Name: İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Keşfedin, iç kan-retinal bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro endotel hücre transsitozu testini. Bu hayvansız yöntem, damar biyolojisi ve göz-beyin araştırmalarında moleküler mekanizmaları anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, JC'ye NIH hibeleri (R01 EY028100, EY024963 ve EY031765) ile desteklenmiştir. ZW, Knights Templar Eye Foundation Kariyer Başlangıç Bursu tarafından desteklendi.

Tüm hayvan deneyleri, Boston Çocuk Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından ışık mikroskobu ve EM görüntülerinin oluşturulması için onaylanmıştır (Şekil 3). İn vivo çalışmalar için protokoller Wang ve ark.24'ten elde edilebilir. İnsan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini (HRMEC'ler) içeren tüm deneyler, Boston Çocuk Hastanesi'ndeki Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktiflerin Hazırlanması
<ol><li>Doku kültürü kabının kaplanması için çözelti: 500 mL steril doku kültürü sınıfı 1x PBS'de (pH = 7.4) 1 mL jelatin stok çözeltisini (% 40 -% 50) çözerek% 0.1 jelatin çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtreden süzün. % 0.1 jelatin çözeltisini 2-8 ° C'de saklayın. Söz konusu sıcaklıkta steril bir durumda belirsiz bir süre saklanabilir.</li>
	<li>Büyüme ortamı: EGM takviyelerini üreticinin talimatlarına göre endotel hücre büyüme bazal ortamına (EBM) çözerek 500 mL endotel hücre büyümesi tam ortamı (EGM) hazırlayın (Malzeme Tablosu). Aliquot büyüme ortamı 50 mL tüplere dönüşür ve tüpleri 4 ° C'de saklar. Büyüme ortamının raf ömrü 4 °C'de 12 aydır.</li>
	<li>Tripsin çözeltisi:% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi için, stok şişesinden 50 mL tüplere aliquot yapın ve 4 ° C'de (2 haftaya kadar) veya -20 ° C'de (24 aya kadar) saklayın.</li>
</ol>2. HRMEC'lerin Kültürlenmesi
<ol><li>İlk hücre kültürü<ol><li>Laminer akış davlumbazının altında 5 mL %0,1 jelatin çözeltisi içeren Petri haznelerini (100 mm çap x 20 mm yükseklik) kaplayın ve homojen kaplama için oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca davlumbazda bozulmadan tutun. NOT: Bulaşıkların jelatin kaplaması hücre bağlantısını arttırır. Alternatif olarak, jelatin kaplı T75 kültür şişeleri de kullanılabilir.</li>
		<li>Hücreleri tohumlamadan önce, bir vakum pompası kullanarak jelatin çözeltisini aspire edin. Kullanılan aspiratörün vakum basıncı 724 mmHg'ye kadar çıktı. NOT: Kaplama çözeltisinin kurumasını önlemek için aspirasyon, tohumlama hücrelerinden hemen önce yapılmalıdır.</li>
		<li>Dondurulmuş bir HRMEC şişesini (sıvı azotta depolamadan) 37 ° C'de bir su banyosu kullanarak veya şişeye ılık bir büyüme ortamı ekleyerek çözün. Çözüldükten sonra, hücre süspansiyonunu 9 mL büyüme ortamına aktarın (HRMEC'lerin çözülmüş şişesinin 1 mL olduğu varsayılarak). NOT: HRMEC'ler ticari olarak elde edilmiştir (Malzeme Tablosu). Hücrelere eklenen büyüme ortamı, kullanımdan önce daima 37 ° C'ye ısıtılmalıdır.</li>
		<li>RT'de 5 dakika boyunca hücreleri 200 x g'de döndürün ve hücre peletini çıkarmamak için süpernatantı dikkatlice aspire edin.</li>
		<li>Hücre peletini 10 mL büyüme ortamında yeniden askıya alın ve elde edilen süspansiyonu jelatin kaplı bir Petri kabına aktarın. İnkübatördeki hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de tutun. Tipik olarak, HRMEC'ler 72 saat sonra% 70 -% 80 oranında akıcıdır. NOT: Büyüme ortamı her geçen gün değiştirilir.</li>
	</ol></li>
	<li>HRMEC'lerin geçirgen membran uçları üzerindeki alt kültürü<ol><li>HRMEC'leri tohumlamak için hücre kültürü filtre ekleri (0,4 μm gözenek boyutunda polikarbonat membranlı 6,5 mm'lik kesici uçlar, 24 delikli bir plakaya yerleştirilmiş) hazırlayın ve her bir kesici ucu (apikal oda) laminer bir akış başlığı altında 30 dakika boyunca 200 μL %0,1 jelatin çözeltisi ile kaplayın. Çözeltinin filtre ekinin tüm alt yüzeyini kapladığından emin olun. NOT: Her kuyucuk, gözenekli bir membranla ayrılmış apikal ve bazolateral bir odaya sahiptir.</li>
		<li>Petri kabını kültürlü HRMEC'lerle (adım 2.1.5.) inkübatörden çıkarın ve büyüme ortamını aspire edin. Potansiyel yüzen / ölü hücrelerden kurtulmak için hücreleri laminer bir akış başlığı altında 10 mL 1x PBS ile 2x hafifçe durulayın.</li>
