Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Bu protokol, membran bağlayıcı proteinler üzerinde çalışanlara, membran şeklinin protein montajlarının organizasyonunda nasıl bir rol oynadığını belirlemek için rehberlik edecektir. Bu tekniğin birincil avantajı, protein tipi, membran bileşimi ve membran geometrisi için çok yönlülüğüdür. Ayrıca, bir lipit çift katmanının ilişkili proteinlerin özelliklerini nasıl değiştirebileceğinin sorgulanmasına izin verir.

Deney için iyi bir zar belirlemek için, lipit difüzyon oranlarını, ilgili proteinin hareketliliğini ve patlamamış lipozomların veya yüzeye yapışmış kaynaşmış lipozomların olup olmadığını içerebilecek bir kontrol listesi oluşturmanızı öneririz. Slaytların plazma temizliğine başlamak için, plazma temizleyiciyi beş dakika boyunca oksijenle temizleyerek havayı hatlardan ve odadan uzaklaştırın. Kuru kapak camı slaytlarını seramik bir kızağa yerleştirin.

Temizleme sırasında, toz ve partikülleri gidermek için mikro kapak camı kızaklarının üzerine inert bir gaz akıtan. Beşiği plazma odasının arkasına yerleştirin, böylece kapaklar odanın uzun kenarı ile paralel olacaktır. Plazma temizleyiciyi maksimum güçte oksijenle 15 dakika çalıştırın.

Oda hazırlığı için, kapağı 0.2 mililitrelik bir PCR tüpünün buzlu kısmının hemen altında kesin. PCR tüpünün kenarını, tüpün içini önleyen UV ile aktive edilmiş yapıştırıcı ile boyayın. PCR tüp yapıştırıcısını nazikçe plazma temizlenmiş bir kapak kapağının ortasına yerleştirin, ardından yapıştırıcıyı iyileştirmek için odayı beş ila yedi dakika boyunca uzun dalga boylu UV ışığı altına yerleştirin.

Bir çift katmanlı oluşturmak için, reaktifleri kuyuya ekleyin. SUV'ları bozmak için odaları bir yandan diğer yana yavaşça sallayın ve ardından 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, fazla lipitleri yıkamak için pipetle pipetleyerek çift katmanı altı kez 150 mikrolitre SLBB ile durulayın, ardından septinlerle inkübe etmeden önce çift katmanı altı kez 150 mikrolitre reaksiyon tamponu ile yıkayın.

Son yıkama adımında, reaksiyon tamponunu çıkarın ve kuyuda 75 mikrolitre bırakın. SSB'de seyreltilmiş 25 mikrolitre septin ekleyin ve TIRF mikroskobu ile görüntüleyin. İlk olarak, silika mikrosferleri içeren şişeyi 15 saniye boyunca vorteks, daha sonra bir dakika boyunca sonikat banyosu ve herhangi bir kümeyi kırmak için 15 saniye boyunca tekrar vorteks.

Boncukları SLBB ve 10 mikrolitre beş milimolar SUV ile düşük yapışmalı bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırın. Sedimantasyonu önlemek için boncuk lipit karışımını oda sıcaklığında bir saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Bu arada, pegile edilmiş bir kapak kayışını çözün ve kesilmiş 0.2 mililitrelik bir PCR tüpünü yapıştırın.

Kuluçkadan sonra, boncukları belirlenen RCF'de 30 saniye boyunca santrifüj edin. İlk spinden sonra, 50 mikrolitre süpernatan çıkarın, ardından 200 mikrolitre PRB ekleyin ve kuvvetli pipetleme ile karıştırın. Sonraki turlar için, 200 mikrolitre PRB'yi çıkarın ve ikinci ve üçüncü spinden sonra 200 mikrolitre daha ekleyin ve dördüncü spinden sonra 220 mikrolitre PRB ekleyin.

Birden fazla boncuk boyutunda bir yarışma testi yapıyorsanız, her boncuk boyutunda eşit hacimlerde karıştırarak ve bu boncuk karışımının 29 mikrolitresini 721 mikrolitre reaksiyon tamponu ile seyrelterek reaksiyonu hazırlayın, ardından 75 mikrolitre seyreltilmiş boncuk ve SSB'de seyreltilmiş proteinin 25 mikrolitresini kuyucuklara ekleyin ve karıştırın. Septinleri sabit bir durumda ölçüyorsanız, karışımı bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve ardından TIRF'ye yakın veya konfokal mikroskopi ile görüntüleyin. Yeşil renkle gösterilen septinlerle inkübe edilen düzlemsel SLB'lerin TIRF mikrografları homojen protein dağılımı göstermiştir.

Kötü temizlenmiş cam kapaklarla yapılan SLB'ler, düşük septin bölgelerinde çift katmanda delikler veya boşluklar gösterdi. Patlamamış ve tübülasyonlu lipozomlar, eski lipozomlar kullanılırsa veya yıkamalar sıkı değilse yüzeyde birikebilir. Rodamin PE kullanılarak görselleştirilen lipit kaplı mikrosferlerin mikrografilerinde düzgün çift katmanlı birikim gösterilmiştir.

Küresel destekler membran tarafından eşit şekilde kaplandı ve birkaç boncuk kümesi vardı. Fazla lipitlerin yetersiz yıkanması, lipit kümeleri tarafından gözlemlendiği gibi düzensiz membran kaplamasına neden oldu ve yanlış kullanım, çift katmanda boşluklara neden oldu. Boncukların yetersiz karıştırılması, toplam protein emilimini ölçmek için ideal olmayan kümelenmeye neden oldu.

Burada sunulan desteklenen lipit çift katmanları kullanılarak, farklı protein-protein veya protein-membran dinamiklerini incelemek için floresan ömür boyu görüntüleme mikroskopisi, membranların kütle sitometrisi ve yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.