Name: Caenorhabditis Dauer larvalarının büyük ölçekli gravitaksis testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis dauer larvalarında gravitaksis davranışını yüksek verimli yöntemle incelemeyi. Bu hassas analiz, memeli vestibüler sisteminin anlaşılmasına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden JHR'ye (#R01 5R01HD081266 ve #R01GM141493) yapılan araştırma hibeleri ile desteklenmiştir. Bazı suşlar, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır. Pradeep Joshi'ye (UCSB) editoryal katkısı için teşekkür ederiz. UCSB DATALAB tarafından sağlanan istatistiksel danışmanlık.

Bu çalışmada kullanılan suşlar C. elegans (N2) ve C. briggsae (AF16) 'dir (bakınız Malzeme Tablosu). Her tahlil için karışık cinsiyetli bir dauer popülasyonu kullanıldı.
1. Oda hazırlığı
<ol><li>Bir duman davlumbazında çalışın. Çalışma alanını bir Bunsen brülörü, 1-2 tıraş bıçağı, pense, cımbız ve plastik kesme yüzeyi ile ayarlayın (bkz.</li>
	<li>Her oda için iki adet 5 mL serolojik pipet toplayın. Pamuk fişini bir pipetten cımbızla çıkarın. Pense kullanarak ısınana kadar Bunsen brülörün üzerinde bir tıraş bıçağı tutun. Isıtılmış bıçağı kullanarak ikinci pipetin konik ucunu dilimleyin, böylece pipetin tamamı eşit bir çapa sahip olur (Şekil 1A).</li>
	<li>Hızlı bir şekilde çalışarak, modifiye edilmiş iki pipet ucunu aleve yaklaştırın ve hafifçe eritin. Bu uçları birbirine sıkıca bastırarak birleştirin ve her iki pipetin duvarlarının sürekli olmasını sağlayın. Birleştirmeden sonra herhangi bir boşluk görülürse, bunları ayırın ve bu adımı tekrarlayın (Şekil 1A, B).</li>
</ol>2. Odaların agar ile doldurulması
<ol><li>Standart solucan prosedürlerine göre %4 agar ile NGM hazırlayın21. Agar hala erimişken, her odayı serolojik bir pipetleyiciye bağlayarak ve çözeltiyi yavaşça çekerek doldurun. Odayı pipetörden çıkarmadan önce ucu parafin filmle kapatın. Soğuması için odayı düz (tezgaha paralel) yerleştirin. NOT: Otoklavlamadan sonra şişenin yapışkan sargı ile kaplanması (bkz. Malzeme Tablosu) çözelti18'de kabarcıkların oluşmasını önlemeye yardımcı olur.<ol><li>Düzensiz soğutma nedeniyle agarın kıvamındaki herhangi bir değişikliği en aza indirmek için, agar'ı hazırlarken pipettörü ( bkz. Malzeme Tablosu) tezgahın üstüne paralel tutun. Odaları tezgahın üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve hareket etmeden önce agarın sertleşmesine izin verin. NOT: Agar yüzdesi ve medya içeriği denemeye göre uyarlanabilir. % 4 agar, plaka dökme için kullanılan kabaca% 2 konsantrasyondan daha serttir ve solucanların ellerimizdeki ortamdan geçmesini önler. Bununla birlikte, diğer deneyciler yetişkin solucanlar tarafından% 9'a kadar agar18,19'da yuvalama davranışını gözlemlemişlerdir.</li>
	</ol></li>
	<li>Soğutulduktan sonra, 3 mm'lik bir altıgen anahtarı (veya aynı boyutta başka bir metal aleti , bkz. Her bir odanın duvarına, orta hattın bir tarafına yaklaşık 5 mm sıkıca bastırın ve plastikte küçük bir açıklık oluşturun (Şekil 1C). Odanın pamuklu ve konik uçlarını çıkarmak için ısıtılmış bir bıçak kullanın ve bu uçları parafin film ile kapatın. NOT: Hazırlandıktan sonra, her oda 1 gün içinde kullanılmalı veya birkaç gün boyunca 4 ° C'de tutulmalıdır. Agarın kurumasını önlemek için açıkta kalan açıklıkları parafin film ile örtün.</li>
