Name: CRISPR/Cas9 Gen Tedavisi Uygulamaları için Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Gen Düzenlemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Öğrenin, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin köklülüğünü koruyarak gen düzenleme verimliliğini artıran optimize edilmiş ekz vivo kültür protokolünü. Bu yöntem, HIV dahil hastalıklar için gen tedavisinde greftlenmeyi iyileştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, CSCR'nin akış sitometri tesisinin ve hayvan tesisinin personelini kabul etmek istemektedir. A. C. ICMR-SSF bursu, K. V. K. DST-INSPIRE bursu ve P. B. CSIR-JRF bursu tarafından finanse edilmektedir. Bu çalışma Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bakanlığı tarafından finanse edilmiştir (hibe no. BT/PR26901/MED/31/377/2017 ve BT/PR31616/MED/31/408/2019)

<ol><li>Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+stem-cell-based+gene+therapy+for+inherited+disorders%3A+State+of+the+art+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 443(2019).</li>
<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+hematopoiesis%3A+Current+stage+of+clinical+translation+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958(2019).</li>
<li>Srivastava, A., Shaji, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cure+for+thalassemia+major+-+From+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation+to+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy.</a> Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).</li>
<li>Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+developmental+gamma-globin+gene+expression%3A+An+approach+for+healing+hemoglobinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies.</a> Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253(2020).</li>
<li>Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivector-mediated+clonal+tracking+reveals+intrinsic+heterogeneity+in+the+human+hematopoietic+stem+cell+compartment+and+culture-induced+stem+cell+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment.</a> Blood. 103 (2), 545-552 (2004).</li>
<li>Piras, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+escape+innate+sensing+but+trigger+p53+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).</li>
<li>Christopher, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+expansion+of+human+CD34%2BCD133%2BCD90%2B+hematopoietic+stem+cells+enhances+gene-modified+cell+frequency+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).</li>
<li>Karuppusamy, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCR5+gene+edited+CD34%2B+CD90%2B+hematopoietic+stem+cell+population+serves+as+an+optimal+graft+source+for+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 792684(2022).</li>
<li>Hopman, R. K., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+stem+cell+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+reviews%22%5BJournal%5D)">Advances in stem cell mobilization.</a> Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).</li>
<li>Hoffman, T. L. Counting Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffman%2C+TL+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+handbook%22">Cell Biology: A laboratory handbook</a>. 1, Elsevier. Chapter 3 21-24 (2006).</li>
<li>Antoniani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+fetal+hemoglobin+synthesis+by+CRISPR%2FCas9-mediated+editing+of+the+human+b-globin+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus.</a> Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).</li>
<li>Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology-directed+gene-editing+approaches+for+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12, 500(2021).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>Bagchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+immortalized+erythroid+progenitor+cell+lines+from+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells.</a> Cells. 10 (3), 1-18 (2021).</li>
<li>Ravi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+HPFH-like+mutations+by+CRISPR+base+editing+that+elevates+the+expression+of+fetal+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin.</a> eLife. 11, 65421(2020).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R%CE%B3null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2r%CE%B3-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
<li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+busulfan+reduces+human+CD34%2B+cell+doses+required+for+engraftment+in+c-kit+mutant+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).</li>
<li>Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+asphyxia+on+the+development+of+synaptic+junctions+in+the+brains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatrica+Japonica%3B+Overseas+Edition%22%5BJournal%5D)">Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice.</a> Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).</li>
<li>Audigé, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+leukocyte+reconstitution+in+NSG+mice+transplanted+with+human+cord+blood+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells.</a> BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-receptors+as+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Fc-receptors as regulators of immunity.</a> Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).</li>
<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Ngom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UM171+enhances+lentiviral+gene+transfer+and+recovery+of+primitive+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).</li>
<li>Park, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+proliferation+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+cells+by+a+combination+of+hyper-interleukin-6+and+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214(2022).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-based+gene+therapy+of+hematopoietic+stem+cells+in+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Rai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cell+culture+conditions+promote+ex-vivo+manipulation+and+expansion+of+primitive+hematopoietic+stem+cells+for+therapeutic+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).</li>
</ol>

Yazarlar, rakip finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.

