Name: Kemirgen Kalplerde Viral Transgen Ekspresyonu ve Kardiyak Aritmi Riskinin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Öğrenin, sıçan ve fare kalplerinde viral transgen ekspresyonu ve kardiyak aritmi riskinin değerlendirilmesi için minimal invaziv enjeksiyon tekniğini. Bu yöntem, kalp hastalığı araştırmalarında gen fonksiyonu çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) Proje Hibeleri (PJT-148918 ve PJT-180533, WL'ye), CIHR Erken Kariyer Araştırmacı Ödülü (AR8-162705, WL'ye), Kanada Kalp ve İnme Vakfı (HSFC) McDonald Bursu ve Yeni Araştırmacı Ödülü (S-17-LI-0866, WL'ye), Öğrenci Bursları (JW ve YX'e) ve Ottawa Üniversitesi Kardiyak Bağış Fonlarından Doktora Sonrası Bursu (AL'ye) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Richard Seymour'a teknik desteği için teşekkür eder. Şekil 2 , onaylanmış lisanslara sahip Biorender.com oluşturulmuştur.

Açıklanan tüm yöntem ve prosedürler, Ottawa Üniversitesi'ndeki hayvan araştırmaları etik inceleme kurulu ve Ottawa Üniversitesi Kalp Enstitüsü'ndeki biyogüvenlik inceleme komitesi tarafından onaylanmıştır. Geliştirilen güvenlik protokolleri, rekombinant adenovirüs veya adeno ilişkili virüs (AAV) ile ilgili tüm prosedürlerin seviye II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirildiğini içerir. Virüsle temas eden tüm maddeler deneyden sonra iyice dekontamine edildi. Bu çalışmada Ctnnb1flox/flox ve αMHC-MerCreMer fareleri (8-12 haftalık, her iki cinsiyetten) ve Sprague-Dawley sıçanları (200-250g, erkek) kullanılmıştır. Hayvanlar ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bkz. Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, kurumsal düzenleyici komiteler tarafından eğitilmiş ve onaylanmış personel tarafından gerçekleştirilmiştir. Tüm işlemler sırasında uygun kişisel koruyucu ekipmanlar kullanıldı.
1. Kemirgen ventrikül dokularında viral transgen ekspresyonu
NOT: Hedef geni ve ilgili kontrol virüsünü ifade eden Ad-GFP (1 x 10 10 PFU/mL titre) veya AAV9-GFP (1 x 10 13 GC/mL titre) gibi rekombinant adenovirüs veya AAV (bkz.
<ol><li>Virüs enjeksiyonu gününde, virüsü buz üzerinde çözün. Hedef geni ve kontrol virüsünü eksprese eden virüsü 30 G 1/2 iğne ile iki ayrı şırıngaya (hacim = 50 μL) aspire edin ve kullanıma kadar buz üzerinde tutun. NOT: Şırınga ve iğnedeki kabarcıklar dikkatlice çıkarılmalıdır.</li>
	<li>Sıçanlara veya farelere buprenorfin uygulayın (sıçanlar için 0.05 mg / kg, fareler için 0.1 mg / kg, deri altı), 1 saat sonra% 3 izofluran kullanarak anesteziyi indükleyin ve sonraki prosedür için% 2'de (0.5-1.0 L / dak akış hızında% 100 oksijende) izofluranı koruyun.</li>
	<li>Hayvanın vücudunu (örneğin kuyruğu) bir çift forseps ile hafifçe sıkıştırın ve hayvan sıkışmaya herhangi bir vücut hareketiyle cevap vermezse, uygun anestezi onaylanır.</li>
	<li>Elektrikli ısıtma yastığı kullanarak vücut ısısını 37 ° C'de tutun. Göğüs bölgesindeki saçları saç kesme makinesi kullanarak tıraş edin. NOT: Potansiyel düzensiz ısı dağılımı nedeniyle elektrikli ısıtma yastığı kullanırken dikkatli olunmalıdır.</li>
	<li>Korneanın kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.</li>
	<li>Hayvanı sırtüstü pozisyonda tutun ve kısa eksen oryantasyonunda hayvanın kalbinin ultrasonla görüntülenmesi için klinik öncesi bir görüntüleme sistemi kullanın (bkz. NOT: Aşağıdaki adımlar, steril bir ortam sağlayan seviye II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir. Güvenli iğne kullanımı olanlar da dahil olmak üzere standart güvenlik prosedürleri uygulanır.</li>
	<li>Hayvanın sol alt göğüs bölgesini, dairesel bir hareketle üç kez iyot bazlı veya klorheksidin bazlı bir ovma ve alkolün alternatif turlarıyla sterilize edin.</li>