</ol>3. Dauer larvalarını izole etmek
<ol><li>Deneyden 10-15 gün önce, her bir suşu OP50 bakterisi ile 2-3 büyük NGM plakasına koyun ve parafin filmi ile sarın. 10-15 gün sonra, her plaka agar, duvarlar ve kapaklarda bulunan binlerce dauer larva ile tamamen aç bırakılmalıdır. NOT: Maksimum kalabalık için kalın bir OP50 tarifi kullanarak plakaları önceden yapın (bkz. Dauer oluşumu, feromonların eklenmesi veya daha yüksek sıcaklıklarda büyümesi de dahil olmak üzere diğer yöntemlerle de indüklenebilir22.</li>
	<li>Kapakları ve plakaları M9 tamponuyla durulayarak ve çözeltiyi 15 mL santrifüj tüplerine pipetleyerek solucanları toplayın. Oda sıcaklığında 30-60 s için 1.600 x g'da döndürün ve M9 tamponunun çoğunu bir pipet veya vakum aspiratörü ile aspire edin.</li>
	<li>Dauer'leri% 1 SDS ile tedavi ederek izole edin, ardından daha önce yayınlanan rapor 20'yi takiben%30'luk bir sakkaroz yüzdürme gradyanı izleyin.<ol><li>Her bir sonsuz pelete 7 mL% 1 SDS çözeltisi ekleyin. Solucanları 30 dakika SDS'de bırakın; havalandırmaya izin vermek için tüpleri bu süre zarfında sürekli olarak döndürün. Deterjanı çıkarmak için M9 ile 3-5x durulayın.</li>
		<li>Daha sonra, 5 mL M9 ve ardından 5 mL soğuk,filtrelenmiş% 60 sakkaroz çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve ardından bir ayırma gradyanı oluşturmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.600 x g'de santrifüj yapın.</li>
	</ol></li>
	<li>Yeni 15 mL santrifüj tüplerini 2 mL M9 tamponla doldurun. Deliği genişletmek için cam Pasteur pipetlerin uçlarını ezin ve bu pipetleri, çözeltinin üst tabakasını (izole dauers içeren) sakkaroz gradyanından yeni tüplere aktarmak için kullanın. Dauerleri M9 ile 3-5x durulayın. NOT: Bu noktada çözümde binlerce izole dauer olacaktır. Hemen kullanılabilir veya gece boyunca 5-7 mL M9'da döndürülerek havalandırılmış halde tutulabilirler.</li>
</ol>4. Odaya dauer eklenmesi
<ol><li>Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.600 x g'da santrifüj dauerleri ve M9 çözeltisinin çoğunu bir pipet veya vakum aspiratörü ile aspire edin. Solucan yoğunluğunu tahmin etmek için, diseksiyon mikroskobu altında üç ayrı 1 μL damlacıktaki solucan sayısını manuel olarak sayın. μL başına solucan sayısını yaklaşık olarak hesaplamak için bu sayımların ortalamasını kullanın. NOT: Bazı küçük hacimli pipetleyiciler 15 mL'lik bir santrifüj tüpünün dibine ulaşamayabilir; Bu durumda, konsantre bir solucan damlacığı önce bir parça parafin filmine aktarılabilir.</li>
	<li>Deliği genişletmek için 10, 20 veya 200 μL pipet ucunun ucunu kesin. Mikropipeti, amaçlanan aspirasyon hacminden biraz daha büyük bir hacme ayarlayın. Konsantre solucan çözeltisinin yaklaşık 1-2 μL'sini (ideal olarak 100-300 solucan arasında) aspire edin ve uca az miktarda havanın girmesine izin verin. NOT: Bir odadaki çok sayıda solucan (1.000+), aşırı kalabalık nedeniyle kat edilen mesafe aralığını artırabilir9.</li>
