CRISPR-Cas12a ile Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Sahada Konuşlandırılabilir Candidatus Liberibacter asiaticus Tespiti
23 Aralık 2022
Bu çalışmada, Candidatus Liberibacter asiaticus için CRISPR-Cas12a ile kombine rekombinaz polimeraz amplifikasyonuna dayanan hızlı, hassas ve taşınabilir bir tespit yöntemi geliştirilmiştir.
Huang long bing, HLB olarak kısaltılmıştır. Dünya çapında yıkıcı bir narenciye hastalığıdır. Çin ve ABD gibi en narenciye üreten ülkelerde, HLB'ye CLas olarak kısaltılan floem kısıtlamalı bakteri Candidatus Liberibacter asiaticus neden olur.
CLas'ın erken teşhisi, erken müdahaleyi kolaylaştıran ve hastalığın yayılmasını önleyen yetiştiriciler için önemliydi. Bu yüzden burada hızlı ve taşınabilir HLB tanısı için rekombinaz polimeraz amplifikasyonu ve CRISPR-Cas12a sistemi ile birleşen yeni bir yöntem geliştirdik. Biz buna CLas-DETECTR adını verdik.
Platformumuzun hassasiyeti PCR'den çok daha yüksektir. Ayrıca, yaprak örnekleri kullanıldığında qPCR ile benzer sonuçlar gösterir. Geleneksel CLas algılamalarıyla karşılaştırıldığında, yöntemimiz 90 dakika içinde tamamlanabilir ve izotermal bir durumda çalışır.
Sonuç, sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla da görselleştirilebilir. CLas-DETECTR dört adımdan oluşur: çözelti hazırlama, narenciye toplam DNA izolasyonu, izotermal DNA amplifikasyonu ve görselleştirme sonuçları. CLas-DETECTR testinin şeması burada gösterilmiştir.
Tampon A, Çözüm B ve Çözüm C, protokolde açıklandığı gibi hazırlanır. Zamandan tasarruf etmek ve bu yöntemi alan CLas tespiti için uygun hale getirmek için, DNA amplifikasyonu için ham bitki özleri elde etmek için E.coli polietilen glikol bazlı yaklaşım kullanılmıştır. Narenciye yaprakları alette kullanılır.
Birkaç parça yaprak diskini yapraktan delin. Yaprak diskleri 1,5 mililitrelik bir Eppendorf tüpüne koyun. Ardından, tüpe 200 mikrolitre Tampon A ekleyin.
Yaprak diskleri plastik bir çubukla pürüzsüz hale gelene kadar manuel olarak öğütün. Tüpü 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Süpernatant daha sonra DNA amplifikasyonuna uygulanır.
İzotermal DNA amplifikasyonu için, adım 2.3'ten bir mikrolitre süpernatant ve bir mikrolitre magnezyum asetat çözeltisi B'ye ekleyin ve iyice karıştırın. Laboratuvarda, onları 15 dakika boyunca 37 derecede basit bir inkübatörde inkübe edin. Sonuçları görselleştirmek için, 3.2. adımdan itibaren 10 mikrolitre karışımı çözelti C'ye ekleyin ve iyice karıştırın.
Onları 37 derecelik inkübatörde 60 dakika boyunca inkübe edin. Bir gözlük takın ve el tipi bir floresan algılama cihazı aracılığıyla yeşil floresan sinyalini gözlemleyin. CLas-DETECTR'ın özgüllüğünü test etmek için, Agrobacterium tumefaciens GV3101'in ilk saf kolonileri, Xanthomonas citri subsp.
Laboratuvarımızda izole edilen citrus canker ve Burkholderia stabilis suşu 1440'ın patojeni olan sitri, genomik DNA'larını çıkarmak için kullanıldı. Daha sonra bu üç bakteri genomik DNA'sı ve CLas-pozitif Newhall yaprakları genomik DNA'sı CLas-DETECTR testine tabi tutuldu. CLas-DETECTR'ın duyarlılığını test etmek için, protokolde açıklandığı gibi PCR, CLas-DETECTR ve qPCR kullanılarak bir dizi CLas DNA fragmanı seyreltmesi tespit edildi Özgüllük ve duyarlılık testinden sonra, CLas-DETECTR yöntemi CLas'ın sahadaki varlığını tespit etmek için kullanıldı.
Gannan Normal Üniversitesi, Jiangxi, Çin kampüsündeki germplazma kaynak fidanlığında yetiştirilen Newhall tatlı portakal ağacından toplanan yaprak örnekleri. qPCR, genellikle laboratuvarda kullanılan ikna edici bir CLas tespit yöntemi de uygulanmıştır. Laboratuvarımızda CLas'ın varlığının doğrulandığı HLB-enfekte ve HLB-enfekte olmamış Newhall ağacından elde edilen yaprak örnekleri, CLas-DETECTR testine tabi tutuldu.
Yeşil floresan sinyali, HLB ile enfekte olmuş numunede yakalandı, ancak HLB-enfekte olmamış ve negatif kontrolde yakalanmadı. CLas-DETECTR'ın özgüllüğünü, diğer bakterilerden ekstrakte edilen nükleik asitleri kullanarak belirledik. CLas-DETECTR testinde, sadece CLas-pozitif Newhall yapraklarından ekstrakte edilen gDNA yeşil floresan sinyalleri gösterdi.
Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri ve Burkholderia stabilis suşu 1440'tan ekstrakte edilen gDNA, CLas-DETECTR'ın CLas'ı spesifik olarak tespit edebileceği anlamına gelir. Ayrıca CLas-DETECTR'ın duyarlılığını, protokolde listelenen bir dizi CLas DNA seyreltmesi kullanarak test ettik.
