafor ve strafor kullanılarak kolayca monte edilir. Ortamı sıcak tutmak için önceden ısıtılmış bir jel paketi</td></tr><tr><td>Ters çevrilmiş parlak alan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>TE-2000S</td><td>Ca2+ görüntüleme için epi-floresan için dönen bir taret (Panel A #2) takın.&nbsp; &nbsp; Ca2+ görüntüleme sırasında floresan ağartmayı en aza indirmek için koyu kırmızı (590 nm) bir kondenser filtresi de önerilir.</td></tr><tr><td>İzolatör Masası</td><td>TMC Titreşim Kontrolü</td><td>30 x 36 inç</td><td>Panel A, #1; Arzu edilen:&nbsp; yükseltilmiş raflar, Faraday koruması&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop göz mercekleri ve objektif</td><td>Nikon</td><td>10X CFI göz mercekleri 40X su CFI Planı Fluor objektif</td><td>Panel A #3; 40X objektif:&nbsp; n.a. 0.08; w.d. 2 mm.&nbsp; Objektifin etrafına bir Cell MicroControls HLS-1 objektif ısıtıcısı monte edilmiştir (aşağıdaki sıcaklık kontrol cihazına bakın).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NOT:&nbsp; Suya daldırma sebilleri de artık su bazlı hedefler için mevcuttur.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td>Panel A # 8 ve panel E</td></tr><tr><td>küçük kantar Fisher</td><td>&nbsp;</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrol cihazı</td><td>Cell MicroControls</td><td>TC2BIP</td><td>Panel A #7; Panel D. Bu sıcaklık kontrol cihazı, lamel odasını 37 oC.&nbsp; &nbsp; &nbsp; Bu platform için bir ön ısıtıcı ve objektif ısıtıcı önerilir.&nbsp; A Cell MicroControls HPRE2 ön ısıtıcı ve&nbsp; HLS-1 objektif ısıtıcı kontrollüdür&nbsp; Çalışmalarımız için TC2BIP sıcaklık kontrolörü tarafından.</td></tr><tr><td>Hareket sensörlü dolap altı LED ışık&nbsp;</td><td>Sylvania</td><td>#72423 LED ışığı</td><td>Minimum oda ışığı altında Ca2+ geçici görüntüleme sırasında veri toplama için önerilir. &nbsp; Alternatif:&nbsp; Esnek boyunlu el feneri / kitap ışığı üzerinde bir klips - birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Sıralı Ehrlenmeyer şişesi ve koruyucu filtreli vakum hattı</td><td>Fisher</td><td>Tygon hortumu - E363; &nbsp; polipropilen Ehrlenmeyer şişesi - 10-182-50B; Vakum filtresi - 09-703-90</td><td>Panel A #11</td></tr></tbody></table>

kemirgen miyositlerde kardiyak kasılma disfonksiyonu ve ca2+ geçicilerinin analizi

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Kontraktil disfonksiyon ve Ca2+ geçicileri genellikle kardiyak kaynaklı yaralanma ve / veya yeniden modellemenin kapsamlı bir değerlendirmesinin bir parçası olarak hücresel düzeyde analiz edilir. Bu fonksiyonel değişiklikleri değerlendirmek için bir yaklaşım, primer erişkin kardiyak miyositlerde yüksüz kısaltma ve Ca2+ geçici analizleri kullanır. Bu yaklaşım için, yetişkin miyositler kollajenaz sindirimi ile izole edilir, Ca2 + toleranslı hale getirilir ve daha sonra laminin kaplı kapaklara yapıştırılır, ardından serumsuz ortamlarda elektriksel pacing yapılır. Genel protokol yetişkin sıçan kardiyak miyositlerini kullanır, ancak diğer türlerden birincil miyositler için kolayca ayarlanabilir. Yaralı kalplerden kaynaklanan miyositlerdeki fonksiyonel değişiklikler, sahte miyositler ve / veya in vitro terapötik tedavilerle karşılaştırılabilir. Metodoloji, hücre odası ve platform bileşenleri ile birlikte miyosit pacing için gerekli temel unsurları içerir. Bu yaklaşım için ayrıntılı protokol, sarkomer uzunluğu tespiti ile yüksüz kısalmayı ölçme adımlarını ve oranmetrik gösterge Fura-2 ile ölçülen hücresel Ca2 + geçicileri ve ham veri analizini içerir.