	<li>Mikropipeti bastırırken pipet ucunu yavaşça agarın içine itin. Bu, ucu tıkamadan agarda bir enjeksiyon bölgesi oluşturacaktır. Solucanları agarın içine bırakın. Açıklığı kapatmak için parafin film kullanın.</li>
</ol>5. Tahlilin çalıştırılması ve puanlanması
NOT: Gravitaksis, davranış9'u etkileyebilecek çeşitli koşullar altında test edilebilir.
<ol><li>Mümkün olduğunca çok değişkeni ortadan kaldırmak için, odaları oda sıcaklığında karanlık bir Faraday kafesine yerleştirin (bkz.</li>
	<li>Her odayı etiketleyin ve Faraday kafesine dikey olarak asın (bunu etiketleme bandı kullanarak gerçekleştirin). Bazı odaları aynı çevre koşulları içinde düz bir şekilde yerleştirerek yatay kontrolleri eşzamanlı olarak test edin. Deneysel suşları dikey olarak yönlendirilmiş N2 solucanlarına karşı pozitif bir kontrol olarak test edin. Ek bir negatif kontrol olarak N2 dauer içeren yatay yönelimli odalar kullanın. NOT: İki koşul arasındaki çevresel değişkenliği en aza indirmek için yatay ve dikey testler laboratuvar içinde aynı ortamda yapılmalıdır. Her iki Faraday kafesini de barındırmak için büyük bir inkübatör kullanılabilir.</li>
	<li>Dauers birkaç saat sonra başlangıç bölgesinden dağılmaya başlar ve odanın her iki ucuna da ulaşması birkaç saat sürer. Bu süre zarfında odaları rahatsız etmeden bırakın ve enjeksiyondan sonraki 12-24 saat içinde puan alın. NOT: Odaların uçlarına ulaşan solucanları hareketsiz hale getirmek için paralitik (sodyum azid gibi) kullanmayın. Solucanların genel dağılımı bir tercih indeksi yerine ölçüldüğü için (iki seçenekli bir tahlilde olduğu gibi), sodyum azid gereksizdir ve sonuçları değiştirebilir.</li>
	<li>Gravitaksis odalarını birer birer çıkarın ve puanlayın. Diseksiyon mikroskobu altında canlı dauerleri arayın ve yerlerini mürekkeple işaretleyin (Şekil 1C, D). Solucanları enjeksiyon bölgesinin her iki tarafına 2,5 cm içinde puanlamayın, çünkü bu solucanların yön tercihi göstermesi muhtemel değildir.<ol><li>Ayrıca, ölü görünen veya sıvıda sıkışmış solucanları puanlamaktan kaçının. % >50 ölü veya yüzme solucanı içeren odaları atın. NOT: Oda test alanından çıkarıldıktan sonra, doğruluk için derhal puanlanması gerekir. Dauers sadece agarın yüzeyi ile pipetin duvarı arasında görünür olmalıdır. Yuvalama davranışı gözlenirse, gelecekteki tahlillerde agar konsantrasyonunu arttırmayı düşünün.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonuçları ölçmek için, odanın her yarısını enjeksiyon bölgesinden 2,5 cm uzakta başlayan yedi adet 3,5 cm'lik bölüme bölmek için bir işaretleyici kullanın (bazı pipetlerde, 3,5 cm = 1 mL hacim). Her bölümde gözlemlenen solucan sayısını hesaplamak için manuel bir uyarı sinyali sayacı kullanın (bkz. NOT: Menşe hattının her iki tarafında -7 (alt) ile +7 (üst) arasında numaralandırılabilen yedi bölüm bulunmalıdır. Bu sayılar, odaların nasıl inşa edildiğine bağlı olarak aynı göreceli konumlara karşılık gelmelidir; agar, adım 2'de -7 ucundan +7 ucuna çekilir.</li>
</ol>