PCR, megalitre başına 201 kopya tespit edebilir. Öte yandan, CLas-DETECTR megalitre başına 2.01 kopya tespit edebilir ve bu da hassas bir alan teşhisi olarak kullanılabilirliğini gösterir. qPCR, megalitre başına 0,201 kopya algılayabilir ve Ct değeri 36'dan yüksektir.
Bu nedenle CLas-DETECTR, geleneksel PCR'den iki büyüklük sırasına göre daha hassastır ve seyreltilmiş CLas'a özgü amplikonlar kullanıldığında qPCR'den daha az hassas bir büyüklük sırasına sahiptir. Son olarak, CLas-DETECTR'ın saha örnekleri için fizibilitesini yeniden inceledi ve duyarlılığını qPCR ile karşılaştırdı. Rakamlarda görüyoruz.
CLas konsantrasyonu megalitre başına 0.2 kopyadan az olduğunda Ct değerinin 36'dan yüksek olduğunu görebiliriz, bu da çok düşük bir konsantrasyondur. 15 örneklem arasında, qPCR ile saptanan 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 ve 14 numaralı örneklerin Ct değeri 36'dan azdı. Belirgin bir yeşil floresan sinyalleri gözlendi.
Öte yandan, qPCR ile tespit edilen 6, 7, 9, 12 ve 15 örneklerinin Ct değeri belirlenmediğinde, yeşil floresan sinyalleri gözlenmemiştir. Ek olarak, qPCR ile tespit edilen örnek 5 ve 11'in BT değeri 36'dan yüksek olduğunda zayıf yeşil floresan sinyalleri gözlenmiştir. Sonuçlar, platformumuzun sahada HLB teşhisi için hızlı, sağlam ve hassas bir araç olduğunu gösterecektir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, turunçgillerde Huanglongbing (HLB) hastalığının etkeni olan Candidatus Liberibacter asiaticus'un (CLas) hızlı ve doğru tespiti ihtiyacını karşılamayı amaçlamaktadır. CLas-DETECTR adı verilen yeni bir yöntem, rekombinaz polimeraz amplifikasyonunu CRISPR-Cas12a teknolojisi ile birleştirerek sahada taşınabilir ve hassas testlere olanak tanımaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Bitki Patolojisi
- Tarımda Teşhis
- Mikrobiyal Genetik
Arka Plan
- Huanglongbing (HLB), dünya çapında turunçgillerde üretimi ciddi şekilde etkilemektedir.
- CLas'ın erken tespiti, hastalığın yayılmasının önlenmesi için kritik öneme sahiptir.
- PCR gibi mevcut yöntemlerin sınırlamaları vardır ve sahada uygulanabilirlik için iyileştirme gerektirir.
Kullanılan Yöntemler
- CRISPR-Cas12a ile birleştirilmiş rekombinaz polimeraz amplifikasyonu
- Test için turunçgillerin saha örnekleri kullanılmıştır.
- Sonuç görselleştirmesi için floresan tespit teknolojisi.
Ana Sonuçlar
- CLas-DETECTR, standart PCR'den önemli ölçüde daha yüksek hassasiyet göstermiştir.
- Sadece CLas-pozitif örneklerde özgün floresans gözlemlenmiştir.
- Yöntem, izotermal koşullar altında 90 dakika içinde sonuç verebilir.
Sonuçlar
- Çalışma, CLas-DETECTR'in HLB için sağlam ve hassas bir tanı aracı olduğunu göstermiştir.
- Bu yöntem, turunçgillerdeki hastalıkları etkin bir şekilde yönetmek için zamanında müdahalelere olanak tanımaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Rapid, field-deployable detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) addresses a critical bottleneck in agricultural pathogen surveillance, enabling earlier intervention and containment of Huanglongbing (HLB) outbreaks. The integration of recombinase polymerase amplification with CRISPR-Cas12a delivers high sensitivity and specificity, supporting confident decision-making at the point of need. This diagnostic advancement enhances predictive confidence and operational agility for disease management pipelines in agri-biotech portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid hypothesis testing for pathogen presence in plant systems.
- Supports functional validation of detection targets through CRISPR-based specificity.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing CLas from other citrus pathogens.
- Improves predictive confidence for early-stage intervention strategies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated plant DNA extracts for downstream diagnostic workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative fluorescence readouts.
- Enables scalable, field-ready screening without laboratory PCR infrastructure.
- Supports reliable evaluation of sample status for rapid triage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns diagnostic outputs with disease-relevant field conditions for translational continuity.
- Bridges laboratory assay performance with real-world sample variability.
- Reduces risk in advancing detection platforms toward broader agricultural deployment.
- Provides mechanistic de-risking by confirming target specificity in complex matrices.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through field validation, supporting workflows from hypothesis testing to actionable diagnostics in agricultural biotechnology.
- Discovery Biology: Confirms pathogen presence and specificity using CRISPR-Cas12a-mediated detection.
- Screening: Offers rapid, reproducible, and quantitative fluorescence outputs for sample triage.
- Analytics: Provides sensitivity thresholds and comparative performance data versus PCR and qPCR.
- Translational Research: Demonstrates continuity from laboratory validation to field deployment in citrus samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a portable, reusable diagnostic platform adaptable to other plant pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in pathogen detection.
- Operational Value: Enables standardized, rapid, and field-deployable diagnostics without complex instrumentation.
- Strategic Value: Supports timely go/no-go decisions for disease management and resource allocation.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization of diagnostic and intervention strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid extraction and isothermal amplification techniques.
- Needs access to handheld fluorescence detection devices for field visualization.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and assay execution.
- Adaptable to various plant matrices with protocol optimization.
- Limited by the need for CRISPR-Cas12a reagents and fluorescence-compatible infrastructure.
