Kuantum Noktaları Aracılı İmmüno-Etiketleme ve ardından İletim Elektron Mikroskobu ile Kalpteki Bir Proteinin Hücre Altı Lokalizasyonunu Görselleştirme

Bir proteinin hücre altı lokalizasyonunu belirlemek, uygun işlevini ve içerdiği mekanizmaları tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Bu yöntem, bir proteinin hücre altı lokalizasyonunu ultra yapı seviyesinde görselleştirmemize yardımcı olabilir. Kuantum nokta aracılı immünoetiketleme daha kararlıdır, fotobeyazlatmaya karşı dirençlidir, kendi emisyon spektrumlarına sahiptir, yüksek elektron yoğunluğu verir ve dokularda daha iyi penetrasyona sahip dokularda daha yüksek verimlilik ve retansiyon gösterir.

İşlemin çoklu adımları, yani sabitleme, aşındırma, blokaj ve optimal kuantum nokta konsantrasyonu, optimize edilmesi zor adımlardır. Kullanılan reaktiflerin birden fazla zaman noktasını ve konsantrasyonunu denemeniz önerilir. Diğer bir zorluk, sadece sabrın ve elbette pratiğin işe yaradığı ızgaraları ele almaktır.

Prosedürü gösterenler, posta görevlisi Chowdhury Abdullah, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Naznin Remex ve elektron mikroskobu hizmetlerimizden elektron mikroskobu süpervizörü Brandon Hartman olacak. Fareleri anestezi altına aldıktan ve göğüs boşluğunu açtıktan sonra, iki dakika boyunca 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda buz soğuk% 3 glutaraldehit kullanarak kalbi bollaştırın. Fiksatörleri yerçekimi basıncını kullanarak kalbe sokmak için beş x sekiz inçlik 25 gauge iğne kullanın.

Kalp fiksatif ile dolmaya başladıktan hemen sonra, basıncı hafifletmek için kalbin tepesini kaldırın. Alttaki damarları kalpten bir ila iki milimetre uzakta kesin ve sıvıların boşalmasına izin verin. Kalbi parçalara ayırın.

Atriyumu çıkarın ve ventrikülleri% 3 glutaraldehit ve 0.1 molar sodyum kakodilat içeren buz gibi soğuk% 3 glutaraldehit içeren bir Petri kabına bırakın. 30 ila 60 dakikalık fiksasyondan sonra bir kelebek kesimi yapın ve ventrikülü Petri kabına geri yerleştirin. Bir milimetreküplük küçük küpler halinde cerrahi bir bıçak kullanarak kalbi doğrayın.

Disseke edilmiş kalp dokusunu dört santigrat derecede 24 saat boyunca glutaraldehit ve kakodilat çözeltisine sabitleyin ve daldırın. 24 saatlik fiksasyondan sonra, dokuyu 20 dakika boyunca iki kez 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda yıkayın. Dokuyu sodyum kakodilat tamponundan çıkarın ve oda sıcaklığında dört saat boyunca% 2 osmiyum tetroksit çözeltisine daldırın.

Somikasyondan sonra, dokuyu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 2 sodyum asetat çözeltisine batırın. Daha sonra, dokuyu oda sıcaklığında bir saat boyunca% 2 uranil asetat çözeltisine batırın. Uranil asetat boyamasından sonra, dokuyu derecelendirilmiş alkoller ve aseton yoluyla sırayla dehidre edin.

Susuz kalmış dokuyu makalede açıklandığı gibi düşük viskoziteli epoksi reçinesine gömün. Dokuyu sekiz milimetrelik mikro kalıplarda taze reçineye koyun ve gömülü dokuyu gece boyunca 70 santigrat derecede kürleyin. İlgi alanını bulduktan sonra, ultra 45 derecelik bir bıçak kullanarak, soluk altın ultra ince bölümler üretin.

Bu ultra ince bölümleri 200 örgülü bakır ızgaranın donuk tarafına yerleştirin. Temiz bir parafin filmi üzerine 20 mikrolitre aşındırma çözeltisi metaperiodatı koyarak antijenin maskesini açarak boyamaya başlayın. Kurutulmuş ızgarayı, aşındırma çözeltisinin damlacığı üzerine doku kesitleri ile yerleştirin.

Bölüm ızgarasını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çözelti üzerinde bırakın. Kazınmış doku bölümlerini 60 saniye boyunca bir damla damıtılmış su damlacığı üzerine yerleştirerek yıkayın. Kesit ızgarasını oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 0.05 molar glisin çözeltisinden oluşan bir damlacık üzerine yerleştirerek artık aldehitleri bloke edin.

Artık glisin çözeltisini çıkarmak için ızgaranın kenarlarını filtre kağıdına dökün. Bölüm ızgarasını oda sıcaklığında 25 dakika boyunca 10 ila 20 mikrolitre blokaj çözeltisine yerleştirin. Izgara kenarlarını filtre kağıdına dökün ve ızgara bölümlerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca koşullandırmak için antikor seyreltici üzerine yerleştirin.

Izgara kesitlerini nemlendirilmiş bir odada bir saat 30 dakika boyunca primer antikor ile inkübe edin. Izgarayı kurutun ve ızgara bölümlerini her biri beş dakika boyunca iki kez antikor seyreltici ile yıkayın. Izgara kesitlerini nemlendirilmiş bir odada bir saat boyunca biyotinile sekonder antikor ile inkübe edin.

Izgara kurutulduktan sonra, ızgara bölümlerini her biri beş dakika boyunca iki kez antikor seyreltici ile yıkayın. Izgara kesitlerini ticari olarak temin edilebilen streptavidin konjuge QD'de oda sıcaklığında bir odada bir saat boyunca inkübe edin. Odayı alüminyum folyo ile kaplayarak ışığa maruz kalmayı önleyin.

Filtre kağıdı kullanarak ızgara kenarlarını kuruttuktan sonra, ızgara bölümlerini iki dakika boyunca su damlacıkları üzerine yerleştirerek yıkayın ve ızgara kenarlarını kuruması için kurutun. Numune tutucuyu mikroskop kolonuna yerleştirin ve gonyometreyi değerlendirmek için pompa anahtarını devreye sokun, ardından numune tutucunun mikroskop kolonuna tam olarak yerleştirilmesini sağlayın. İstediğiniz alana iyi odaklanın.

Yüksek hızlı bir dijital kamera kullanarak görüntüyü yakalayın ve dosyayı tif formatında kaydedin. Mitokondriyal membranlar, lizozomlar ve endoplazmik retikulum veya sarkoplazmik retikulum membran mitokondriyal arayüz, Sigmar1 etiketli kuantum noktalarının varlığını gösterdi. Kalp kesitleri, anti-Sigmar1 tavşan primer antikoru için izotip kontrolü olarak tavşan immünoglobulin G ve kuantum noktaları kullanılarak görselleştirildi.

Bu protokol üzerinde çalışırken göz önünde bulundurulması gereken önemli bir şey, antijen için maskeleme süresidir. Doku kesitleri çok uzun süre kazınırsa, metaperiodat çözeltisi ince doku kesitlerinde delikler oluşturacaktır. Kuantum nokta aracılı etiketleme, tümör tespitinde, tümör moleküler ve immün durum profillemesinde ve doku görüntülemede dikkat çekmekte ve tıbbi teşhis için yeni bir yol açmaktadır.

Kuantum noktaları, fotodinamik tedaviler ve oftalmik anomaliler yoluyla tümörlerin tedavisinde gözlere ilaç vererek de yararlıdır.