Farelerde Lizofosfatidilkolin Kaynaklı Fokal Demiyelinasyon Modelinin Stably Olarak Kurulmuş İki Noktalı Enjeksiyonu
11 Mayıs 2022
Mevcut protokol, farelerde stabil ve tekrarlanabilir bir demiyelinasyon modeli oluşturmak için stereotaksik bir çerçeve yoluyla iki noktalı bir lizofosfatidilkolin enjeksiyonunu tanımlamaktadır.
Modelimiz demiyelinizasyon hastalıkları, özellikle multipl skleroz ile oldukça ilgilidir. Ve klinik olarak ilgili araştırmaların ilerlemesine katkıda bulunabilir. Cerrahi prosedürle farelerde hızlı ve istikrarlı bir şekilde doğrudan ciddi demiyelinizasyona neden olabilecek ayrıntılı bir protokoldür.
Bu tekniği ilk kez denerken, sabırlı olun ve koordinatların doğru olduğundan emin olun. 32 gauge'lik bir iğneyi 5 mikrolitrelik bir şırıngaya bağlayarak başlayın. Enjeksiyonun hazırlanması için 5 mikrolitre LPC çözeltisi çekin.
Daha sonra, solunum pürüzsüzken ayak parmağı sıkışma refleksinin eksikliği ile farenin anestezi derinliğini onaylayın. Fareyi stereotaksik çerçeveye sırt tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve kafayı bir burun konisi ve diş kelepçesi ile sabitleyin. Fareyi iki taraflı kulak çubuklarıyla stereotaksik aparata sabitleyin.
Kulak çubuklarının düz olduğundan ve başın yatay ve sabit olduğundan emin olun. İyodofor ile silerek baş derisini dezenfekte edin. Ardından, kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisinin orta çizgisi boyunca yaklaşık 1,5 santimetreye kadar küçük bir kesi kesmek için neşter kullanın.
Bregma, lambda ve posterior fontanelle açığa çıkana kadar% 1 hidrojen peroksit içine batırılmış bir pamuklu çubukla beceriyi silin. Şırıngayı stereotaksik aparata yerleştirin. Hayvanın başının yatay olarak konumlandırıldığından emin olun ve korpus kallozumu bulun.
Enjeksiyon bölgesi belirlendikten sonra, koordinatları kaydedin ve kafatası üzerinde bir işaretleyici ile bir işaret yapın. İşaretli bölgeyi bir kafatası matkabı ile nazikçe delin. Herhangi bir kanamayı önlemeye özen gösterin.
İğneyi yavaşça verilen koordinatlara hareket ettirin. Korpus kallozum demiyelinizasyonunu indüklemek için, her enjeksiyon bölgesine dakikada 0.4 mikrolitre hızında 2 mikrolitre LPC çözeltisi enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, iğneyi her bölgede 10 dakika daha tutun.
Son olarak, cildi 4-0 dikişle dikin ve hayvanın 10 dakika içinde uyanmasını bekleyin. Temsili görüntü, Luxol hızlı mavi boyama yoluyla beyaz madde lejyonlarının tespitini göstermektedir. Sonuçlardan, korpus kallozumun stabil demiyelinizasyonu enjeksiyondan 10 ve 28 gün sonra görülebilir.
Demiyelinasyon alanının farklı zaman noktalarında nicelleştirilmesi burada gösterilmiştir. İmmünofloresan boyama yoluyla bozulmuş miyelin bazik proteini, LPC enjekte edilen grupta, enjeksiyondan 10 gün sonra kayda değer bir dMBP artışı gözlenmiştir, bu da korpus kallozumda miyelin kaybını temsil eder. Miyelin bazik proteininin veya MBP'nin batı leke analizi, LPC enjeksiyonundan sonra önemli miktarda MBP kaybı gösterdi.