<ol><li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+integration+for+human+balance+control%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li>
<li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584(2014).</li>
<li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li>
<li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gravitational+Physiology%22%5BJournal%5D)">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li>
<li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391(2014).</li>
<li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%2C+is+regulated+by+IL2+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li>
<li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li>
<li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%A4der%2C+D-P+%22Euglena%3A+Biochemistry%2C+Cell+and+Molecular+Biology%22">Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology</a>. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston%27s+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li>
<li>Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186(2021).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+chemotaxis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069(2013).</li>
<li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li>
<li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493(2015).</li>
<li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li>
<li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li>
<li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293(2011).</li>
<li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li>
<li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn%27s+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+Stata+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li>
<li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li>
<li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress%2C+temperature%2C+and+other+physical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li>
<li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans%3A+a+sensible+model+for+sensory+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li>
<li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li>
<li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li>
<li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049(2018).</li>
<li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).</li>
<li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li>
<li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469(2013).</li>
<li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li>
<li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disorders+of+the+vestibular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Otolaryngology+%26+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li>
<li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+vestibular+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li>
<li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207(2021).</li>
<li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+hearing+and+balance%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567(2019).</li>
</ol>

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Önceki yöntemlerle karşılaştırma Kemotaksislerin aksine, Caenorhabditis'teki gravitaksis, geleneksel bir agar plakası deney tasarımı kullanılarak güvenilir bir şekilde gözlemlenemez. Standart bir Petri kabının çapı 150 mm'dir, bu da dauers'ın gravitaksis tercihini göstermesi için her iki yönde de sadece 75 mm ile sonuçlanır. C. elegans'ın oryantasyonel tercihi çözüm12'de test edilebilse de, solucanların birer birer analiz edilmesi gerektiğinden bu yöntem düşük...

Dünya'nın yerçekimi çekimini algılamak, birçok organizmanın yönelimi, hareketi, koordinasyonu ve dengesi için çok önemlidir. Bununla birlikte, yerçekimi duyusunun moleküler mekanizmaları ve nörodevresi, diğer duyularla karşılaştırıldığında yeterince anlaşılmamıştır. Hayvanlarda, yerçekimi hissi, davranışı etkilemek için diğer uyaranlarla etkileşime girer ve onları geride bırakabilir. Görsel ipuçları, propriyoseptif geri bildirim ve vestibüler bilgi, bir hayvanın çevresine göre vücut farkındalığı duygusu oluşturmak için entegre edilebilir 1,2. Tersine, gravitaktik tercih, diğer uyaranların varlığında değiştirilebilir 3,4,5. Bu nedenle, gravitaktik davranış, yerçekimi hissini incelemek ve sinir sisteminin karmaşık duyusal entegrasyonunu ve karar verme sürecini anlamak için idealdir.
C. elegans, polifenik yaşam döngüsü nedeniyle gravitaksisi incelemek için özellikle yararlı bir model organizmadır. Isı, aşırı kalabalık veya yiyecek eksikliği de dahil olmak üzere gelişim sırasında stresörlere maruz kaldığında, C. elegans larvaları strese karşı oldukça dirençli olan dauer'lere dönüşür6. Dauers olarak, solucanlar, solucanların kuyruklarında "durdukları" ve kafalarını salladıkları niktasyon gibi karakteristik davranışlar sergilerler, bu da daha iyi habitatlara dağılmayı kolaylaştırabilir7. C. elegans ve C. japonica'nın gravitaksis tahlilleri, dauer larvalarının negatif gravitik olduğunu ve bu davranışın dauerlerde yetişkinlere göre daha kolay gözlendiğini göstermektedir 8,9. Gravitaksisin diğer Caenorhabditis suşlarında test edilmesi, gravitaktik davranışta doğal varyasyonları ortaya çıkarabilir.
Yerçekimi hissi mekanizmaları Euglena, Drosophila, Ciona ve gravitaksis tahlilleri3,10,11 kullanan diğer çeşitli türlerde karakterize edilmiştir. Bu arada, Caenorhabdisit'teki gravitaksis çalışmaları başlangıçta karışık sonuçlar verdi. C. elegans'ın oryantasyon tercihi üzerine yapılan bir araştırma, solucanların çözelti içinde başları aşağı doğru yönlendirildiğini ve pozitif yerçekimi tercihini düşündürdüğünü bulmuştur12. Bu arada, C. japonica dauers erken dönemde negatif gravitaktik8 olarak tanımlansa da, bu davranış sadece yakın zamanda C. elegans9'da tanımlanmıştır. Solucanlarda temsili bir gravitaksis testi geliştirmede çeşitli zorluklar ortaya çıkmaktadır. Caenorhabditis suşları agar plakalarında tutulur; Bu nedenle, davranışsal testler tipik olarak deneysel tasarımlarının bir parçası olarak agar plakalarını kullanır13,14,15. Caenorhabdisit'te bildirilen en erken gravitaksis testi, yatay kontrol plakası8'e 90 ° açıyla yan tarafında bir plaka durarak gerçekleştirildi. Bununla birlikte, gravitaksis davranışı bu koşullar altında her zaman sağlam değildir. Yetişkin solucanlar çözüm12'de oryantasyonel tercih için test edilebilirken, bu yön tercihi de bağlama bağlı olabilir ve solucanlar yüzmek yerine sürünüyorsa farklı davranışlara yol açabilir. Ek olarak, C. elegans, yerçekimine tepkilerine müdahale eden ışık ve elektromanyetik alanlar16,17 de dahil olmak üzere diğer uyaranlara duyarlıdır9. Bu nedenle, diğer çevresel değişkenlere karşı kalkan oluşturan güncellenmiş bir gravitaksis testi, bu duyusal sürecin mekanizmalarını incelemek için önemlidir.
Bu protokolde, Caenorhabditis gravitaksis'i gözlemlemek için bir tahlil tanımlanmıştır. Bu çalışmanın kurulumu kısmen nöromüsküler bütünlüğü incelemek için geliştirilen bir yönteme dayanmaktadır18,19. Dauer larvaları standart prosedürler20 kullanılarak kültürlenir ve izole edilir. Daha sonra agar ile doldurulmuş iki adet 5 mL serolojik pipetten yapılmış odalara enjekte edilirler. Bu odalar dikey veya yatay olarak yönlendirilebilir ve ışığa ve elektromanyetik alanlara karşı koruma sağlamak için 12-24 saat boyunca karanlık bir Faraday kafesine yerleştirilebilir. Her solucanın odalardaki yeri kaydedilir ve C. elegans N2 gibi bir referans suşunun dikey taksileriyle karşılaştırılır.