	<li>Ultrason görüntüleme rehberliği altında, virüsü içeren şırınganın 30 G 1/2 iğnesini adım 1.1'de hazırlandığı gibi yerleştirin. Vücudun sol alt göğüs tarafından hayvanın göğsüne girer.</li>
	<li>İğne ucunu sol ventrikül ön serbest duvarına yaklaştırın ve yavaşça 10-15 μL virüs enjekte edin. İğnenin ucuna yakın gelişmiş parlaklık ile ultrason görüntülerinde başarılı enjeksiyonu doğrulayın. NOT: Her bölgeye enjekte edilen virüs miktarı, miyokard dokularına fiziksel zarar gelmesini önlemek için 15 μL'den fazla değildir.</li>
	<li>İğneyi kalpten çekin ve aynı miktarda virüsün ikinci ve üçüncü enjeksiyonu için sol ventrikülün diğer bölgelerine yerleştirin. NOT: Toplam enjeksiyon bölgesi sayısı deney tasarımı ile belirlenir. Fokal transgen ekspresyonu gerekiyorsa, sadece bir enjeksiyon gereklidir; Daha fazla difüzif transgen ekspresyonu gerekiyorsa, genellikle çoklu enjeksiyon bölgelerine (üç ila beş) ihtiyaç duyulur.</li>
	<li>Enjeksiyonların tamamlanmasından sonra, hayvanı kafesine geri getirin.</li>
	<li>Sternal yatışlığı korumak ve konut odasına geri döndürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı dikkatlice izleyin.</li>
	<li>Buprenorfin HCl'yi (0.1 mg / kg, fareler için günde iki kez, 0.05 mg / kg, sıçanlar için günde iki kez, deri altı) sonraki 2 gün boyunca hayvana uygulayın. Hayvanları vivaryuma geri döndürün ve olağandışı ağrı veya sıkıntı belirtileri için günlük olarak izleyin ve bulunursa, Kurumsal hayvan bakım komitesi protokollerine göre hayvanları tedavi edin.</li>
</ol>2. Kardiyak aritmi duyarlılığının değerlendirilmesi
NOT: Adenovirüs enjeksiyonundan 4-6 gün sonra ve AAV enjeksiyonundan 1-2 hafta sonra, 2.1.-2.2 adımlarını izleyerek hayvan kalplerinin kardiyak aritmilere duyarlılığını değerlendirin.
<ol><li>Sıçan veya fare kalbinin Langendorff perfüzyonunu gerçekleştirin.<ol><li>1 L suya aşağıdakileri ekleyerek tirot çözeltisi hazırlayın: NaCl, 7.9 g (son = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl2, 0,27 g (1,8 mM); MgCl 2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); ve glikoz, 1.8 g (10 mM). NaOH ile pH'ı 7,40'a ayarlayın ( bkz.</li>
		<li>Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtre ve 2.1.6.-2.2.8 adımları sırasında sürekli olarak %100 O2 kabarcığı ile filtreleyin.</li>
		<li>Heparini sıçan veya fareye uygulayın (500 U / kg, intraperitoneal enjeksiyon) ve 10 dakika sonra hayvanı% 3 izofluran ile uyuşturun. Vücutta hafif bir tutam ile yeterli anestezi sağlayın.</li>
		<li>Sol torakotomi için orta klaviküler çizgide 1-1.5 cm'lik dikey bir kesi yapmak ve kalbi açığa çıkarmak için bir neşter kullanın.</li>
		<li>Aort kemeri seviyesinde bir çift makasla keserek kalbi toplayın ve hemen kalbi buz gibi soğuk Tyrode çözeltisine koyun. NOT: Kalp toplanması sırasında kalbe zarar vermemek için dikkatli olunmalıdır.</li>
		<li>Kalbin aortunu, sabit akış hızı modunda modifiye edilmiş bir Langendorff perfüzyon sistemine (bakınız Malzeme Tablosu) bağlı künt bir iğne (sıçanlar için 18 G; fareler için 23 G) ile kanüle edin. Perfüzyon basıncını 70-80 mmHg'de tutmak için akış hızını ayarlayın. NOT: Perfüzyon iğnesindeki kabarcıklar aort kanülasyonundan önce çıkarılmalıdır. Diseksiyon mikroskobu kullanmak kanülasyonu kolaylaştırır.</li>
		<li>Kanüllenmiş kalbi, sol ventrikül yukarı bakacak şekilde silikon elastomer kaplı 9, 10 cm'lik plastik bir kaba yerleştirin ve kalbi 9,12'yi 37 ° C'de O2 kabarcıklı Tirode çözeltisi ile perfüze edin.</li>
		<li>Perfüzyonun başlangıcında, ilk iki ila üç kalp atışı sırasında kalpten kanın yıkanmasını ve kalp renginin kırmızıdan solukluğa değiştiğini gözlemleyerek doğru aort kanülasyonunu doğrulayın.</li>