Beta-aktin, temel ifadeyi ölçmek için yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Elektron mikroskobu görüntüleri, sahte grup ve LPC enjekte edilen grubun korpus kallozumundaki miyelinli ultrayapıyı doğrulamaktadır. GST-pi, oligodendrosit öncü hücresinin veya OPC, farklılaşma olgunlaşmasının belirtecidir.
10 günlük LPC enjeksiyonundan sonra, GST-pi sahte gruba kıyasla azaldı. Aynı zamanda, oligodendrositlerin proliferasyon kabiliyeti, oligodendrositlerin çoğalma oranı ve toplam oligodendrosit soy hücreleri ile yansıtılabilir. Daha yüksek oran, enjeksiyondan 10 gün sonra oligodendrositlerin daha fazla çoğalmasını temsil eder.
Temsili görüntüler, farelerin yüzme yolunu her grupta, platformun varlığında ve platformu kaldırdıktan sonra göstermektedir. Sonuçlar, iki noktalı LPC enjeksiyon modelinde demiyelinli farelerin uzamsal hafızasının önemli ölçüde bozulduğunu göstermektedir. Bu prosedürü denerken, enjeksiyon hızının doğru olduğundan emin olun ve iğneyi her bölgede 10 dakika daha tutun.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, farelerde stabil bir demiyelinizasyon modeli oluşturmak için stereotaksik bir çerçeve kullanarak lizofosfatidilkolin (LPC) ile yapılan iki noktalı enjeksiyonu detaylandırmaktadır. Özellikle multipl skleroz gibi demiyelinizasyon hastalıklarının incelenmesine yönelik ilgili bir yöntem sunarak, demiyelinizasyonun mekanizmaları ve etkileri üzerine araştırmalara olanak sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Demiyelinasyon araştırmaları
- Hastalıkların fare modelleri
Arka Plan
- Demiyelinizasyonu anlamak, multipl skleroz gibi hastalıklar için tedaviler geliştirmenin kritik bir parçasıdır.
- Özetlenen prosedür, laboratuvar ortamında hızlı ve tekrarlanabilirlemiyelinizasyonu indüklemek amacıyla tasarlanmıştır.
- Doğru cerrahi teknik, prosedürün başarısı için önemlidir.
- Modeli değerlendirmek için Luxol fast blue boyama gibi histolojik analizler kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Demyelinizasyon mekanizmalarını incelemek için güvenilir bir model oluşturmak.
- Demyelinizasyonla ilişkili durumlar için potansiyel terapötik müdahale araştırmalarını kolaylaştırmak.
- Ölçülebilir sonuçlar veren ayrıntılı cerrahi protokoller sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Model, LPC enjeksiyonları için stereotaksik cerrahi bir yaklaşım içerir.
- Farelere, özellikle corpus callosum hedeflenerek, kesin anatomik konumlardan LPC solüsyonu enjekte edilir.
- Her enjeksiyon, kontrollü bir hızla uygulanan 2 µL LPC içerir.
- 10. ve 28. günlerdeki ameliyat sonrası değerlendirmeler, temel sonuç ölçümlerini sağlar.
- Miyelin kaybını analiz etmek için immünofloresan ve Western blotting gibi histolojik teknikler kullanılır.
Ana Sonuçlar
- Corpus callosumda, farklı zaman noktalarında histolojik boyama ile gözlemlenebilen stabil bir demiyelinizasyon sağlanmıştır.
- Miyelin kaybına işaret eden belirteçlerdeki artış, çeşitli analizlerle doğrulanmıştır.
- Davranışsal değerlendirmeler, demiyelinizasyon sonrası uzamsal bellekte belirgin bozulmalar olduğunu göstermiştir.
- Sonuçlar, LPC tedavisine yanıt olarak oligodendrosit proliferasyonu ve farklılaşmasında değişiklikler olduğunu göstermektedir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, demiyelinizasyon dinamiklerini ve potansiyel terapötik stratejileri araştırmak için başarılı bir model oluşturmuştur.