Kontraktil fonksiyon çalışmaları, sıçan miyositleri üzerinde izolasyondan sonraki günden (2. gün) başlayarak izolasyondan 4 gün sonrasına kadar yapılır. Miyositler izolasyondan sonraki gün (yani 2. gün) kaydedilebilse de, gen transferinden veya kasılma fonksiyonunu değiştirmek için tedavilerden sonra genellikle daha uzun kültür sürelerigereklidir 8. İzolasyondan sonra 18 saatten fazla kültürlenen miyositler için, bölüm 1'de açıklanan pacing protokolü, t-tübüllerinin ve tutarlı kısaltma ve yeniden ...

İzole sıçan miyositlerinde kalsiyum (Ca2+) geçici ölçümü ile birlikte sarkomer uzunluğu tespiti yoluyla kontraktil fonksiyonun ölçümünü tanımlayan bir dizi protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşımın kalp yetmezliğinin hayvan modellerindeki çalışmalar için uygulanması da dahil edilmiştir.

Kemirgen Miyositlerde Kardiyak Kasılma Disfonksiyonu ve Ca2+ Geçicilerinin Analizi

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Bu yaklaşım, kalp yetmezliğinin gelişimi sırasında kasılma fonksiyonundaki değişiklikleri tespit eder. Miyositlerde nörohormonlara ve potansiyel terapötik ajanlara fonksiyonel yanıt da taranabilir. Miyositin konumlandırılması pratik gerektirebilir, ancak tutarlı sarkomer uzunluğu görüntülemesi elde etmek için gereklidir.Prosedürü gösteren, doçent ve laboratuvarın baş araştırmacısı Margaret Westfall'dur. Deneye başlamadan önce, bir jel paketini ve ortamı bir inkübatörde 37 santigrat derecede 30 dakika önceden ısıtın. Makalede belirtildiği gibi kontraktil fonksiyonlu platform bileşenlerini açın ve boruyu peristaltik pompaya monte edin.Ardından, önceden ısıtılmış jel paketini tüp tutucuya aktarın ve güçteki vakumu hücre uyarıcısına açın. Peristaltik pompa borusundan dakikada 0,5 mililitrede perfüzyona başlamak için yalıtımlı tüp tutucusuna ortam içeren 50 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Daha sonra, küçük bir tartım teknesine iki mililitre önceden ısıtılmış ortam ekleyin ve miyositler içeren bir kapak kaymasını stimülasyon odasından tartım teknesine aktarın.Stimülasyon odasını inkübatöre 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte geri getirin. Kapak kaymasını tartım teknesinden çıkarın ve yeni yağlanmış bir kapak kayma odasına aktarmadan ve kapak kaymasına bir damla ortam eklemeden önce alt tarafı nazikçe silin. Kapak kayması üzerine bir platin elektrot montajı yerleştirin, ardından forseps ile üst kısım üzerine yeni bir kapak kayması yerleştirin ve kapak kaymalı sandviçinin üzerine bir üst montaj yeri yerleştirin.Odanın montajını bitirmek için iki veya dört numaralı sıfır panhead vidaları takın. Peristaltik pompada, ortam boru boyunca mevcut olduğunda, boruyu ön ısıtıcıya ve ön ısıtıcıyı kapak kayma odasına takın. Daha sonra, dakikada 0,5 mililitrede perfüzyona başlayın ve sızıntı olmadığından emin olmak için odanın altına bir mendil mendil yerleştirin.Kapak kayma odasını mikroskobun sahne adaptörüne yerleştirdikten sonra, ısıtma sistemini açın ve odanın merkezinde 37 santigrat derece sabit bir ortam sıcaklığı elde etmek için tertibatı beş ila 10 dakika dengeleyin. Perfüze edilmiş ortamın odanın karşı ucunda bir vakum sistemine bağlı boru ile toplandığını gözlemleyin. Dengeleme süresi boyunca, miyositleri mikroskopta 40x suya daldırma hedefi ile görselleştirin.Pacing stimülatörü etkinleştirmek için, voltajı 35 ila 40 volta ayarlayın ve kontraktil fonksiyonu ve miyosit sağkalımını optimize etmek için stimülasyon frekansını 0.2 hertz'e ayarlayın. Sarkomer kısaltma izlerini toplamak için, bilgisayardaki yazılımı açın ve Tamam, dosya