		<li>Küçük bir hayvan EKG sisteminin elektrotlarını (bakınız Malzeme Tablosu) kabın içindeki silikon elastomer kaplamaya yerleştirerek kalbin etrafına yerleştirin (Şekil 1). Uyumlu bir yazılım kullanarak EKG'yi kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>Ventriküler taşiaritmileri indüklemek için adrenerjik reseptör stimülasyonu ve programlanmış elektriksel stimülasyon gerçekleştirin.<ol><li>Başarılı aort kanülasyonundan sonra, kalp hazırlığını stabilize etmek için kalbi 20 dakika boyunca Tyrode çözeltisi ile perfüze etmeye devam edin.</li>
		<li>Adım 2.2.3.-2.2.8'de kalp perfüzyonu için kullanılan Tyrode çözeltisine 1 μM izoproterenol ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>10 dakikalık izoproterenol perfüzyonundan sonra, bir elektrik stimülatörüne bağlı iki platin elektrot ile tepedeki kalbi uyarın (bkz.</li>
		<li>10 ardışık uyaranı (S1, 5 V, 100 ms aralıkları) içeren stimülasyon prosedürü (Şekil 2) ile başlayın ve bunu 80 ms'lik bir başlangıç aralığına sahip ekstra bir uyaran (S2) izler. Kalp atışı artık yakalanamayana kadar S2 aralığını her seferinde tekrar tekrar 2 ms azaltın (yani, kalbin etkili refrakter periyoduna, ERP'ye ulaşmak)13.</li>
		<li>İndüklenmiş ventriküler taşiaritmileri (ventriküler taşikardi ve fibrilasyon dahil) EKG ile izleyin.</li>
		<li>Yukarıdaki prosedür tarafından herhangi bir aritmi indüklenmezse, ERP'ye ulaşılana kadar S2'den sonra aynı başlangıç (80 ms) ve azalma (2 ms) aralıklarla başka bir ekstra uyaran (S3) ekleyin.</li>
		<li>Ventriküler taşiaritmiler hala indüklenmiyorsa, ERP'ye ulaşılana kadar S3'ten sonra aynı başlangıç ve azalma aralıklarıyla bir ekstra uyaran (S4) daha ekleyin.</li>
		<li>Ventriküler taşiaritmiler hala indüklenmiyorsa (kontrol sağlıklı kalplerde beklendiği gibi), elektriksel stimülasyon protokolünü durdurun ve kalbin indüklenemez olduğunu düşünün.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139(2020).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte-specific+deletion+of+%CE%B2-catenin+protects+mouse+hearts+from+ventricular+arrhythmias+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction.</a> Scientific Reports. 11 (1), 17722(2021).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+exercise+training+on+the+FNDC5%2FBDNF+pathway+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats.</a> Physiological Reports. 7 (24), 14323(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+Nod1%2FRIP2+signaling+is+essential+for+cardiac+hypertrophy+but+requires+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+for+signal+transductions+and+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance.</a> Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).</li>
<li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+expression+associates+with+inflammation+in+early+atherosclerosis+in+humans+and+can+be+therapeutically+silenced+to+reduce+NF-%CE%BAB+activation+and+atherogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice.</a> Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).</li>
<li>Gharibeh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+is+a+regulator+of+sinus+node+development+and+heart+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118(2021).</li>
<li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+suppression+of+Scn5a+gene+expression+mediates+cardiac+Na%2B+channel+inhibition+by+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling.</a> Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).</li>