<table><tbody><tr><td>% 1 Sodyum Dodesil Sülfat çözeltisi</td><td></td><td></td><td>Stoktan %10 (a/h) DI suda SDS</td></tr><tr><td>15 mL Santrifüj tüpleri</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>3 mm Altıgen anahtar</td><td></td><td></td><td>Diğer benzer büyüklükteki metal aletler kullanılabilir</td></tr><tr><td>Normal Büyüme Ortamında (NGM) %4 Agar - 1 L</td><td></td><td></td><td>Otoklavlama öncesi: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dekstroz, 10 mL Urasil (2 mg / mL), 500 & mu; L Kolesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI su; Otoklavlama sonrası: 24.5 mL Fosfat Tamponu, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomisin (200 mg/mL)</td></tr><tr><td>5 mL Serolojik pipetler</td><td>Fisherbrand</td><td>S68228C</td><td>Polistiren, borosilikat cam değil</td></tr><tr><td>%60 Soğuk sükroz çözeltisi</td><td></td><td></td><td>DI suyunda %60 sükroz (a/h); Filtrasyon ile sterilize edin (0.45 & mu; m filtresi). 4 & derece'de tutun; C</td></tr><tr><td>AF16 C. briggsae veya diğer deneysel suş</td><td></td><td></td><td>CGC'den (Caenorhabditis Genetik Merkezi) temin edilebilir</td></tr>, <tr><td>Bunsen brülör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streç</td> film <td>Fisherbrand</td><td>22-305654</td><td></td></tr><tr><td>Klinik santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık tıraş bıçakları</td><td>Fisherbrand</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Faraday kafesi</td><td></td><td></td><td>Karton ve alüminyum folyo kullanılarak yapılabilir; 30 "U x 6" G x 26 "Y veya daha büyük</td></tr><tr><td>Mürekkep işaretleyiciler</td><td></td><td></td><td>Plastik üzerine işaretlemek için Sharpie veya başka bir marka</td></tr><tr><td>Etiketleme bandı</td><td>Carolina</td><td>215620</td><td></td></tr><tr><td>M9 tampon</td><td></td><td></td><td>22 mM KH2PO <> sub4, 42 mM Na2HPO<>sub4, 86 mM NaCl</td></tr><tr><td>N2 C. elegans suşu</td><td></td><td></td><td>CGC'den (Caenorhabditis Genetics Center)</td></tr> <tr><td>OP50</td><td></td><td></td> ile NGM plakalarından temin edilebilir. <td>NGM'de %1.7 (a/h) agar (açıklamaya bakınız: NGM'de %4 agar). OP50</td></tr><tr><td>Parafin filmli</td> tohum <td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kesme tahtası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pense</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Döner dikey karıştırıcı</td><td>BTLab SİSTEMLERİ</td><td>BT913</td><td>22 x 15 mL tüp çubuklu</td></tr><tr><td>Serolojik pipetleyici</td><td>Corning</td><td>357469</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop</td><td>Laxco</td><td>S2103LS100</td><td></td></tr><tr><td>Uyarı sinyali sayacı</td><td>ULINE</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>Kalın NGM/agar plaka ortamı - 1 L</td><td></td><td></td><td>NGM tarifinde %4 Agar'a bakın; 40 g Agar'ı 20 g Agar</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td></td><td></td><td></td></tr> ile değiştirin</tbody></table>