- Bulgular, demiyelinizasyonun altında yatan nöronal mekanizmalara ve oligodendrositlerin rolüne dair içgörüler sunmaktadır.
- Bu model, multipl skleroz ve benzeri durumların anlaşılmasına katkı sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Kararlı bir şekilde oluşturulmuş iki noktalı LPC enjeksiyon modeli, farelerde fokal demiyelinizasyonun hızlı ve tekrarlanabilir şekilde indüklenmesini sağlayarak, multipl skleroz gibi demiyelizan hastalıklarla ilgili keşif aşamasındaki araştırmaları doğrudan destekler. Bu model; mekanistik risk azaltma, hedef doğrulama ile miyelin kaybının ve onarımının kantitatif değerlendirmesi için sağlam bir platform sunar. Tekrarlanabilirliği ve kantitatif çıktıları, nöroinflamatuar hastalık hattındaki preklinik değerlendirmeler ve portföy önceliklendirmesi için kritik bir araç olarak konumlandırmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hastalıkla ilgili sistemlerdelemiyelinasyon mekanizmalarının ve yolak katılımının sorgulanmasına olanak tanır.
- Miyelin kaybını ve oligodendrosit yanıtlarını nicellendirerek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Nöroenflamatuar durumlar için terapötik hipotez testlerinde öngörüsel güveni kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Remiyelinizasyon veya nöroproteksiyonu hedefleyen bileşiklerin downstream taraması için valide edilmiş bir in vivo sistem sağlar.
- Kantitatif histolojik ve davranışsal analizlar için uygun, standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir demiyelinizasyon sunar.
- Ölçülebilir uç noktalarla aday müdahalelerin güvenilir değerlendirmesini sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Multiple sklerozda gözlemlenen hastalıkla ilgili patoloji ile uyumludur ve translasyonel biyobelirteç geliştirmeyi destekler.
- Mekanistik keşiften, terapötik stratejilerin preklinik validasyonuna kadar olan sürekliliği sağlar.
- Akut demiyelinizasyonu ve fonksiyonel bozulmayı in vivo olarak modelleyerek biyolojik riski azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu model, erken dönem mekanistik çalışmalarıleyiyelen demiyelinize hastalıklardaki translasyonel araştırmalar arasında köprü kurarak, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece entegre olmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Niceleştirilebilir demiyelinizasyon ve oligodendrosit analizi yoluyla hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesi ve doz-yanıt çalışmaları için analize hazır, tekrarlanabilir çıktılar sağlar.
- Analitik: Karşılaştırmalı analizler için miyelin kaybının, protein ekspresyonunun ve davranışsal eksikliklerin kantitatif ölçümüne olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Biyobelirteç uyumlaması ve preklinik doğrulama için hastalıkla ilişkili uç noktaları modeller.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla nöroinflamatuar araştırma programı için standartlaştırılmış, yeniden kullanılabilir bir in vivo platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Demiyelinizasyon araştırmalarında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Programlar arası kullanım için standartlaştırılmış,le tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir in vivo modelleme sağlar.
- Stratejik Değer: Güçlü preklinik veriler sağlayarak karar verme süreçlerini ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Nöroinflamatuar hastalık varlıklarının risk ayarlı önceliklendirilmesine ve geliştirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Farelerde stereotaksik cerrahi ve hassas anatomik hedefleme konusunda uzmanlık gerektirir.
- Histolojik, immünofloresan ve davranışsal analiz altyapısına erişim gerektirir.
- Tekrarlanabilirlik için enjeksiyon koordinatlarının ve hızının ekipler arası standartlaştırılması gereklidir.
- Diğer MSS bölgelerine veya hastalık modellerine adaptasyon, protokol optimizasyonu gerektirebilir.
- Model öncelikle akut demiyelinizasyonu yansıtır; kronik veya remiyelinizasyon çalışmaları ek doğrulama gerektirebilir.