<li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphoinositide+3-kinase+%7Balpha%7D%2C+protein+kinase+C%2C+and+L-type+Ca2%2B+channels+in+mediating+the+complex+actions+of+angiotensin+II+on+mouse+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility.</a> Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).</li>
<li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).</li>
<li>Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+complete+atrioventricular+block+recapitulates+clinical+indices+of+bradycardia+and+provides+a+platform+to+test+disease-modifying+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6930(2019).</li>
<li>Cingolani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+to+inhibit+the+calcium+channel+beta+subunit%3A+Physiological+consequences+and+pathophysiological+effects+in+models+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy.</a> Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).</li>
<li>Ionta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHOX2+overexpression+favors+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+pacemaker+cells%2C+improving+biological+pacing+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).</li>
<li>Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ventricular+refractoriness.+Effects+of+cycle+length%2C+pacing+site+and+atropine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine.</a> Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).</li>
<li>Segel, L. D., Ensunsa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+improves+stability+and+longevity+of+perfluorochemical-perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts.</a> The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).</li>
<li>Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+as+a+potential+treatment+in+ischemic+stroke+concomitant+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-NLRP3+inflammasome+activation+exacerbates+cardiac+dysfunction+after+ischemic+stroke+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes.</a> Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral-cardiac+syndrome+and+diabetes%3A+Cardiac+damage+after+ischemic+stroke+in+diabetic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state.</a> Frontiers in Immunology. 12, 737170(2021).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>Allison, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroconductive+nanoengineered+biomimetic+hybrid+fibers+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).</li>
<li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+human+cardiac+myocytes+for+medical+research%3A+Promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges.</a> Stem Cells International. 2017, 4528941(2017).</li>
<li>Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-based+treatment+of+acquired+heart+block%3A+The+battle+for+tomorrow+has+begun%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331(2017).</li>
<li>McLaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+human+recombinant+collagen+matrices+limit+adverse+remodeling+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 4866(2019).</li>
<li>Villanueva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxalase+1+prevents+chronic+hyperglycemia+induced+heart-explant+derived+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction.</a> Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).</li>
<li>Kanda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+paracrine+repair+of+injured+myocardium+using+microfluidic-based+cocooning+of+heart+explant-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells.</a> Biomaterials. 247, 120010(2020).</li>
</ol>

