Özelleştirilmiş Perfüzyon Biyoreaktöründe Domuz Vaskülarize Fleplerinin Tedariği ve Perfüzyon-Desellülarizasyonu

Bu yöntem, üç vaskülarize domuz flebinin cerrahi olarak tedarikini ve ardından perfüzyon desellülarizasyonunu tanımlar. Bu yöntem, doku desellülarizasyonu ve resellülarizasyon yaklaşımı kullanarak domuz fleplerini yenileme çabalarına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit bir biyoreaktör kurulumunda çeşitli vaskülarize domuz fleplerinde bolluk desellülarizasyonu elde etmek için çok yönlülüğüdür.

Burada tarif edilen teknik, rekonstrüktif cerrahide domuz flepleri kullanılarak potansiyel bir doku mühendisliği çözümü olarak diğer vaskülarize fleplere geniş çapta uygulanabilir. Başlamak için, yaklaşık 50 santimetre LS16 platin kaplı silikon boruyu ölçerek bir giriş ve çıkış borusu yapın. Deterjan haznelerinden biyoreaktör odasına perfüzyon taşımak için bir ucunu sarı 3 kademeli pompa borusuna, diğer ucunu steril 2 mililitrelik serolojik pipete bağlayın.

Odayı ve boruları ayrı ayrı sarılmış steril ambalajlarda otoklav yapın. Omental flep tedariki için, 12 haftalık anestezi uygulanmış Yorkshire domuzunu sırtüstü pozisyona yerleştirin ve ardından karnı her zamanki steril şekilde hazırlayın. Karına girmek ve mide sefaladını harekete geçirmek için bir xipho-umbilical laparotomi uygulayın ve omentumu ameliyat alanına yerleştirin.

Sol gastroepiploik arterin dalak artere katıldığı daha büyük eğriliğin sol yönünden başlayarak, düz Stevens tenotomi makası kullanarak sol gastroepiploik arteri ve damarı iskeletleştirin. Daha sonra cerrahi bağlar veya klipsler kullanarak her ikisini de ayrı ayrı yetkilendirin ve bölün. Omentumdan kaynaklanan kısa vasküler dalları bağlamak ve bölmek için midenin daha büyük eğriliği boyunca soldan sağa doğru ilerleyin ve midenin daha büyük eğriliğini sağlayın.

Sağ gastroepiploik damarların ve gastroduodenal arterin birleşmesiyle karşılaşılana kadar büyük omentumun mobilizasyonuna devam edin. Daha sonra omental flebi serbest bırakmak ve daha sonra flep kanülasyonuna izin vermek için sağ gastroepiploik arteri ve damarı yaslanıp bölün. Tensör fascia lata flep tedariki için, domuzu lateral decubitus pozisyonuna getirin.

İç flep sınırını anterior superior iliak omurgadan veya ASIS'ten lateral patellaya doğru ve arka sınırı kaudal olarak yaklaşık 8 ila 10 santimetre arasında işaretleyin. Patelladaki distal marjda keskin bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Rektus femorisin üzerindeki fasyaya ulaşmak için deri altı dokulardan insizyonu derinleştirin ve kesilerin ASIS'e doğru işaretli sınırlar boyunca devam etmesini sağlayın.

Fasyal flebi tek başına izole etmek için, üstteki deri bileşenini altta yatan fasya tabakasından çıkarın. Daha sonra cilde küçük perforatör damarları yağlayın veya koterize edin. Kapağın distal sınırına geri dönün ve derin fasyayı kesin.

Fasyayı altta yatan vastus lateralis kasından ASIS'e doğru harekete geçirin. Pedikülü derin femoral damarlara doğru izledikten sonra, lateral circumflex femoral arteri ve fasyal flebi besleyen veni iskeletleştirin. Daha sonra kanat damarlarını yakınımsal olarak yaslanın ve bölün, burada derin femoral damarlara katılırlar ve daha sonra kanülasyona izin verirler.

Radyal önkol flebi tedariki için, uzatılmış bir domuz önkolunun radyal yönü üzerinde 3 x 3 santimetre karelik bir kareyi işaretleyin. Radyal arter pedikülünün yaklaşık seyrini belirtmek için proksimal flep marjının orta noktası ile antekübital fossa arasında bir çizgi çizin. Palpasyonla arteriyel seyri onaylayın.

Daha sonra, antebrakiyal fasyaya kadar bir derinliğe sahip distal açıdan bir neşter kullanarak cildi kesin. Tenotomi makası ile distal radial arter ve vena komitantları ile karşılaşılıncaya kadar künt diseksiyon yapılır. Daha sonra arteri ve damarları cerrahi bağlar veya klipslerle yaslanın ve bölün.

İşaretli cilt karesinin radyal ve ulnar kenarlarındaki cilt kesilerine devam edin. Daha sonra flebi altta yatan radyal kemikten cerrahi bir bıçak veya koter ile harekete geçirin, bir ulnardan radyal yöne doğru ilerlerken, cilt flebini antekübital fossa'ya doğru proksimal olarak yükseltin. Tenotomi makası kullanarak, radyal arteri ve vena komitantlarını, sırasıyla brakiyal arter ve damarlara katıldıkları antekübital fossada proksimal olarak iskeletleştirin.