ve yeni sekmeleri seçin. İzleri seçerek, kullanıcı sınırlarını ve sarkomer uzunluğunu düzenleyerek bir ekran şablonu hazırlayın.Sarkomer uzunluğu izlerini dosya ve yeni sekmelerle kaydedin, büzülen bir miyositi tanımlayın ve miyositi kameranın uzunlamasına ekseni boyunca konumlandırın, böylece çizgilenme paterni dikey olur. İlgilenilen bölgeyi veya ROI kutusunu miyositin üzerine yerleştirmek için bilgisayar faresini kullanın. Sözleşme işlevini kaydetmek için topla ve başlat'ı seçin.0.5 hertz'lik düşük stimülasyon frekanslarında her miyositten 60 saniye kısalmayı kaydedin. Kapak kayması başına beş ila 10 hücreden sarkomer kısalmasını kaydedin. Bir frekans aralığında kısalmayı ölçmek için, kayıttan önce sabit durum kısalması elde etmek için miyositleri her frekansa yerleştirin.Perfüzyon hızını iki katına çıkarın ve stimülasyondan 15 ila 20 saniye sonra 0.2 ila iki hertz aralığında yeni bir frekansta kayıt yapmaya başlayın ve verilen stimülasyon frekansları aralığında kısaltmak için kapak kayması başına ikiden fazla miyosit kaydetmeyin. Güvenilir sinyal ortalaması verileri elde etmek için hücre başına en az yedi kasılma kaydedin. Dosyayı seçin, kaydedilmiş bir izleme seçin ve ardından Aç'ı seçin.Temel izlemelerden birini seçin ve ardından sarc uzunluğunu elde etmek için izlemenin üstündeki sarı paneli ayarlayın. İşlemler monotonik geçici analiz seçenekleri ve TTL olay işareti ile bir analiz şablonu hazırlayın T Zero tanımında menüden gerekli seçenekler. Şablonları seçerek ve analiz şablonunu bir tanımlayıcıyla kaydederek bu analiz seçeneklerini kaydedin.Her izlemeyi çözümlemeden önce çözümleme şablonunu yükleyin. Verileri analiz etmek için işaretleri, geçidi seçin, geçici ekleyin ve ardından olay işareti ve analiz aralığından dönüştürün. 0,2 hertz'de tempolu miyositler için zaman aralığını eksi 0,01 ila 1,20 saniye arasında ayarlayın.Daha yüksek frekanslarda uyarılan miyositler için daha kısa bir zaman aralığı seçin. Orijinal temel izlemenin altında bir sinyal ortalaması kaydı üretmek için işlemleri ve ortalama olayları seçin. Ardından, sinyal ortalaması alınan izlemeden birini seçin ve ardından üst menüdeki işaretlere gidin ve ardından geçici ekle, işlemleri ve monotonik geçici analizi seçerek sinyal ortalaması alınan ekran panelinde temel sarkomer parametreleri için sinyal ortalaması değerlerini görüntüleyin.Monotonik geçici analizi ve pano akımını dışa aktarmayı seçin ve çoklu miyositlerin kompozit analizi için geçici sarkomer analizini bir elektronik tabloya aktarın. Sinyal ortalaması izlemesini kopyalamak için dışa aktar, geçerli izleme, ardından pano ve seçenekler sekmelerini sırayla seçin ve ondalık basamakları beş olarak ayarlayın. Sekmeler sınırlayıcısını seçin ve Tamam'ı tıklatın.Her miyosit kaydı için sinyal ortalama izlerini ikinci bir elektronik tabloya aktarın. Çalışma, aşırı basınç veya PO'nun, sahte gruba kıyasla miyositlerin kasılma fonksiyonunu azalttığını göstermiştir. Bununla birlikte, kardiyak troponin IT 144D veya cTnIT144D'nin gen transferinden dört gün sonra, PO miyositlerindeki kontraktil yetenek, miyosit fonksiyonunun geri yüklenebileceğini gösteren sahte seviyelere geri döndü.İlk çalışmalarda, cTnIT144D'nin gen transferi, CTnI'ye kıyasla pik kısalmayı ve diyastolik kalsiyum seviyelerini yükseltti. Kardiyak miyositin pozisyonunda ince ayarlamalar genellikle net kısalma izleri elde etmek için gereklidir. Bu protokol, kısalmanın yanı sıra kalsiyum geçicilerini tespit etmek için Fura-2 gibi kalsiyuma duyarlı floresan boyalarla yüklü kardiyak miyositler üzerinde de yapılabilir.