HSPC gen tedavisinin başarılı sonucu, ağırlıklı olarak greftteki engraflanabilir HSC'lerin kalitesine ve miktarına bağlıdır. Bununla birlikte, HSC'lerin fonksiyonel özellikleri, gen manipülasyon prosedürü ile ilişkili in vitro kültür ve toksisite de dahil olmak üzere, gen terapisi ürünlerinin hazırlık aşamasında oldukça etkilenir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, ex vivo kültürde CD34 + CD133 + CD90 + HSC'lerin kökünü koruyan ideal HSPC kültür koşullarını belirl...

Allojenik transplantasyon ortamlarında insan lökosit antijeni (HLA) ile eşleşen donörlere erişilememesi ve çok yönlü ve güvenli genetik mühendisliği araçlarının hızla geliştirilmesi, otolog hematopoetik kök hücre transplantasyonunu (HKHN) kalıtsal kan hastalıkları için iyileştirici bir tedavi stratejisi haline getirmektedir 1,2. Otolog hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) gen tedavisi, hastaların HSPC'lerinin toplanmasını, genetik manipülasyonu, hastalığa neden olan mutasyonların düzeltilmesini ve gen düzeltilmiş HSPC'lerin hastaya transplantasyonunu içerir 3,4. Bununla birlikte, gen tedavisinin başarılı sonucu, nakledilebilir gen modifiye greftin kalitesine bağlıdır. HSPC'lerin gen manipülasyon adımları ve ex vivo kültürü, uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC'ler) sıklığını azaltarak greft kalitesini etkiler ve büyük dozlarda gen ile manipüle edilmiş HSPC'lerininfüzyonunu gerektirir 2,5,6.
SR1 ve UM171 de dahil olmak üzere birkaç küçük molekül şu anda kordon kanı HSPC'lerini 7,8 oranında genişletmek için kullanılmaktadır. Yetişkin HSPC'ler için, mobilizasyonda elde edilen daha yüksek hücre verimi nedeniyle, sağlam genleşme gerekli değildir. Bununla birlikte, ex vivo kültürde izole HSPC'lerin sapını korumak, gen terapisi uygulamaları için çok önemlidir. Bu nedenle, hematopoetik kök hücrelerin (HSC'ler) kültür zenginleştirilmesine odaklanan bir yaklaşım, küçük moleküllerin bir kombinasyonu kullanılarak geliştirilmiştir: Resveratrol, UM729 ve SR1 (RUS)7. Optimize edilmiş HSPC kültür koşulları, HSC'lerin zenginleşmesini teşvik eder, bu da gen modifiye HSC'lerin in vivo sıklığının artmasına neden olur ve yüksek dozlarda HSPC'leri manipüle eden gen ihtiyacını azaltır ve uygun maliyetli gen terapisi yaklaşımlarını kolaylaştırır8.
Burada, HSPC'lerin kültürü için kapsamlı bir protokol, gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo infüzyonu ve analizi ile birlikte açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>4D-Nükleofektor&reg; X Birimi</td><td>LONZA BİYOBİLİM</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nükleofektör ve ticaret; X Kiti (16 oyuklu Nucleocuvette & trade; Şeritler)</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik (100X)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-insan CD45 APC</td><td>BD BİYOSCIENCE&nbsp;</td><td>555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-insan CD13 PE BD</td><td>BİYOBİLİM</td><td></td><td></td></tr> 555394 <tr><td>Anti-insan CD19 PerCP</td><td>BD BİYOBİLİM</td><td></td><td></td></tr> 340421 <tr><td>Anti-insan CD3 PE-CY7</td><td>BD BİYOBİYODİK</td><td>557749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-insan CD90 APC</td><td>BD BİYOBİLİM</td><td></td><td></td></tr> 561971 <tr><td>Anti-insan CD133 / 1 & nbsp;</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-113-673</td><td></td></tr><tr><td>Anti-insan CD34 PE BD</td><td>BİYOBİLİM</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>Anti-fare CD45.1 PerCP-Cy5</td><td>BD BİYOBİLİM</td><td>560580</td><td></td></tr><tr><td>Kan Irradator-2000</td> <td>&nbsp; BRIT (Biyoteknoloji Bölümü, Hindistan)</td><td>BI 2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü kabı (delta yüzey işlem görmüş 6 oyuklu plakalar)</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>140675 <tr><td>CrysoStor CS10</td><td>BioLife çözümleri</td> <td># 07952</td><td></td></tr><tr><td>Busulfan</td><td>CELON LABS (60mg / 10mL)</td> <td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Guide-it Rekombinant Cas9</td><td>TAKARA BIO</td><td>632640</td><td></td></tr><tr><td>Cas9-eGFP</td><td>SIGMA</td><td>C120040&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Santrifüj tüpü-15ml</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Santrifüj tüpü-50ml</td><td>NUNC (TERMO BİLİMSEL)</td><td></td><td></td></tr>339652 <tr><td>DMSO</td><td>MPBIO</td><td>219605590</td><td></td></tr><tr><td>DNAaz</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>6469</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Fosfat Tamponlu Tuzlu Sali- 1X</td><td>HYCLONE</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>EasySep & trade; İnsan CD34 Pozitif Seçim Kiti II</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>17856</td><td></td></tr><tr><td>EasySep mıknatıs</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez ünitesi</td><td>TURUNCU HİNDİSTAN</td><td>HDS0036</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr> 10270106 <tr><td>Akış sitometresi ve ndash; ARIA III</td><td>BD BİYOBİLİM</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Akış Jo&nbsp;</td><td>BD BİYOSCIENCE</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>FLT3-L</td><td>PEPROTECH</td><td>300-19-1000</td><td></td></tr><tr><td>Jel görüntüleme sistemi</td><td>HÜCRE BİYOBİLİMLERİ</td><td>11630453</td><td></td></tr><tr><td>HighPrep DTR reaktifi</td><td>MAGBIOGENOMICS</td><td>DT-70005</td><td></td></tr><tr><td>İnsan BD Fc Blok</td><td>BD BİYOBİLİM</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PEPROTECH</td><td>200-06-50</td><td></td></tr><tr><td>IMDM medya</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Kızılötesi lamba</td><td>MURPHY-İnsülin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>şırıngası 6mm 31G</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 324903 <tr><td>Ketamin</td><td>KETMIN 50-Yükleme</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>boyası 6X</td><td>TAKARA BIO</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Lenforep</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>Fare Sınırlayıcı</td><td>AVANTOR</td><td>TV-150</td><td></td></tr><tr><td>Nano damla spektrofotometresi</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer hücre sayım odası</td><td>ROHEM INSTRUMENTS</td><td>CC-3073</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>RRID:IMSR_JAX:005557</td><td></td></tr><tr><td>NOD,B6. SCID Il2r&gama; &eksi;/&eksi; KitW41/W41 (NBSGW)</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>RRID:IMSR_JAX:026622</td><td></td></tr><tr><td>Nunc delta 6 oyuklu plaka</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Polistiren yuvarlak tabanlı tüp</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>P3 birincil hücre Nükleofeksiyon çözeltisi</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>PBP3-02250</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>PCR temizleme kiti</td><td>TAKARA BIO</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Fare Turtası Kafesi</td><td>FISCHER SCIENTIFIC</td><td>50-195-5140</td><td></td></tr><tr><td>polistiren yuvarlak tabanlı boru (12 x 75 mm)</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>38007</td><td></td></tr><tr><td>Primer3</td><td>Whitehead Institute for Biomedical Research</td><td><a href="https://primer3.ut.ee/">https://primer3.ut.ee/</a></td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Ekstrakt ve ticaret; DNA Ekstraksiyon Çözeltisi</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>Reserveratrol</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>72862</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>300-07-1000</td><td></td></tr><tr><td>SFEM-II</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>SYNTHEGO</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SPINWIN</td><td>TARSON</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StemReginin 1</td><td>STEMCELL TEKNOLOJİLERİ</td><td>72342</td><td></td></tr><tr><td>ICE analiz aracı</td><td>SYNTHEGO</td><td><a href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA tampon çözeltisi (TE) 1X</td><td>SYNTHEGO</td><td>gRNA ile birlikte verilir;</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>UYGULAMALI BİYOSİYONLAR</td><td>4375305</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>300-18-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>HIMEDIA LABS</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>72914</td><td></td></tr><tr><td>UM729</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>72332</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Xylaxin - HİNT İMMÜNOLOJİK LİMİNOLOJİ</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 gen tedavisi uygulamaları için hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen düzenlemesi