		<li>Hücreleri 0.5-1 mL% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile ayırın ve Petri kabını 5 dakika boyunca inkübatöre (37 ° C ve% 5 CO2) yerleştirin.</li>
		<li>4.5-9 mL büyüme ortamı ekleyerek tripsin aktivitesini söndürün ve hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir pipet kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>RT'de 5 dakika boyunca hücreleri 200 x g'de döndürün, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 3 mL büyüme ortamında yeniden askıya alın.</li>
		<li>Manuel hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın ve filtre eki başına 4 x 104 hücre yoğunluğunda tohumlayın (yani, 1.25 x 105 hücre /cm2). Her kesici uç için hücre süspansiyonunun hacmi 250 μL'dir.</li>
		<li>Kaplama çözeltisini geçirgen kesici uçlar içeren kuyucuklardan aspire edin ve kesici uç başına hücre süspansiyonunun 250 μL'sini aktarın (apikal oda). Kesici uçlardan birine yalnızca ortam (yani hücreler olmadan) ekleyin ve bu da TEER ölçümü için "boş kontrol" olarak kullanılacaktır. Aynı zamanda, bazolateral odalarda kuyu başına 750 μL ortam ekleyin.</li>
		<li>Geçirgen uçlara sahip 24 delikli plakayı, kültürlenmiş hücreler tamamen kaynaşıncaya ve istenen ~20 Ω · cm2 TEER değerine ulaşılana kadar 7-12 gün boyunca inkübatörde (37 ° C ve% 5 CO2) tutun.</li>
		<li>Büyüme ortamını her geçen gün değiştirin. Ortam değişimi sırasında, hücre tek katmanının bozulmasını en aza indirmek için ortamı dikkatlice aspire edin ve apikal ve bazolateral odalara sırasıyla kuyucuk başına 250 μL ve 750 μL taze ortam ekleyin. NOT: Büyüme ortamı, kuyuların hem apikal hem de bazolateral odaları için değiştirilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. TEER ölçümleri (Şekil 4)
<ol><li>14. günde hücre tohumlama sonrası (adım 2.2.9.), HRMEC'ler için TEER'yi epitel volt-ohm metre (EVOM) elektriksel direnç (ER) sistemi (Malzeme Tablosu) kullanarak aşağıdaki gibi ölçün.</li>
	<li>ER sistemini önceden şarj edin ve STX04 test elektrodunu kullanarak ölçüm cihazının işlevselliğini kontrol edin. Gerekirse kalibre edin.</li>
	<li>Elektrodu sayaca bağlayın ve elektrodu önce 15-20 dakika boyunca% 70 etanol içine batırarak ve daha sonra hücre kültürü EGM büyüme ortamına kısaca batırarak dengeleyin.</li>
	<li>Bu arada, sıcaklık dengesi için hücre içeren 24 delikli plakayı RT'deki laminer akış davlumbazında 15-20 dakika tutun. NOT: TEER ölçümleri sıcaklıktan etkilenir, bu nedenle dengeleme adımı esastır.</li>
	<li>TEER ölçümü için, kuyuların hem apikal (250 μL) hem de bazolateral (750 μL) odalarına taze büyüme ortamı ekleyin.</li>
	<li>Elektrotu, kısa uç kesici uçta olacak ve daha uzun uç kuyucuğun dibine değecek şekilde dikkatlice daldırarak TEER ölçümü gerçekleştirin. Önce boş kontrol boyunca direnci ölçün. Her kesici uç için TEER'i üçlü olarak ölçün. NOT: Ölçümler arasında elektrodu durulamak için kültür ortamı kullanılır. Sabit okumalar için elektrotun kesici ucun altına 90° açıyla tutulduğundan emin olun.</li>
	<li>TEER = net direnç (Ω) x filtre ekinin yüzey alanı (cm2) formülünü kullanarak tek katman boyunca elektrik direncini (Ω·cm2 cinsinden) hesaplayın; burada net direnç, her bir kuyucuğun direnci (hücrelerle büyüme ortamı) ile boş kuyu (sadece büyüme ortamı) arasındaki farktır.</li>
	<li>Hücrelerin daha fazla tedavisini ancak TEER değeri ~ 20 Ω · cm2'ye ulaştıktan sonra gerçekleştirin. İstenilen TEER seviyesine ulaşılamazsa, plakayı inkübatörde tutun ve ertesi gün TEER'yi ölçün. NOT: HRMEC akıcılığı, tipik parke taşı morfolojisi ile hücre şeklinin morfolojik incelemesi (mikroskop altında) ve / veya immünohistokimya boyaması ile ayrı ayrı hücre bağlantı proteinlerinin varlığı ile de doğrulanabilir.</li>
</ol>4. Transsitoz testi
<ol><li>Cy3 etiketli transferrin kullanılarak klatrin aracılı in vitro transsitoz testi (Şekil 5)<ol><li>20 Ω·cm2 civarında TEER değerleri ile akıcılığa ulaştıktan sonra, serum, ligand ile tedaviden önce her iki odacıkta (apikal oda:250 μL ve bazolateral odacık: 750 μL) EBM'de (serum indirgenmiş ortam) %0.5 FBS kullanarak hücreleri 37 °C'de 24 saat ve %5 CO 2 ile mahrum bırakır. Serum azaltılmış EBM tahlil boyunca kullanıldı.</li>