analysis-cardiac-contractile-dysfunction-ca2-transients-rodent

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

Yabani tip ve mutant farelerden alınan bireysel kardiyomiyositler, kasılmalarını ve kalsiyum geçişlerini incelemek için kalpten izole edilebilir. Bu, hücresel disfonksiyonun herhangi bir nedenden dolayı kalp disfonksiyonuna katkısının karakterizasyonuna izin verir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Murin sol ventrikül papiller kas in vitro kardiyak kontraktiliteyi araştırmak için kullanılabilir. Bu makalede ayrıntılı olarak izolasyon ve deneysel protokoller kalp kasılma özelliklerini incelemek için açıklar.

Farelerde Kardiyak inotropiyi Soruşturma İzole papiller Kaslar kontraktilite Ölçümleri

Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Bu makale, sıçan kalbinden izole edilen kardiyak miyositlerde kasılma sırasında miyofilament Ca2+ duyarlılığındaki değişiklikleri değerlendiren bir protokolü açıklamaktadır. Kardiyak elektrofizyoloji, sistolik/diyastolik sitozol Ca2+ seviyeleri ve kasılma/gevşeme ile birlikte bu ölçüm, sağlıklı ve hastalıklı kalplerde kardiyak uyarılma-kasılma eşleşmesine aracılık eden mekanizmaların desteklenmesinde zorunludur.

Myofilament Ca Değerlendirilmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Duyarlılık temelinde Kardiyak Uyarma-kasılma Kaplin

Murine miyositlerin izolasyonu ve aynı anda gerilim veya kalsiyum izlerinin nasıl elde edilecegini, eşzamanlı dijital hücre geometrisi ölçümleri ile floresan fotometri kullanarak sarcomere kısaltma izleriyle birlikte saglamak için metodolojiyi savuruyoruz.

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

Bu protokol, derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun ekstraksiyon ve değerlendirilmesi tekniğini adım adım tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodoloji, farelerden erkeklere kadar farklı kardiyak yerlerden toplanabilen küçük dondurulmuş biyopsiler kullanarak miyofilament fonksiyonunun ölçülmesine ve akut modülasyonuna olanak sağlar.

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

Tavşan kardiyomiyositlerinde GtACR1 aktivasyonunun elektromekanik etkilerinin değerlendirilmesi için bir protokol sayılmiyoruz. Hücre izolasyonu, kültür ve adenoviral transdüksiyon ve yama-kelepçe ve karbon-fiber teknikleri ile fonksiyonel deneyler hakkında ayrıntılı bilgi salıyoruz.

Optogenetik Modüle Kardiyomiyosit Aktivitesinin Elektromekanik Değerlendirilmesi

Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Bu protokol, klinik öncesi gelişim sırasında ilaca bağlı kontraktilitedeki değişiklikleri değerlendirmek için güvenilir bir platform olan MyoBLAZER sistemi ile donör kalplerinden alınan yetişkin insan primer kardiyomiyositlerinde kontraktilitenin nasıl ölçüleceğini açıklar.

İzole Yetişkin İnsan Primer Kardiyomiyositlerinde Kalp Kontraktilitesinin Ölçülmesi

Bu protokol, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip transmembran voltajının ve hücre içi Ca2+ geçici akımlarının elektrofizyolojik ölçümleri de dahil olmak üzere, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardiden etkilenen vahşi tip ve knock-in hayvanlardan elde edilen fare kalplerinin çift boyutlu optik haritalamasını sunar.

Katekolaminerjik Polimorfik Ventriküler Taşikardi RyR2R2474S Knock-In Farelerinden Kalplerin Çift Boyutlu Optik Haritalaması

Öğrenin, kemirgen kardiyomiyositlerinde sarkomer uzunluğu ve kalsiyum geçişleri ölçerek kontraksiyon fonksiyonunu değerlendirin. Bu yöntem, kalp yetmezliği mekanizmalarını ve tedavi stratejilerini anlamak için kullanılır.

Kemirgen Miyositlerde Kardiyak Kasılma Disfonksiyonu ve Ca²⁺ Geçicilerinin Analizi

Daha fazla video keşfet