caenorhabditis dauer larvalarının büyük ölçekli gravitaksis testi

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Yerçekimi hissi önemli ve nispeten az çalışılmış bir süreçtir. Yerçekimini algılamak, hayvanların çevrelerinde gezinmelerini sağlar ve hareketi kolaylaştırır. Ek olarak, memeli iç kulağında meydana gelen yerçekimi hissi, işitme ile yakından ilgilidir - bu nedenle, bu süreci anlamanın işitsel ve vestibüler araştırmalar için etkileri vardır. Gravitaksis testleri, Drosophila da dahil olmak üzere bazı model organizmalar için mevcuttur. Tek solucanlar daha önce çözeltiye yerleştikçe oryantasyon tercihleri için test edilmiştir. Bununla birlikte, Caenorhabditis gravitaksisi için güvenilir ve sağlam bir test tanımlanmamıştır. Mevcut protokol, bir seferde yüzlerce Caenorhabditis dauerini test etmek için kullanılabilecek gravitaksis tahlilleri yapmak için bir prosedürü özetlemektedir. Bu büyük ölçekli, uzun mesafeli tahlil, standart bir plaka tabanlı tahlilde gözden kaçırılabilecek fenotipleri ortaya çıkaran ayrıntılı veri toplamaya izin verir. Dikey eksen boyunca Dauer hareketi, yön yanlılığının yerçekiminden kaynaklandığından emin olmak için yatay kontrollerle karşılaştırılır. Yerçekimi tercihi daha sonra suşlar veya deneysel koşullar arasında karşılaştırılabilir. Bu yöntem, solucanlardaki gravitaksisler için moleküler, hücresel ve çevresel gereksinimleri belirleyebilir.

Türler arasında gravitaksisin karşılaştırılması Yukarıda özetlenen prosedürü takiben, C. briggsae dauer gravitaksis, C. elegans gravitaksisi ve yatay kontrolleri ile karşılaştırılabilir. C. briggsae dauers'ın dikey dağılımı (kestane), odaların tepelerine doğru eğilir ve solucanların büyük bir yüzdesi +7'ye ulaşır (Şekil 2A). Dauerlerin odaların merkezi etrafında kabaca çan şeklinde bir eğri halinde dağıldığı yatay kontrollerle (aqua) karşılaştır...

Mevcut protokol, Caenorhabditis dauer larvaları ile büyük ölçekli bir gravitaksis testi yapmak için yöntemleri özetlemektedir. Bu protokol, plaka tabanlı bir tahlille karşılaştırıldığında gravitaksis davranışının daha iyi algılanmasını sağlar.