		<li>Apikal odadaki hücreleri (adım 4.1.1'de serum indirgenmiş ortamı kullanarak), floresan (siyanin 3) etiketli transferrin ligand (Cy3-Tf) (40 μg / mL'lik son konsantrasyon) ile 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Cy3-Tf içeren plakalar, alüminyum folyoya sarılarak ve deneyi ışıklar kapalıyken bir hücre kültürü davlumbazında gerçekleştirerek Cy3-Tf'nin fotobeyazlatmasını önlemek için ışıktan korunmalıdır.</li>
		<li>1 saat sonra, plakayı buz üzerine yerleştirin ve serbest bağlanmamış Cy3-Tf'yi çıkarmak için tek katmanlı apikal ve bazolateral olarak 4x (yıkama başına 3-5 dakika) RT'de serum azaltılmış ortamla yıkayın. NOT: Serbest izleyici moleküllerini çıkarmak ve parasellüler yoldan potansiyel sızıntı olmadan transsitozun doğru okunmasını sağlamak için yıkama şarttır.</li>
		<li>Hücre içeren iyice yıkanmış filtre eklerine taze serum azaltılmış ortam (adım 4.1.1'de olduğu gibi.) ekleyin ve kesici uçları, önceden ısıtılmış serum indirgenmiş ortam içeren 24 delikli plakanın taze kuyucuklarına aktarın.</li>
		<li>Hücreleri inkübatörde 90 dakika daha (37 ° C ve% 5 CO2) inkübe edin ve ardından ortamı bazolateral odadan toplayın.</li>
		<li>Bir floresan dedektörü kullanarak çözeltinin floresan yoğunluğunu bazolateral odadan kaydedin. Göreceli floresan birimleri (RFU) olarak ölçülen floresan yoğunluğu seviyeleri, klatrin bağımlı transsitoz yoluyla HRMEC tek katmanı boyunca transsitozlanan Cy3-Tf kompleksinin miktarını gösterir.</li>
	</ol></li>
	<li>HRP kullanılarak kaveola aracılı in vitro transsitoz testi (Şekil 6)<ol><li>20 Ω· cm2 civarında TEER değerleri ile tam akıcılığa ulaştıktan sonra, serum tedaviden önce (adım 4.1.1'de olduğu gibi) % 0.5 FBS içeren EBM ortamı (serum indirgenmiş ortam) kullanarak, 37 ° C'de24 saat ve% 5 CO 2 için hücreleri mahrum eder. Serumla indirgenmiş EBM ortamı tüm tahlil boyunca kullanıldı.</li>
		<li>Apikal odadaki hücreleri istenen tedaviler ve araç kontrolleri ile tedavi edin. NOT: Burada, HRMEC'lerde Wnt sinyal yolu tarafından kaveola aracılı transsitozun düzenlenmesini göstermek için Wnt modülatörlerini örnek olarak kullandık: insan rekombinant Norrin ve Wnt inhibitörü XAV939. Tipik bir deneyde, hücreler aşağıdaki konsantrasyonlarla bir inkübatörde (37 ° C ve% 5 CO2) 24 saat boyunca tedavi edildi: Norrin (125 ng / mL), Norrin (125 ng / mL) + XAV939 (10 μM) ve araç kontrol çözeltisi. Ek olarak, Wnt3a şartlandırılmış ortam (L Wnt-3A hücrelerinden üretilen) de kullanılmıştır.</li>
		<li>Apikal odadaki hücreleri HRP (5 mg / mL) ile 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Daha sonra, 24 delikli plakayı buzun üzerine yerleştirin ve serbest hücre dışı HRP'yi çıkarmak için apikal ve bazolateral odaları P tamponu (10 mM HEPES pH = 7.4, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM glikoz, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) ile yoğun bir şekilde 6x yıkayın. NOT: Serbest izleyici moleküllerini çıkarmak ve parasellüler yoldan potansiyel sızıntı olmadan transsitozun doğru okunmasını sağlamak için yıkama şarttır.</li>
		<li>Apikal hazneye taze serum azaltılmış ortam (adım 4.1.1'de olduğu gibi.) ekleyin ve kesici uçları önceden ısıtılmış ortam içeren taze bir kuyuya aktarın.</li>
		<li>Ortamı bazolateral odadan toplamadan önce tek katmanı inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 90 dakika daha inkübe edin.</li>
		<li>Toplanan ortama, üreticinin talimatlarına göre 100 μL HRP florojenik peroksidaz substratı (Malzeme Tablosu) ekleyin ve 100 μL Stop çözeltisi ile reaksiyonu durdurmadan önce RT'de 10 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Bir floresan plaka okuyucu kullanarak ortamdaki HRP substrat reaksiyon ürününün seviyelerini tespit edin. Floresan yoğunluğunu 420 nm emisyon dalga boyunda (325 nm uyarma ile) ve göreceli floresan birimleri (RFU) olarak ölçün. Değerler, kaveola aracılı transsitoz yoluyla HRMEC tabakası boyunca transsitoz edilen HRP seviyesini gösterir. NOT: Burada kullanılan floresan ürün (Malzeme Tablosu) fotobeyazlatıcı değildir. Fotobeyazlatmaya karşı ışık koruması gerekli değildir.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklanacak çıkar çatışmaları veya finansal çıkarları yoktur.