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

Langendorff perfüzyonlu, izole kalp preparatının başarısı için birkaç adım kritik öneme sahiptir. İlk olarak, kalp toplanması sırasında kalbe herhangi bir zarar gelmesini önlemek önemlidir (örneğin, makasla kazara sıkma veya kesme nedeniyle). İkincisi, toplanan kalbi mümkün olan en kısa sürede soğuk Tyrode çözeltisine koymak çok önemlidir, çünkü bu kalp atışını durduracak ve kalbin oksijen tüketimini azaltacaktır. Üçüncüsü, aort içine iğne yerleştirilmesi çok derin olmamalıdır – ideal olarak, iğnenin ucu aort kapak seviy...

Kardiyovasküler hastalık, dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve sadece 2017 yılında 18 milyon insanın hayatına mal olmuştur1. Kemirgenler, özellikle fareler ve sıçanlar, kullanım kolaylığı ve çeşitli transgenik aşırı ekspresyon veya nakavt çizgilerinin mevcudiyeti nedeniyle kardiyovasküler araştırmalarda en yaygın kullanılan model haline gelmiştir. Kemirgen modelleri, hastalık mekanizmalarını anlamak ve miyokard enfarktüsü2, hipertansiyon3, kalp yetmezliği4 ve ateroskleroz5'te potansiyel yeni terapötik hedefleri belirlemek için temel olmuştur. Bununla birlikte, kardiyak aritmiler çalışmalarında kemirgenlerin kullanımı, insan veya büyük hayvan modellerine kıyasla küçük kalp boyutları ve daha hızlı kalp atış hızları ile sınırlıdır. Bu nedenle, miyokard enfarktüsü sonrası farelerde veya sıçanlarda spontan ölümcül aritmiler nadirdir2. Araştırmacılar, aritmi yükünde veya pro-aritmik eğilimlerde anlamlı değişiklikler göstermeden, fibroz veya gen ekspresyonu gibi pro-aritmik bir substratı yansıtabilecek dolaylı ikincil değişikliklere odaklanmak zorunda kalmaktadır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, fare ve sıçan kalplerinin genetik modifikasyon 6,7 veya miyokard enfarktüsü2 sonrası ventriküler taşiaritmilere duyarlılığının güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan bir yöntem mevcut protokolde tanımlanmıştır. Bu yöntem, izole edilmiş, Langendorff perfüzeedilmiş 8 fare ve sıçan kalplerinde ventriküler taşiaritmileri indüklemek için adrenerjik reseptör stimülasyonunu programlanmış elektriksel stimülasyonla birleştirir.
Kemirgen miyokard dokusunda viral gen transferi için standart yaklaşımlar genellikle kalbin torakotomi 9,10,11 ile maruz kalmasını içerir, bu da invaziv bir prosedürdür ve işlemden sonra hayvanların gecikmiş iyileşmesi ile ilişkilidir. Bu makalede, transgenlerin aşırı ekspresyonu için ultrason görüntüleme rehberliğinde doğrudan intramiyokard virüs enjeksiyonu yöntemi açıklanmaktadır. Bu daha az invaziv prosedür, torakotomi ile karşılaştırıldığında, viral enjeksiyondan sonra daha hızlı hayvan iyileşmesine ve daha az doku hasarına izin verir, hayvandaki ameliyat sonrası ağrı ve iltihabı azaltır ve böylece transgenik genlerin kalp fonksiyonu üzerindeki etkilerinin daha iyi değerlendirilmesini sağlar.

<table><tbody><tr><td>30 G 1/2 PrecisionGlide İğne</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>adeno-ilişkili virüs (AAV9-GFP)</td><td>Vector Biolabs</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>adenovirus (Ad-GFP)</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>adenovirus (Ad-Wnt3a)</td><td>Vector Biolabs</td><td>ADV-276318</td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik kabini (Seviye II)</td><td>Microzone Corporation</td><td>N/A</td><td>Model #: BK-2-4</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Veterjezik</td><td>DIN 02342510</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum</td><td>Klorür Sigma-Aldrich</td><td>102378</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Saç kesme makinesi</td><td>WAHL Clipper Corporation</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton şırınga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20701</td><td>705 LT, hacim 50 & mu; L</td></tr><tr><td>Isıtma yastığı</td><td>Yaşam Markası</td><td>E12107</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Fresenius Kabi</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Fresenius Kabi Ltd.</td><td>M60303</td><td></td></tr><tr><td>İzoproterenol hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1351005</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8 yazılımı</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>EKG kaydı için</td> <td>Sürüm 8.1.5</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Fareler (Ctnnb1flox/flox)</td><td>Jackson Labs</td><td>4152</td><td></td></tr><tr><td>Fareler (&alpha; MHC-MerCreMer)</td><td>Jackson Labs</td><td>5650</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>S9i</td>, <td>Langendorff sistemi</td></tr><tr><td>MS400 dönüştürücü</td><td>için, VisualSonic, Inc.</td><td>N / A Oftalmik</td><td></td></tr><tr><td>merhem</td><td>Systane</td><td>DIN 02444062</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Langendorff sistemi için</td><td>basınç ölçer</td><td>NETECH</td><td>DigiMano 1000</td></tr><tr><td>Langendorff sistemi için</td><td>Pompa</td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-77924-65</td></tr><tr><td>Sıçan (Sprague-Dawley, erkek)</td><td>Charles River</td><td>400</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçakları</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Neşter sapı</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10007-12</td><td></td></tr><tr><td>Silikon elastomer</td><td>Down Inc.</td><td>Langendorff sistemi için</td> <td>Sylgard 184</td></tr><tr><td>Küçük hayvan EKG sistemi</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Powerlab 8/35 ve Hayvan Biyo Amp</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Stimülatör</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>VEVO3100 Klinik Öncesi Görüntüleme Sistemi</td><td>VisualSonic Inc.</td><td>Yok</td><td></td></tr></tbody></table>

kemirgen kalplerde viral transgen ekspresyonu ve kardiyak aritmi riskinin değerlendirilmesi