Vasküler pedikülü izole etmek için damarları çevreleyen fibro-yağ dokularından disseke edin. Daha sonra radyal önkol kapağını serbest bırakmak için arteri ve damarı ayrı ayrı yaslanın ve bölün. Daha sonra, pedikül damarlarını 3-0 ipek bağları ile sabitlenmiş 20 ila 24 gauge anjiyokateter ile kanüle edin.

Heparinize salini, net bir venöz çıkış gözlenene kadar flep arteriyel kanülüne yıkayın. Laminer akışlı bir Biyogüvenlik kabininde çalışırken, kapakları biyoreaktör doku odasına yerleştirin. Artık havayı gidermek ve flep arteriyel kanül ile erkek luer konektörü arasında bağlantıya izin vermek için kanatları düzenlemek için steril heparinize salinli ana giriş borusu.

Daha sonra arteriyel kanülü konektöre vidalamak için steril hemostatlar kullanın. Ardından, luer bağlantısının sızıntısız olduğunu ve flopların venöz çıkış kanıtı ile perfüze edilebileceğini kontrol etmek için heparinize salini stopcock'tan yıkayın. Doku odası kapağını kapattıktan sonra, giriş borusunu sarı 3 adımlı bir pompa borusu ile doku odasının giriş durdurucusuna bağlayın.

Ayrıca, perfüzyon basıncı izleme için giriş 3 yönlü durdurma çubuğuna bir hat içi basınç sensörü transdüseri takın. Ardından, giriş peristaltik pompasını açın ve ilk ekranda, boru kimliğini 1,85 milimetreye ayarlamak için oku kullanarak üçüncü sekmeye geçin. Ardından perfüzyon hızını ikinci sekmeden ayarlayın.

Teslimat şekli olarak giriş hızı dakikada 2 mililitre olarak ayarlanmıştır. Akış yönünün ekranda görüntülendiği gibi doğru olduğundan emin olun. 3 kademeli pompa borusunu uyumlu bir kasetle peristaltik pompaya yükleyin.

Çıkış pompası ayarını dakikada 4 mililitre hıza ayarlayın. Çıkış borusunu sarı 3 kademeli pompa borusu ile doku odasının çıkış durdurma horozuna bağlayın. Ardından 3 adımlı pompa borusunu peristaltik pompaya yükleyin ve her pompadaki güç düğmesine basarak her iki pompa için de akışı başlatın.

Tutulan kan pıhtılarını çıkarmak için 15 dakika boyunca doku odasında heparinize salin ile fleplerin perfüzyon desellülarizasyonuna başlayın. Tamamlandığında, artık salini, kapağı batırmak için 500 mililitre sodyum dodesil sülfat veya SDS, desellülarizasyon çözeltisi ile değiştirin. Ardından, giriş borusunu SDS çözeltisine aktarın ve dokuyu bolca kullanın.

SDS desellülarizasyonundan sonra, flebi bir gün boyunca PBS ile perfüze etmeden önce kalan SDS'yi aspire edin. SDS perfüzyon desellülarizasyonundan sonra, kapakları DNA çözeltisinde iki saat boyunca ve daha sonra bir gün boyunca PBS'de sırayla perfüze edin, ardından giriş borusunu damıtılmış suda perasetik asit ve etanol içine aktararak kapakları üç saat boyunca perfüze ederek sterilize edin. Tamamlandığında, flepleri aseptik olarak çıkarın ve her biri 15 dakika boyunca% 1 antibiyotik antimikotik içeren iki PBS yıkamasına batırın.

Kapakları recellularizasyona hazır olana kadar 4 santigrat derecede saklayın. Desellülarize fleplerin değerlendirilmesi için doku örnekleri elde etmek için 3 ila 10 milimetrelik bir punch biyopsi aracı kullanın. Manuel kontrol altında yıkanan izole desellülarize flepler, serbestçe boşaltılan omentum, tensor fascia lata ve radyal önkol flebinin venöz kanülünden çıkış kanıtı gösterdi.

Doğal omentum, tensör fascia lata ve radyal önkol fleplerinin brüt morfolojisi, tedarikten hemen sonra pembe renkli görünüyordu. Buna karşılık, desellülarize dokular karakteristik olarak beyaz veya opak görünümlüydü. Doğal dokuların hematoksilin ve eozin ile histolojik incelemesinde mavi çekirdek varlığı görüldü.

Desellülarize fleplerde, histolojik boyama, mavi nükleer boyama olmadan hücresel materyal kaybını ortaya çıkardı ve bu da bir asellüler doku iskelesini gösterdi. DNA içeriğinin ek miktarı, asellüler iskelelerdeki DNA'da doğal dokulara kıyasla önemli bir azalma gösterdi. En önemli husus, tedarik sırasında kullanılan cerrahi bir tekniktir ve sonraki perfüzyon desellülarizasyonuna izin vermek için flep pedikülünün zarar görmemesine özen gösterir.

Perfüzyon desellülarizasyonunu takiben, ortaya çıkan flepler, doğal doku bölmelerini yenilemek için dokuya özgü hücre popülasyonları ile yeniden hücreselleştirilebilir.