BRB, retina sağlığı ve hastalığında önemli bir rol oynar. Vasküler geçirgenliği değerlendiren in vitro tekniklerin, bariyer (BRB/BBB) gelişimi ve fonksiyonu ile ilgili çalışmalarda çok önemli araçlar olduğu kanıtlanmıştır. Burada açıklanan prosedür, EC transsitozunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek veya BRB geçirgenliğini etkileyen ilgili moleküler modülatörleri değerlendirmek için kullanılabilir. İn vitro EC transsitoz tahlilleri, in vivo testlere veya vasküler geçirgenliği değ...

İnsan retinası, vücuttaki en yüksek enerji gerektiren dokulardan biridir. Nöral retinanın düzgün çalışması, retinal çevreyi korumak için kan-retinal bariyer (BRB) aracılığıyla aracılık edilen diğer potansiyel olarak zararlı moleküllerin sınırlı bir akışı ile birlikte verimli bir oksijen ve besin kaynağı gerektirir1. Merkezi sinir sistemindeki kan-beyin bariyerine (BBB) benzer şekilde, BRB gözde seçici bir bariyer görevi görür ve iyonların, suyun, amino asitlerin ve şekerin retinanın içindeki ve dışındaki hareketini düzenler. BRB ayrıca bağışıklık hücreleri, antikorlar ve zararlı patojenler gibi dolaşım faktörlerine maruz kalmayı önleyerek retinal homeostazı ve bağışıklık ayrıcalığını korur2. BRB disfonksiyonu, diyabetik retinopati, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), prematüre retinopatisi (ROP), retinal ven tıkanıklığı ve üveit gibi çeşitli vasküler göz hastalıklarının patofizyolojisine katkıda bulunur ve vazojenik ödem ve ardından görme kaybına neden olur 3,4,5.
BRB, sırasıyla iki ayrı oküler vasküler ağ için iki ayrı bariyerden oluşur: retina vaskülatürü ve retinanın altındaki federe koryokapillaris. İç BRB (iBRB) esas olarak retinal nöronal tabakaları besleyen retinal mikrovasküler endotel hücrelerinden (RMEC'ler) oluşur. Öte yandan, retinal pigment epiteli, nörosensoriyel retina ve koryokapillaris2 arasında yer alan dış BRB'nin ana bileşenini oluşturur. iBRB için, RMEC'ler arasında moleküler taşıma hem parasellüler hem de hücreler arası yollardan gerçekleşir (Şekil 1). iBRB boyunca yüksek derecede madde seçiciliği, (i) bitişik endotel hücreleri (ECs) arasındaki parasellüler taşımayı kısıtlayan bileşke protein komplekslerinin varlığına ve (ii) endotel hücreleri içindeki düşük transsellüler arası taşıma oranlarını koruyan kaveola mediatörlerinin, taşıyıcılarının ve reseptörlerinin düşük ekspresyon seviyelerine dayanır 1,6,7,8 . Parasellüler akıyı düzenleyen kavşak kompleksleri, suyun ve küçük suda çözünür bileşiklerin geçişine izin veren sıkı kavşaklardan (klodinler, oklüdinler), ader kavşaklardan (VE kadherinler) ve boşluk kavşaklarından (konneksinler) oluşur. Küçük lipofilik moleküller RMEC'lerin iç kısmına pasif olarak yayılırken, daha büyük lipofilik ve hidrofilik moleküllerin hareketi, veziküler transport ve membran taşıyıcıları dahil olmak üzere ATP güdümlü trans-endotel yolları tarafından düzenlenir 5,9.
Veziküler transsitoz, kaveolin aracılı kavooler transsitoz, klatrin bağımlı (ve reseptör aracılı) transsitoz ve klatrin bağımsız makropinositoz olarak sınıflandırılabilir (Şekil 2). Bu veziküler taşıma işlemleri, makropinozomlar en büyük (200-500 nm arasında değişen) ve kaveoller en küçüğü (ortalama 50-100 nm) olan farklı büyüklükteki vezikülleri içerirken, klatrin kaplı veziküller 70-150 nm10 arasında değişmektedir. Kaveolalar, esas olarak lipit membran kolesterolünü ve diğer yapısal ve sinyal proteinlerini kaveolin-iskele alanları 11 aracılığıyla bağlayan kaveolin-1'den oluşan bir protein kaplaması ile şişe şeklinde lipit bakımından zengin plazma membran invaginasyonlarıdır11. Kaveolinler, plazma zarı12'de kaveola stabilizasyonunu teşvik etmek için periferik olarak bağlı kavain ile birlikte çalışır. Kaveoler membranlar ayrıca endotel hücreleri arasındaki hareketlerine yardımcı olmak için insülin, albümin ve yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) dahil olmak üzere dolaşımdaki lipoproteinler gibi diğer moleküller için reseptörler taşıyabilir13. Gelişim sırasında, fonksiyonel BRB oluşumu EC transsitoz8'in baskılanmasına bağlıdır. Bu nedenle, olgun retinal endotel, fizyolojik koşullar altında diğer endotel hücrelerine göre nispeten düşük seviyelerde kaveola, kaveolin-1 ve albümin reseptörlerine sahiptir ve bariyer özelliklerine katkıda bulunur 4,9.
iBRB parçalanması birçok patolojik göz rahatsızlığının önemli bir özelliği olduğundan, retinal vasküler geçirgenliği in vivo ve in vitro olarak değerlendirmek için yöntemler geliştirmek esastır. Bu yöntemler, tehlikeye atılmış BRB bütünlüğünün mekanizmaları hakkında olası bilgiler sağlamaya ve potansiyel terapötik hedeflerin etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olur. Mevcut in vivo görüntüleme veya kantitatif vasküler kaçak tahlilleri tipik olarak floresan (sodyum floresein ve dekstran), kolorimetrik (Evans Blue boya ve yaban turpu peroksidaz [HRP] substratı) veya radyoaktif izleyiciler14 kullanarak vaskülatürden mikroskop görüntüleme ile veya izole doku lizatında çevredeki retinal dokulara ekstravazasyonu tespit eder. Vasküler bütünlüğü ölçmek için ideal bir izleyici, sağlıklı ve sağlam kılcal damarlarla sınırlıyken tehlikeye girmiş damarlara serbestçe nüfuz edecek kadar inert ve büyük olmalıdır. Canlı fundus floresein anjiyografide (FFA) sodyum floresein veya floresein izotiyosiyanat-konjuge dekstran (FITC-dextran) veya izole retinal düz montajlarda kullanılan yöntemler, retinal ekstravazasyonun in vivo veya ex vivo olarak ölçülmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. FITC-dextran, boyut seçici çalışmalar için 4-70 kDa arasında değişen