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Kalp hastalığı tüm dünyada önde gelen morbidite ve mortalite nedenidir. Transgenik suşların kullanım kolaylığı ve bolluğu nedeniyle, kemirgenler kardiyovasküler araştırmalar için gerekli modeller haline gelmiştir. Bununla birlikte, kalp hastalığı hastalarında sıklıkla mortaliteye neden olan spontan ölümcül kardiyak aritmiler, kalp hastalığının kemirgen modellerinde nadirdir. Bu öncelikle insan ve kemirgenler arasındaki kardiyak elektriksel özelliklerdeki tür farklılıklarından kaynaklanmaktadır ve kemirgenleri kullanan kardiyak aritmilerin incelenmesine meydan okumaktadır. Bu protokol, rekombinant virüsün (adenovirüs ve adeno ilişkili virüs) ekokardiyografi eşliğinde intramüsküler enjeksiyonlarını kullanarak fare ve sıçan ventriküler miyokardında etkili transgen ekspresyonunu sağlamak için bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu çalışma aynı zamanda, hem adrenerjik hem de programlanmış elektriksel stimülasyonlarla izole edilmiş, Langendorff perfüze fare ve sıçan kalplerini kullanarak aritmilere kardiyak duyarlılığın güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlayacak bir yöntemi özetlemektedir. Bu teknikler, miyokard enfarktüsü gibi yaralanmalardan sonra olumsuz kardiyak yeniden yapılanma ile ilişkili kalp ritmi bozukluklarını incelemek için kritik öneme sahiptir.

Burada açıklanan protokolü izleyerek perfüze edildiğinde (Şekil 1), izole edilmiş bir sıçan veya fare kalbi en az 4 saat boyunca ritmik ve kararlı bir şekilde atar. Deneysel tasarım daha uzun bir kalp perfüzyonu süresi gerektiriyorsa, uzun süreli perfüzyondan sonra miyokard ödemi oluşumunu azaltmak için perfüzyon çözeltisine albümin eklemek yararlıdır14. İzoproterenolün perfüzyon çözeltisine dahil edilmesi, miyokard enfarktüsü ve kalp yetmezliği gibi birçok aritmojeni...

Bu protokol, ekokardiyografi rehberliğinde virüsün doğrudan intramiyokard enjeksiyonu ile sıçan ve fare kalplerinde transgen ekspresyonu yöntemlerini açıklamaktadır. İzole, Langendorff perfüze edilmiş kalplerin programlanmış elektriksel stimülasyonu ile kalplerin ventriküler aritmilere duyarlılığının değerlendirilmesi için yöntemler de burada açıklanmaktadır.

Kemirgen Kalplerde Viral Transgen Ekspresyonu ve Kardiyak Aritmi Riskinin Değerlendirilmesi

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...