Caenorhabditis Dauer larvalarının büyük ölçekli gravitaksis testi

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Bu yüksek verimli tahlil, caenorhabditis dauer larvalarında sağlam gravitaktik davranışı gözlemlemek için kullanılabilir. Solucan davranışı, bir petri kabı üzerinde yapılan tahlillerle karşılaştırıldığında büyük mesafelerde gözlenir. Bu, tahlilin hassasiyetini arttırır ve ayrıntılı veri analizine izin verir.Gravitaksis davranışını incelemek, memeli vestibüler sistemini anlamak için ilgisi olan caenorhabditis'te yerçekimi hissinin nasıl oluştuğuna dair fikir verebilir. Gravitaksis tahlil odalarının oluşturulması, dauerlerin izole edilmesi ve solucanların odalara enjekte edilmesi pratik gerektirir. Dauerleri izole ederek ve odaları bir gün önceden oluşturarak zamandan tasarruf edebilirsiniz.Bir Bunsen brülörü, bir ila iki tıraş bıçağı, pense, cımbız ve plastik bir kesme yüzeyi ve bir duman başlığı kurarak başlayın. Bir oda yapmak için, iki adet 5 mililitrelik serolojik pipet toplayın ve cımbızla pamuk tapasını bir pipetten çıkarın. Pense kullanarak bir tıraş bıçağını sıcak olana kadar Bunsen brülörün üzerinde tutun.Isıtılmış bıçağı kullanarak ikinci pipetin konik ucunu dilimleyin, böylece pipetin tamamı eşit bir çapa sahip olur. Şimdi, modifiye edilmiş iki pipet ucunu hızlı bir şekil

large-scale-gravitaxis-assay-of-caenorhabditis-dauer-larvae

Research

JoVE Journal

Behavior

Davranış

C. elegans yumurtlama davranışı, gelişimsel, üreme ve anatomik çalışmalarda önemli bilgiler sağlayabilir. Bu video, bir yumurtlama testinin önemli adımlarını tanıtır ve bir ilacın üreme toksisitesi açısından test edildiği örnek bir deneyi gösterir.

Yumurtlama Deneyi: C. elegans'ın Yumurtlama Davranışını Ölçmek İçin Bir Yöntem

Niceliksel kemotaktik tepkiyi değerlendirmek için bir...

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Içinde isteğe bağlı hareket ikna etmek için bir yarı-otomatik mikro-elektro-akışkan...

On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler...

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Germ hattı toksisitesini değerlendirmek için kullanılan nematod Caenorhabditis elegans'ta yüksek verimli bir kimyasal testin ayrıntılı adımlarını açıklıyoruz. Bu tahlilde, kimyasal maruziyeti takiben germ hattı fonksiyonunun bozulması, anöploid embriyolara özgü bir floresan raportör kullanılarak izlenir.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Hayvanın hareketsiz hale getirilmeden uzun zaman ölçeklerinde davranışı ve nöral aktiviteyi görüntülemek, davranışı anlamak için bir ön koşuldur. Agaroz mikroakışkan odacıkların görüntülenmesi (), Caenorhabditis elegans'ın tüm yaşam evreleri için nöral aktivite ve davranışı görüntülemek için kullanılabilir.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ın embriyonik uzamasının erken ve geç aşamalarında meydana gelen morfojenik kusurları izlemek için özel olarak tasarlanmış protokolleri detaylandırıyoruz. Sonuç olarak, bu protokoller, bu fazları düzenleyen genleri tanımlamak ve embriyonun antero-arka ekseni boyunca diferansiyel gereksinimlerini karakterize etmek için tasarlanmıştır.

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Omiks araştırmalarında Caenorhabditis elegans (C. elegans)kullanmak için, karşılaştırmalı analizler için platformlar arasında tek bir numunenin ölçülebileceği büyük solucan popülasyonları oluşturmak için bir yönteme ihtiyaç vardır. Burada, C. elegans popülasyonlarını büyük ölçekli kültür plakalarında (LSCP' ler) kültüre ve nüfus artışını belgelemek için bir yöntem sunulmuştur.

Büyük Ölçekli Karma Aşama Caenorhabditis Elegans Popülasyonlarının Kültürü ve Tahlilleri

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Öğrenin, Caenorhabditis dauer larvalarında gravitaksis davranışını yüksek verimli yöntemle incelemeyi. Bu hassas analiz, memeli vestibüler sisteminin anlaşılmasına katkı sağlar.

Caenorhabditis Dauer larvalarının büyük ölçekli gravitaksis testi

Daha fazla video keşfet