farklı moleküler ağırlıklarda bulunma avantajına sahiptir15,16,17. FITC-albümin (~ 68 kDa), vasküler sızıntı çalışmaları için biyolojik açıdan uygun alternatif bir büyük boyutlu protein izleyicisidir18. İntrakardiyalolarak 19, retro-orbital veya kuyruk damarı 20 yoluyla enjekte edilen Evans Blue boyası, çoğunlukla spektrofotometrik tespit veya daha az yaygın olarak, düz montajlarda floresan mikroskobu ile ölçülebilen büyük bir molekül oluşturmak için endojen albümin ile bağlanmasına da dayanır20,21. Bununla birlikte, bu kantitatif veya hafif görüntüleme metodolojileri genellikle parasellüler transportu trans-endotelyal transporttan ayırmaz. Transsitozlu veziküllerin ultrastrüktürel görselleştirmesi ile transsitozun spesifik analizi için, HRP gibi izleyici moleküller tipik olarak bir elektron mikroskobu22,23,24 altında gözlemlenebilen endotel hücreleri içindeki transsitozlu vezikülleri bulmak için kullanılır (Şekil 3A-C).
Endotel hücre geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro iBRB modellerinin geliştirilmesi ve kullanılması, in vivo deneyleri tamamlamak ve vasküler sızıntının moleküler düzenleyicilerinin araştırılmasına yardımcı olmak için sağlam ve yüksek verimli bir değerlendirme sağlayabilir. Sıkı kavşakların parasellüler transportunu ve bütünlüğünü değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan testler arasında trans-endotelyal elektriksel direnç (TEER), iyonik iletkenlik ölçüsü (Şekil 4) 2,25 ve küçük moleküler ağırlıklı floresan izleyiciler kullanılarak in vitro vasküler sızıntı testi26 bulunmaktadır. Ek olarak, klatrin bağımlı transsitoz27'yi araştırmak için BBB'yi modelleyen transferrin bazlı transsitoz tahlilleri kullanılmıştır. Buna rağmen, BRB'yi ve daha spesifik olarak retinal EC kaveoler transsitozunu in vitro olarak değerlendirmek için yapılan testler sınırlıdır.
Bu çalışmada, iBRB geçirgenliğini ve EC transsitozunu belirlemek için in vitro model olarak insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin (HRMEC'ler) kullanıldığı bir EC transsitoz testi tanımlanmıştır. Bu tahlil, HRMEC'lerin sırasıyla reseptör aracılı veya kaveola bağımlı transsitoz yolları aracılığıyla transferrin veya HRP'yi taşıma yeteneğine dayanır (Şekil 2). Apikal odada (yani filtre ekinde) tam akıcılığa kadar kültürlenmiş HRMEC'ler, sadece EC transsitozu yoluyla alt odaya aktarılan transferrin veya HRP seviyelerine karşılık gelen floresan yoğunluğunu ölçmek için floresan konjuge transferrin (Cy3-Tf) veya HRP ile inkübe edildi. Hücre tek katmanının akıcılığı, sıkı bağlantı bütünlüğünü gösteren TEER ölçülerek doğrulanabilir25. TEER ve transsitoz testi tekniğini göstermek için, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF)28 ve Wnt sinyallemesindekiler (Wnt ligandları: Wnt3a ve Norrin)29 dahil olmak üzere vasküler geçirgenlik ve EC transsitozunun bilinen moleküler modülatörleri kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Biyolojik Güvenlik Kabini&nbsp;</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü petridish&nbsp;</td><td>Nest Biyoteknoloji</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüjü&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri (15 mL)</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Santrifüj tüpleri (50 mL)</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Siyanin 3-İnsan Transferrin&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>AB_2337082</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücreli Bazal Ortam-2 (EBM-2)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Ortamı-2 (EGM-2) SingleQuots takviyeleri</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EVOM Millicell Elektrik Direnç Sistemi-2 (ERS-2)</td><td>Milipore</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4102B</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre (2 çipli)</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N002</td><td></td></tr><tr><td>Yaban turpu Peroksidaz (HRP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8250</td><td></td></tr><tr><td>İnsan retinal mikrovasküler endotel hücreleri (HRMEC)</td><td>Hücre Sistemleri</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Termo Elektron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>L hücreler (Kontrol şartlandırılmış ortam için)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2648</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A hücreleri (Wnt3A şartlandırılmış ortam için)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Çok Modlu Plaka Okuyucu</td><td>EnSight, PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS) tampon (1x)</td><td>GIBCO</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>QuantaBlu Florojenik Peroksidaz Substrat kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15169</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan Norrin (rhNorrin)</td><td>R& D Systems</td><td>3014-NR</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan Vasküler endotelyal büyüme faktörü (rhVEGF)</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi (0.22 & mikro; m)</td> <td>Millipore SLGP033RS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transwell ekleri (6,5 mm transwell, 0,4 &mikro; m gözenekli polyester membran eki)</td><td>Corning Inc.</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25) (1x)</td> <td>GIBCO</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Su</td><td>banyosu Hassas, Thermo Fisher Scientific</td><td>51221060</td><td></td></tr><tr><td>XAV939 (Wnt/&beta; -katenin İnhibitörü)</td> <td>Selleckchem</td><td>S1180</td><td></td></tr></tbody></table>