Bu protokol, kullanıcının ventriküler miyokardda etkili transgen ekspresyonu elde etmesini sağlayarak kardiyak aritmileri incelemek ve ventriküler dokudaki fonksiyonu incelemek için gen ekspresyon çalışmalarını kolaylaştırır. Viral transgen ekspresyonu tekniği, hayvan için minimal invazivdir, torakotomi içeren geleneksel yaklaşımlardan daha az hasara ve daha az iyileşme süresine neden olur. Küçük kemirgen kalplerinde aritmilerin indüklenmesi tekniği, kalp hastalığının küçük hayvan modellerinde aritmilere duyarlılığı değerlendirmek için yararlıdır.Prosedürü gösteren, laboratuvardan doktora sonrası bir araştırmacı olan Doktor Alice Lu olacak. Başlamak için, anestezi uygulanan farenin sol alt göğüs bölgesini, iyot bazlı veya klorheksidin bazlı bir ovmanın alternatif turlarıyla, alkolde, dairesel bir hareketle üç kez sterilize edin. Ultrason görüntüleme rehberliği altında, virüsü içeren şırınganın iğnesini hayvanın göğsüne yerleştirin.İğne ucunu sol ventrikül ön serbest duvarına yaklaştırın ve yavaşça 10 ila 15 mikrolitre virüs enjekte edin. İğnenin ucuna yakın gelişmiş parlaklık ile ultrason görüntülerinde başarılı enjeksiyonu doğrulayın. İğneyi kalpten çekin ve aynı miktarda virüsün ikinci ve üçüncü enjeksiyonu için sol ventrikülün diğer bölgelerine yerleştirin.Fare kalbinin Langendorff perfüzyonunu gerçekleştirmek için, kanüllenmiş kalbi sol ventrikül yukarı bakacak şekilde silikon elastomer kaplı, 10 santimetrelik plastik bir kaba yerleştirin. Kalbin aortunu, sabit akış hızı modunda modifiye edilmiş Langendorff profüzyon sistemine bağlı künt bir iğne ile kanüle edin. Kalbi 37 santigrat derecede oksijen kabarcıklı Tyrode çözeltisi ile aşındırın.Perfüzyonun başlangıcında, ilk iki ila üç kalp atışı sırasında kalpten kanın yıkandığını gözlemleyerek ve kalp rengini kırmızıdan solukluğa değiştirerek doğru aort kanülasyonunu doğrulayın. Perfüzyon basıncını 70 ila 80 milimetre cıvada tutmak için akış hızını ayarlayın. Onaylamadan sonra, küçük bir hayvan EKG sisteminin elektrotlarını, çanaktaki silikon-elastomer kaplamaya yerleştirerek kalbin etrafına yerleştirin.Ardından, EKG'yi uyumlu bir yazılım kullanarak kaydedin. Daha sonra, adrenerjik reseptör stimülasyonu yapın ve kalbi izoproterenol ve Tirode çözeltisi ile perfüze edin. 10 dakika sonra, bir elektrik stimülatörüne bağlı iki platin elektrot ile kalbi tepede uyararak ventriküler taşiaritmileri indüklemek için programlanmış elektriksel stimülasyon gerçekleştirin.Stimülasyon prosedürüne ilk 10 ardışık uyaran olan S1 ile başlayın, ardından 80 milisaniyelik bir başlangıç aralığı ile ekstra bir uyaran olan S2 ile devam edin. Daha sonra, kalp atışı artık yakalanamayana veya kalbin etkili refrakter periyoduna veya ERP'ye ulaşılana kadar S2 aralığını her seferinde iki milisaniye azaltın. Ventriküler taşikardi ve fibrilasyon dahil olmak üzere indüklenen ventriküler taşiaritmileri EKG ile izleyin.Aritmi indüklenmezse. ERP'ye ulaşılana kadar aynı parametrelerle S2'den sonra başka bir ekstra uyaran olan S3'ü ekleyin. Ventriküler taşiaritmiler hala indüklenmiyorsa, elektriksel stimülasyonu durdurun ve kalbin indüklenemez olduğunu düşünün.Programlanmış elektriksel stimülasyon sırasında, kalbin başarılı temposu, ardışık S1 uyaranları sırasında kalp atışının bire bir yakalanması ve S1 hızı sırasında uzamış QRS kompleksi ile doğrulanır. Bu kombine adrenerjik ve elektriksel stimülasyonlar, sağlıklı, sahte ameliyat edilen vahşi tip fare kalplerinde veya kontrol adenovirüsü-GFP enjekte edilen sıçan kalplerinde ventriküler taşiaritmilere neden olmadı. Buna karşılık, aynı protokol, miyokard enfarktüsünden sonra vahşi tip fare kalplerinin% 77'sinde ve Ad-Wnt3a'nın intramiyokard enjeksiyonundan sonra dört sıçandan üçünde ventriküler taşiaritmileri indükledi.İğneyi yerleştirirken, iğne ucunun ventrikülün içine değil, serbest duvarın içine gömüldüğünden emin olun. Ayrıca, kalbin aortunu sabitlemek ve kanüle etmek en kritik adımdır. Bu prosedürleri takiben, kalpler standart histolojik çalışmalar veya moleküler biyoloji tahlilleri için kullanılabilir.Alternatif olarak, tek hücreli elektrofizyoloji çalışmaları yapmak için canlı hücreler izole edilebilir.

viral-transgene-expression-rodent-hearts-assessment-cardiac

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Telemetrik EKG, kardiyak aritmiler ve ani kardiyak ölüm için hayvan modellerinde değerlendirilmesinde önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Burada, fareler üzerinde yapılan uzun vadeli ambulatuvar EKG monitorizasyonu uygulama için telemetrik EKG kayıtları kademeli bir kılavuz mevcut.

Farelerde ambulatuvar EKG Kaydı

Iskemik kalp yetmezliği tedavisi için gen transferi yöntemi miyokard infarktüsü domuz modeli kullanılarak açıklanmıştır. Basit ve tekrarlanabilir bir yöntem bize kolayca çeşitli gen transferlerinin etkinliğini değerlendirmek için çok basit ve tekrarlanabilir bir yol sağlar.