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR / Cas9, çeşitli genetik mutasyonları düzeltmek için yaygın olarak benimsenen çok yönlü ve verimli bir gen düzenleme aracıdır. Hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC'ler) in vitro gen manipülasyonunun fizibilitesi, HSPC'leri gen tedavisi için ideal bir hedef hücre haline getirmektedir. Bununla birlikte, HSPC'ler ex vivo kültürde engraftment ve multilineage repopulasyon potansiyellerini orta derecede kaybederler. Bu çalışmada, HSPC engraftmanını geliştiren ve in vivo olarak artan sayıda gen modifiye hücre üreten ideal kültür koşulları tanımlanmıştır. Mevcut rapor, kültür ortamının türü, benzersiz küçük moleküllü kokteyl takviyesi, sitokin konsantrasyonu, hücre kültürü plakaları ve kültür yoğunluğu dahil olmak üzere optimize edilmiş in vitro kültür koşullarını göstermektedir. Buna ek olarak, optimize edilmiş bir HSPC gen düzenleme prosedürü, gen düzenleme olaylarının doğrulanması ile birlikte sağlanır. İn vivo doğrulama için, fare alıcılarında gen düzenlenmiş HSPC'lerin infüzyonu ve engraftman sonrası analizi görüntülenir. Sonuçlar, kültür sisteminin fonksiyonel HSC'lerin sıklığını in vitro olarak arttırdığını ve gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo olarak sağlam bir şekilde aşılanmasını sağladığını göstermiştir.

Bu çalışma, CD34+CD133+CD90+ HSC'lerin ex vivo kültürde tutulmasını kolaylaştıran ideal HSPC kültür koşullarını tanımlamaktadır. HSC'lerin kültür zenginleştirilmesini, gen modifiye HSC'lerin geliştirilmiş üretimi ile birlikte göstermek için, PBMNC izolasyonu, CD34 + hücre saflaştırma, kültür, gen düzenleme, transplantasyon, engraftmanın karakterizasyonu ve gen modifiye edilmiş hücrelerin in vivo için optimize edilmiş prosedürler sağlanmıştır (<strong class="xf...

Mevcut protokol, gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo olarak sağlam bir şekilde aşılanması için optimize edilmiş bir hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) kültür prosedürünü tanımlamaktadır.

CRISPR/Cas9 Gen Tedavisi Uygulamaları için Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Gen Düzenlemesi

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

Ex vivo kültür, hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin repopulasyon potansiyelini engelleyebilir. Protokolümüz kültür sırasında saplığı korur ve böylece gen modifiye hücrelerin in vivo sıklığını arttırır. Hematopoetik kök hücre gen tedavisi şu anda monogenik hastalıklar ve HIV gibi bulaşıcı hastalıklar için kullanılmaktadır.HSPC gen terapisi protokolü büyük ölçüde ex vivo kültüre dayanır. Protokolümüz, ex vivo kültürü kullanan herhangi bir prosedürle uyumlu olmalıdır. Bu protokolü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Vigneshwaran Venkatesan olacak.HSPC'leri izole ettikten sonra, onları sitokinler ve küçük moleküller Resveratrol, UM729 ve StemRegenin1 içeren kök hücre kültürü ortamında kültürleyin. Gen düzenlemeden önce, kılavuz RNA'yı yeniden oluşturmak için ThermoMixer'ı 37 santigrat dereceye ayarlayın, ardından TE tamponunu 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede önceden ısıtın. Sentetik kimyasal olarak modifiye edilmiş sgRNA şişesini 4 santigrat derecede 1 dakika boyunca 11.000 kez g'de santrifüj edin ve 1.5 nanomolar liyofilize sgRNA içeren şişeye 15 mikrolitre TE tamponu ekleyin ve mikrolitre başına 100 pikomolar nihai konsantrasyon elde etmek için hafifçe dönerek karıştırın.TermoMikserdeki şişeyi 30 ila 40 saniye boyunca 37 santigrat derecede minimum sallama ile inkübe edin. Yanlardaki şişeye hafifçe dokunun ve 15 mikrolitre sgRNA toplamak için şişeyi döndürün. 1 mikrolitrelik alikotlar yapın ve 1 yıla kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.Nükleofeksiyon için, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj edilerek 5. hücrelere 2 kez 10. Süpernatant atıldıktan sonra, peleti tamponun 20 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu hazırlanan RNP kompleksi ile hava kabarcıklarını önleyerek yavaşça karıştırın.Şimdi, süspansiyonu ticari nükleofeksiyon şeridine aktarın ve DZ-100 darbe kodunu seçerek 4D-Nükleofektörü kullanarak hücreleri elektroporat yapın. Nükleofeksiyon şeridindeki elektroporasyonlu hücrelere, 100 mikrolitre önceden inkübe edilmiş kültür ortamı ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Kuluçka sonunda, içeriği deneysel gereksinimlere göre kültür plakasına aktarın.NSG farelerini HSPC transplantasyonundan 6 ila 8 saat önce pasta kafeslerine yerleştirin. Ticari olarak temin edilebilen bir ışınlayıcı kullanarak fareleri 3,5 gride ışınlayın. NBSGW için, HSPC transplantasyonundan 48 saat önce vücut ağırlığının kilogramı başına 12.5 miligramlık bir dozda intraperitoneal olarak busulfan enjekte ederek 6 ila 8 haftalık erkek ve dişi farelerin ön koşulu.1 fareyi demlemek için, 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj yaparak 1.5 mililitrelik bir tüpte 5. hücrelere 6 kez 10 kez pelet verin. oda sıcaklığında. Peleti rahatsız etmeden süpernatantı nazikçe pipetle çıkarın ve hücre peletini 100 mikrolitre PBS içinde yeniden askıya alın.Önceden şartlandırılmış NSG veya NBSGW farelerini fare tutucusuna yerleştirin ve HSPC'leri kuyruk damarı enjeksiyonu ile infüze edin. Fare kuyruğunu tutun ve fareyi dizginlemek için fişi hafifçe itin. Fare kuyruğunu% 70 etanol ile nazikçe silin.31 gauge insülin şırıngası kullanarak, hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini aspire edin. Şimdi, kızılötesi lambadan gelen ışığı 30 ila 40 saniye boyunca kuyruğa yönlendirin ve farenin vücut bölgesini kağıt mendil kıvrımlarıyla kaplayın. Kuyruğu şırınga ile planya ekseninde tutmak için, sol işaret parmağınızla kaldırın.İğnenin eğim kısmını yavaşça sol veya sağ kaudal kuyruk damarına 20 derecelik bir açıyla yerleştirin. Hücre süspansiyonunu damara demlemek için pistonu itin ve delinmiş bölgenin yakınında doku kağıdı ile hafif basınç uygulayın ve iğneyi çekin. Anestezi uyguladıktan sonra, hayvanı ventral yatışa yerleştirin ve gözü açmak için fareleri nazikçe ovalayın ve gözün küresinin hafifçe çıkıntı yapmasına izin verin.Mera pipetini 30 ila 45 derecelik bir açıyla nazikçe niktasyon zarının altındaki gözün medial kantusuna yerleştirin. Pasteur pipeti uygun konuma yerleştirdikten sonra, tüpe hafif bir basınç uygulayın ve tüpü yavaşça döndürmeye başlayın. 50 ila 80 mikrolitre periferik kan topladıktan sonra, pipeti gözün medial kanthus bölgesinden yavaşça çekin.Ötanizasyon sonrası, üretranın 1 santimetre yukarısında dikey bir kesi yapın ve diyaframın 1 santimetre altına kadar uzatın. Karın bölgesini açmak için kesilmiş bölgenin köşelerinde yatay olarak kesin. Femur ve tibiayı diseke ettikten sonra, femur ve tibiaya bağlı yumuşak dokuları çıkarmak için makas kullanın ve kemikleri bir doku kağıdı ile nazikçe ovalayın.0,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünün dibinde çapı 0,2 santimetreden fazla olmayan küçük bir delik açmak için bir neşter kullanın. Bir neşter kullanarak kemiklerin proksimal uçlarını çıkarın ve kemikleri, kesilen tarafı 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünün deliğine bakacak şekilde yerleştirin. Şimdi, 0.5 mililitrelik tüpü kemiklerle birlikte 100 mikrolitre steril PBS içeren 1.5 mililitrelik tüpe yerleştirin.Kapağı kapatın, tüpleri oda sıcaklığında steril koşullar altında 3 dakika boyunca 200 kez g'de döndürün ve boş bir ilik boşluğuna sahip kemikler içeren 0,5 mililitrelik tüpleri atın. Kemik iliği içeren 1.5 mililitrelik reaksiyon tüpüne, 1 mililitre PBS ekleyin, ardından 1 mililitrelik bir pipet kullanarak, hücreleri 10 kez hafifçe askıya alın. Hücre süspansiyonunun 1 mililitresini, 9 mililitre RBC lizis tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Her iki dakikada bir tüpü hafifçe ters çevirerek hücreleri 7 dakika boyunca buzda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj edin ve berrak soluk beyaz bir pelet gözlenene kadar yıkamayı tekrarlayın. Canlı hücrelerin ve CD34-pozitif, CD90-pozitif hücrelerin sıklığı 48 saatlik nükleofeksiyondan sonra RUS grubunda artmıştır.72 saat sonra, indel yüzdesi ve sıklığı, RUS-tedavi edilen grupta, DMSO ile tedavi edilen gruba kıyasla artmıştır ve gen düzenlemesinde bir artış olduğunu düşündürmektedir. CD34-pozitif, CD90-pozitif hücrelerin ve toplam çekirdekli hücrelerin mutlak sayısı, düzenleme sonrası 48 saat içinde önemli ölçüde daha yüksektir. NSG farelerinde insan CD45-pozitif hücrelerinin akış sitometrisi analizi, kültür koşullarında artmış engraftman göstermiştir.Fare BM hücrelerindeki gen düzenleme sıklığının analizi, RUS takviyeli kültür koşullarında gen düzenlenmiş HSPC'lerin engraftmanının arttığını göstermiştir. HSPC'lerin mL başına 200.000 hücrenin bir araya geldiği bir yerde kültürlenmesi, fonksiyonel kök hücrelerin iyileştirilmesi için çok önemlidir. Kordon kanı kök hücrelerinin ve iSPC türevi kök hücrelerin çoğaltılması, bu protokolün test edildiği yeni alanlardır.

crisprcas9-gene-editing-hematopoietic-stem-progenitor-cells-for-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak insan T hücrelerinde gen düzenlemesi yapmak için bir testi göstermektedir. Birincil CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin bir karışımı, nakavt için spesifik genleri hedefleyen bir CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi ile birleştirilir. Elektroporasyon üzerine, sgRNA, Cas9'u hedef DNA dizisine yönlendirerek hassas kesimler oluşturur. Bu kesikler daha sonra hücrenin homolog olmayan uç birleştirme mekanizması tarafından onarılır ve bu da gen nakavtına yol...

T Hücrelerinde Gen Düzenleme için Bir CRISPR-Cas9 Tekniği

CRISPR/Cas9 kullanarak hedeflenen gen düzenleme büyük ölçüde anlayış genlerin biyolojik fonksiyonların kolaylaştırdı. Burada, biz oncogenic faaliyetlerini incelemek için model calreticulin mutasyonların sitokin bağımlı hematopoetik hücreler için CRISPR/Cas9 metodoloji kullanmaktadır.

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

Bir iletişim kuralı için hızlı fare CRISPR/Cas9-aracılı gene bozulma ve insan birincil hematopoetik hücreler bu makalede açıklanan. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins elektroporasyon ile vitro transkripsiyon ve ticari Cas9 ile oluşturulan sgRNAs ile tanıtılmaktadır. Yüksek Düzenleme verimliliği sınırlı zaman ve maliyet ile elde edilir.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Burada sunulan verimli CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein aracılı gen düzenleme meme hücrelerinde tüp Elektroporasyon kullanarak bir protokoldür.

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Burada, bir CRISPR/Cas9 sistemi üzerinden araç-T hücrelerini genetik olarak düzenlemek için bir protokol sunuyoruz.

CAR-T hücrelerinde GM-CSF ' ı Knock Out için CRISPR/Cas9 kullanma

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Burada, CAR-T hücrelerini değiştirmek için CRISPR Cas Teknolojisini kullanarak birincil insan T hücrelerinde gen düzenleme protokolü sunuyoruz.

İnsan CRISPR-Engineered CAR-T Hücrelerinin Üretimi

Hematopoetik kök hücre biyolojisini ve hematolojik maligniteleri daha iyi incelemek için hematopoetik kök ve progenitör hücrelerdeki (HSPC'ler) somatik mutasyonları sadık bir şekilde modellemek için yeni stratejiler gereklidir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanımını ve çift rAAV donör transdüksiyonunu birleştirerek HSPC'lerde heterozigot fonksiyon kazancı mutasyonlarını modellemek için bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerinde Onkojenik Heterozigot Fonksiyon Kazancı Mutasyonlarının Mühendisliği

THP-1 hücre hattı, biyoloji ile ilgili çeşitli araştırma alanlarında insan monositlerinin / makrofajlarının işlevlerini araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, sağlam ve tekrarlanabilir fenotipik verilerin üretilmesini sağlayan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik ve tek hücreli klon izolasyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

Burada, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin anormal proliferatif kapasitesi için çok önemli olan aday genleri tanımlamak için CRISPR / Cas9 teknolojisini Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testi ile entegre eden bir protokol sunuyoruz.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Anormal Büyüme ile İlgili Genlerinin CRISPR/Cas9 Teknolojisi ile Hücre Sayımı ile Birleştirilerek Değerlendirilmesi

Öğrenin, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin köklülüğünü koruyarak gen düzenleme verimliliğini artıran optimize edilmiş ekz vivo kültür protokolünü. Bu yöntem, HIV dahil hastalıklar için gen tedavisinde greftlenmeyi iyileştirir.

CRISPR/Cas9 Gen Tedavisi Uygulamaları için Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Gen Düzenlemesi

Daha fazla video keşfet