İç kan-retinal bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro model olarak endotel hücre transsitozu testi

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Kan-retina bariyerinin (BRB) işlev bozukluğu, sıklıkla retinal ödem ve ardından görme kaybına neden olan çeşitli vasküler göz hastalıklarının patofizyolojisine katkıda bulunur. İç kan-retina bariyeri (iBRB) esas olarak fizyolojik koşullar altında düşük geçirgenliğe sahip retinal vasküler endotelden oluşur. Düşük geçirgenliğin bu özelliği, bitişik retinal mikrovasküler endotel hücreleri arasındaki düşük parasellüler taşıma oranları ve ayrıca bunlar aracılığıyla transsellüler transport (transsitoz) ile sıkı bir şekilde düzenlenir ve korunur. Retinal transsellüler bariyer geçirgenliğinin değerlendirilmesi, sağlık ve hastalıkta iBRB bütünlüğü hakkında temel bilgiler sağlayabilir. Bu çalışmada, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini (HRMEC'ler) kullanarak iBRB geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro bir model olarak endotel hücresi (EC) transsitoz testi tanımlanmıştır. Bu tahlil, HRMEC'lerin sırasıyla reseptör ve kaveola aracılı transsellüler transport süreçlerinde transferrin ve yaban turpu peroksidazını (HRP) taşıma yeteneğini değerlendirir. Gözenekli membran üzerinde kültürlenen tam akışkan HRMEC'ler, EC monokatmanındaki transsitoz seviyelerinin göstergesi olarak, alt odaya aktarılan transferrin veya HRP seviyelerini ölçmek için floresan etiketli transferrin (klatrin bağımlı transsitoz) veya HRP (kaveola aracılı transsitoz) ile inkübe edildi. iBRB'yi düzenleyen bilinen bir yol olan Wnt sinyali, kaveola aracılı HRP bazlı transsitoz testi yöntemini göstermek için modüle edildi. Burada açıklanan EC transsitoz testi, vasküler patolojilerde EC geçirgenliğinin ve iBRB bütünlüğünün moleküler düzenleyicilerini araştırmak ve ilaç dağıtım sistemlerini taramak için yararlı bir araç sağlayabilir.

Retinal vasküler endotelin EM görüntülerinde transsitotik veziküler transportu ve endotel hücrelerinde kavoler veziküller in vivo olarak görülmektedir. EC transsitoz, retinal kesitler içinde, HRP içeren kan damarlarını yansıtan koyu kahverengi çökelti ile ışık mikroskobu altında (Şekil 3A) ve HRP içeren transsitotik veziküllerin göstergesi olan elektron yoğun çökelti olarak (Şekil 3B, C) transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kull...

Bu protokol, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin kaveola aracılı transsellüler taşıma süreçlerinde yaban turpu peroksidazını hücreler arasında taşıma yeteneğini ölçerek iç kan-retinal bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için bir model olarak in vitro endotel hücre transsitozu testini göstermektedir.

İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Bu protokol, endotel transsitozuna özel bir odaklanma ile kan-retinal veya kan-beyin bariyeri gibi seçici vasküler bariyerlerin işlevini ve geçirgenliğini incelemek için yararlı bir hücre bazlı model sağlar. Bu tahlilin kurulumu ve kullanımı canlı hayvan gerektirmeden kolaydır. Endotel hücre geçirgenliğinin ve iç kan-retinal bariyer bütünlüğünü etkileyen transsitozun çeşitli moleküler düzenleyicilerinin araştırılmasında kullanılabilir.Bu tahlil, vasküler biyoloji ve göz ve beyin araştırmaları hakkında fikir verebilir, BRB BBB kontrolünün altında yatan molekül mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını ve bariyerler boyunca potansiyel ilaç dağıtımının araştırılmasını sağlar. Başlamak için, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini veya HRMEC'leri tohumlamak için hücre kültürü filtre eklerini hazırlayın, her bir eki laminer bir akış başlığı altında 30 dakika boyunca 200 mikrolitre% 0.1 jelatin çözeltisi ile kaplayın. Çözeltinin filtre ekinin tüm alt yüzeyini kapladığından emin olun.37 santigrat derecede inkübe edilmiş kültürlü HRMEC'ler ve% 5 karbondioksit içeren bir Petri kabı alın ve büyüme ortamını aspire edin. Potansiyel yüzen veya ölü hücrelerden kurtulmak için hücreleri laminer akış başlığının altında 10 mililitre 1X PBS ile iki kez nazikçe durulayın. Hücreleri 0.5 ila 1 mililitre% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile ayırın ve Petri kabını inkübatöre 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 5 dakika boyunca yerleştirin.4,5 ila 9 mililitre büyüme ortamı ekleyerek tripsin aktivitesini söndürün ve hücre süspansiyonunu 10 mililitrelik bir pipet kullanarak 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 kez g'de döndürün. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve peleti 3 mililitre büyüme ortamında yeniden askıya alın.Manuel bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın ve filtre eki başına 40.000 hücre yoğunluğunda tohumlayın. Her bir kesici uç için hücre süspansiyonunun hacmi 250 mikrolitredir. Kaplama çözeltisini geçirgen kesici uçlar içeren kuyucuklardan aspire edin ve kesici uç başına 250 mikrolitre hücre süspansiyonu aktarın, ardından kesici uçlardan birine sadece orta ekleyin, bu da transendotelyal elektrik direnci veya TEER ölçümü için boş bir kontrol olarak kullanılacaktır.Aynı zamanda, bazolateral odalarda kuyu başına 750 mikrolitre ortam ekleyin. Kültürlenmiş hücreler tamamen kaynaşana ve santimetre kare başına yaklaşık 20 ohm istenen TEER değerine ulaşılana kadar inkübatörde geçirgen uçlu 24 delikli plakayı 7 ila 12 gün boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte tutun. TEER ölçümlerinden önce, hücre içeren 24 delikli plakayı, sıcaklık dengesi için oda sıcaklığında laminer akış başlığına 15 ila 20 dakika boyunca yerleştirin.HRMEC'ler için TEER'yi ölçmek için, bir epitel volt / ohm metre elektrik direnci sistemi kullanarak, elektrodu metreye bağlayın ve elektrodu önce 15 ila 20 dakika boyunca% 70 etanol içine batırarak ve daha sonra hücre kültürü EGM büyüme ortamına kısaca batırarak dengeleyin. Elektrotu dikkatlice daldırarak TEER ölçümü yapın, böylece kısa uç kesici uçta olur ve uzun uç kuyucuğun dibine temas eder. Önce boş kontrol boyunca direnci ölçün, ardından her kesici uç için TEER'yi üçlü olarak ölçün.20 ohm santimetrekare civarında TEER değerleri ile akıcılığa ulaştıktan sonra, ligand ile tedaviden önce her iki odada EBM'de% 0.5 FBS kullanarak, hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat ve% 5 karbondioksit kullanarak% 5 karbondioksitten mahrum bırakın. Serum azaltılmış EBM tahlil boyunca kullanıldı. Apikal odadaki serum indirgenmiş ortamı kullanarak hücreleri, floresan siyanin-3 etiketli olarak, 37 santigrat derecede 60 dakika boyunca transferrin ligandına kadar inkübe edin.Tek katmanı apikal ve bazolateral olarak serum indirgenmiş ortam ile 4 kez yıkadıktan sonra, hücreleri içeren filtre uçlarına taze ortam ekleyin ve ekleri önceden ısıtılmış serum indirgenmiş ortam içeren 24 delikli plakanın taze kuyucuklarına aktarın. Hücreleri inkübatörde 90 dakika daha inkübe edin ve daha sonra ortamı bazolateral odadan toplayın. Bir floresan dedektörü kullanarak çözeltinin floresan yoğunluğunu bazolateral odadan kaydedin.20 ohm santimetrekare civarında TEER değerleri ile akıcılığa ulaştıktan sonra, ligand ile tedaviden önce her iki odadaki EBM'de% 0.5 FBS kullanarak, hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat ve% 5 karbondioksit kullanarak% 5 karbondioksitten mahrum bırakın. Serum azaltılmış EBM tahlil boyunca kullanıldı. Daha sonra, apikal odadaki hücreleri istenen tedaviler ve araç kontrolleri ile tedavi edin.Hücrelere mililitre yaban turpu peroksidaz veya HRP başına 5 miligram ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Apikal hazneye taze serum azaltılmış ortam ekleyin ve kesici uçları önceden ısıtılmış ortam içeren taze bir kuyuya aktarın. Tek katmanı inkübatörde 90 dakika daha inkübe edin.Bazolateral odadan ortam topladıktan sonra, toplanan ortama 100 mikrolitre HRP florojenik peroksidaz substratı ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ile reaksiyonu durdurun ve bir floresan plaka okuyucu kullanarak ortamdaki HRP substrat reaksiyon ürününün seviyelerini tespit edin. İn vitro transsitoz tahlilleri gösterilmeden önce, retinadaki endotel hücre transsitozunun görüntülenmesi arka plan bilgisi olarak gösterilir.Burada, ışık mikroskobu görüntüsü, DAB ile boyanmış 3 aylık vahşi tip bir fare retina bölümünden HRP dolu bir kan damarı lümenini göstermektedir. HRP retro-orbital olarak enjekte edildi. HRP dolgulu retinal damarlar, ışık mikroskobu altında koyu kahverengi çökelti olarak görülebilir.Transmisyon elektron mikroskobu ultra ince kesit, iç kan-retinal bariyer boyunca EC transsitozunu gösteren RMEC'li HRP dolgulu transsitotik damarları gösterir. Burada, büyük vezikül potansiyel olarak makropinozomu ve luminol tarafındaki kırmızı kan hücresini yansıtır. TeM görüntüsü, RMEK içinde HRP dolu küçük transsitotik vezikülleri, muhtemelen caveola veziküllerini göstermektedir.CAV-1 antikoru ve izolektin B4'ün immünohistokimya boyaması, 3 aylık vahşi tip fare retinasında, retinal kan damarlarında caveola veziküllerinin bir belirteci olan CAV-1'in lokalizasyonunu göstermektedir. Retinal endotel hücreleri içindeki immünoaltın etiketli CAV-1'in TeM görüntüsü, CAV-1 pozitif caveola vezikülünün büyütülmüş bir görüntüsü ile burada gösterilmiştir. Transferrin kullanan HRMEC'lerde klatrin aracılı EC transsitoz testi için, burada, bir floresan mikroskobu görüntüsü, mavi renkte DAPI ile boyanmış HRMEC'ler içinde kırmızı renkte endositozlu Cy3 transferrini göstermektedir.HRP kullanan kaveola aracılı EC transsitozu için, buradaki Wnt sinyalizasyonu testi göstermek için örnek olarak kullanılmıştır. Wnt sinyalizasyonunun son zamanlarda kaveola aracılı EC transsitozunu düzenlediği bulunmuştur. Hücreler, Wnt sinyal inhibitörü XAV939 ve reaktif kontrolleri olan veya olmayan Wnt yol aktivatörü Wnt3a şartlı ortam ve rekombinant Norrin ile tedavi edildi.Wnt aktivatörleri, XAV939 tarafından tersine çevrilen HRP bazlı transsitoz seviyesini düşürdü. Tek katmanlı bütünlüğü belirlemek için doğru TEER ölçümü çok önemlidir. Yanlış kullanım, sıcaklık dalgalanmaları, kültür ortamı, kültür süresi vb. gibi çeşitli faktörlerden büyük ölçüde etkilenir.Bu test, in vivo koşulları taklit eden ko-kültür veya 3D organotipik kültür sistemleri olarak değiştirilebilir.

endothelial-cell-transcytosis-assay-as-an-vitro-model-to-evaluate

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, sodyum floresein molekülleri kullanılarak in vitro kan-beyin bariyerinin geçirgenliğini değerlendirmek için bir geçirgenlik testi açıklanmaktadır.

Kan-Beyin Bariyeri Mimik Geçirgenlik Deneyi: BBB Mimikinin İzleyici Moleküllere Geçirgenliğini Değerlendirmek İçin İn Vitro Test

Bu video, in vitro olarak fare beyni mikrovasküler endotel hücrelerinde transendotelyal elektrik direncini (TEER) değerlendirmek için bir yöntemi göstermektedir. Yüksek bir TEER değeri, sağlam endotel hücre bağlantılarını gösterirken, aktive edilmiş T hücrelerinin eklenmesi, bağlantı bariyerinin bozulmasını yansıtan TEER değerini düşürür.

Transendotelyal Elektrik Direncinin İn Vitro Kan-Beyin Bariyeri Modelinde Değerlendirilmesi

An<em&gt; In vivo</emKan Gemi Geçirgenlik Test&gt; Test

Birçok terapötik uygulama vücutta hücresel engelleri arasında ilaç taşıyıcıları ve yük güvenli ve etkin taşıma gerektirir. Bu makalede, gastrointestinal (GI) epitel olarak hücresel engelleri genelinde uyuşturucu nanocarriers (NCS), taşıma hızını ve mekanizmasını değerlendirmek amacıyla kurulmuş yöntemlerden bir adaptasyon açıklar.

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Bu çalışmanın amacı, singeneik fare endotelial hücreler ve astrositlerin ortak-kültür içeren bir in vitro modelinin BBB tekrarlanabilirliğini doğrulamak için oldu. Endotel hücre tek yüksek Teer ve düşük LY geçirgenliği sundu. Belirli TJ proteinlerin ekspresyonu, enflamasyon ve taşıyıcı ve reseptörlerin işlevselliğine fonksiyonel tepkileri değerlendirildi.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

Sıçan beyni, mikrovasküler endotel hücreleri ve astrositlerin bir ko-kültürüne dayalı olarak in vitro bir kan-beyin bariyeri modeli oluşturmak için bir yöntem tanımlanmış ve doğrulanmıştır. Bu sistem, nanoformülasyonun floresan moleküllerin trans-bariyer geçirgenliği üzerindeki etkisini incelemek için geçerli bir araç olduğunu kanıtladı.

Bir Sıçan Kan beyin bariyeri karşısında FITC yüklü ferritinin İn Vitro Geçirgenlik: Bir Model Nanoformulated Moleküllerin Teslim Eğitim için

Burada, aktive edilmiş T hücreleri ile etkileşim üzerine endotel hücre bütünlüğü ve geçirgenliği üzerindeki sonuçlara odaklanarak, empedans hücre spektroskopisini kullanan kan-beyin bariyerinin in vitro bir murin modelini açıklıyoruz.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Düşük maliyetli, kullanımı kolay ve güçlü bir sistem histamin tarafından uyarılan kan retina bariyer ihlali iyileştirecek potansiyel tedaviler değerlendirmek için kurulmuştur. Kan damarı sızıntı, Müller hücre aktivasyonu ve nöron sürekliliği bir potansiyel ilaç, Lipoksin A4 hasarı yanıtını ve ters değerlendirmek için kullanılır.

Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli

Burada bir fare beyin damar geçirgenliği tahlil mayi enjeksiyon kan - beyin bariyerini disfonksiyon hayvan modelleri için geçerlidir perfüzyon ardından floresan tarayıcıları kullanarak mevcut. Bir hemi-beyin geçirgenliği kantitatif değerlendirilmesi ve diğer izleme görselleştirme/immunostaining için kullanılır. Yordamı 5-6 h 10 fareler için alır.

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

Keşfedin, iç kan-retinal bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro endotel hücre transsitozu testini. Bu hayvansız yöntem, damar biyolojisi ve göz-beyin araştırmalarında moleküler mekanizmaları anlamanıza yardımcı olur.

İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi

Daha fazla video keşfet