Klinik öncesi Model İskemik Kalp Yetmezliği Gen Transferi

Bu videoda, fare yavrusunda rekombinant adeno ilişkili virüs bazlı gen iletimini gösteriyoruz. Bu yöntem, hedeflenen hücrelerde gen ekspresyonunun incelenmesine yardımcı olur.

Rekombinant Adeno İlişkili Virüs Temelli Gen Dağıtımı: Kemirgen Modelinde Transgen Teslimi ve Kardiyak Spesifik İfade İçin Bir Teknik

Bu protokol, konfokal eğirme disk mikroskobu kullanılarak lentiviral ve adenoviral transdüksiyonu takiben primer sıçan neonatal kardiyomiyositleri kullanılarak canlı hücre görüntüleme yöntemini tanımlar. Bu, canlı kardiyomiyositlerde hücresel süreçlerin ayrıntılı gözlemlerini sağlar.

İlköğretim Rat Yenidoğan kardiyomiyositlerin Canlı Hücre Görüntüleme Adenoviral izlenerek ve Lentiviral İletimi Confocal Disk Mikroskopi Spinning kullanma

Bu makalede, fare kalbindeki gen ekspresyonunu manipüle etmek için rekombinant adeno-ilişkili virüs 9 (rAAV9) vektörlerini hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kalpler eksprese rAAV9 hazırlanması veya demonte Genler

Burada fareler bir protokol kalp özel gen manipülasyon için mevcut. Anestezi altında fare kalpler dördüncü interkostal uzayda externalized. Daha sonra kodlama belirli genler bir şırınga vivo içinde görüntüleme ve Batı ile protein ifade ölçü tarafından takip Miyokardiyum içine enjekte edildi adenovirüse bakın analiz leke.

Vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde Intramyocardial enjeksiyonla için basit ve etkili bir yöntem

Burada, bir iletişim kuralı modülasyonu intrakardiyak otonom sinir sistemi ve temel Elektrofizyoloji, arrhythmogenesis ve ex vivo Langendorff kurulumu kullanarak kamp dinamikleri üzerindeki etkisi değerlendirilmesi için mevcut.

Kardiyak Elektrofizyoloji ve Arrhythmogenesis bir Ex Vivo Langendorff sisteminde intrakardiyak nöronların etkisi

Bu çalışma, transgenik channelrhodopsin-2 (ChR2) farelerinin bozulmamış murin kalplerinin kardiyak ritmini, bir mikro-LED dizisi ile lokal fotostimülasyon ve epikardiyal membran potansiyelinin eşzamanlı optik haritalamasını kullanarak kontrol etmek için bir yöntem bildirmektedir.

Murin Kalplerde Optogenetik Çok Bölgeli Fotostimülasyon Uygulayarak İleri Kardiyak Ritim Yönetimi

İskemik kalp hastalığı için miyokard gen tedavisi, gelecekteki terapötikler için büyük umut vaat etmektedir. Burada, iskemik kalpte gen tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için büyük bir hayvan modeli sunuyoruz.

İskemik Kalpte Gen Tedavisinin Etkinliğini Değerlendirmek İçin Büyük Hayvan Modeli

Bu protokol, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip transmembran voltajının ve hücre içi Ca2+ geçici akımlarının elektrofizyolojik ölçümleri de dahil olmak üzere, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardiden etkilenen vahşi tip ve knock-in hayvanlardan elde edilen fare kalplerinin çift boyutlu optik haritalamasını sunar.

Katekolaminerjik Polimorfik Ventriküler Taşikardi RyR2R2474S Knock-In Farelerinden Kalplerin Çift Boyutlu Optik Haritalaması

Bu protokol, gelişmekte olan fare kalplerinde kalp hücrelerinin elektroporasyona dayalı transgenezi için ayrıntılı bir metodolojik çerçeve sunar. Burada sağlanan video varlıkları, bu çok yönlü tekniğin öğrenilmesini kolaylaştıracaktır.

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

Öğrenin, sıçan ve fare kalplerinde viral transgen ekspresyonu ve kardiyak aritmi riskinin değerlendirilmesi için minimal invaziv enjeksiyon tekniğini. Bu yöntem, kalp hastalığı araştırmalarında gen fonksiyonu çalışmalarına katkı sağlar.

Kemirgen Kalplerde Viral Transgen Ekspresyonu ve Kardiyak Aritmi Riskinin Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet