Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi
1 Ağustos 2022
Bu protokol, iDISCO + kullanarak bozulmamış fare beyinlerinin manyetik rezonans görüntüleme, temizleme ve immünoetiketleme yöntemlerini açıklar, ardından ışık tabakası mikroskobu kullanılarak görüntülemenin ayrıntılı bir açıklaması ve NuMorph kullanılarak aşağı akış analizleri yapılır.
Fare beynindeki yaklaşık 100 milyon hücre ve terabayt ölçeğine yaklaşan tüm beyin hücresel çözünürlüklü görüntülerin boyutlarıyla, hücreleri doğru bir şekilde ölçmek için gelişmiş görüntü analiz araçlarına ihtiyaç vardır. Hesaplamalı işlem hattımız, hücre algılama doğruluğu, görüntüleme süresi ve hesaplama kaynakları arasında makul bir uzlaşmayı korurken görüntüleri önceden işleyebilir ve fare korteksi içindeki çekirdekleri ölçebilir. Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencileri Felix Kyere ve Ian Curtin olacak.
Başlamak için, numuneyi doğru numune büyüklüğü tutucusuna monte edin, böylece numune, UltraMicroscope II mikroskobunun nominal çalışma mesafesi nedeniyle en fazla 5,2 milimetre derinlikte z-boyutu ile yönlendirilecektir. Ardından, tutucuyu, tutucunun vidası kızağın desteklerine 45 derecelik açıyla olacak şekilde numune yuvasına yerleştirin. Ardından, beşiği numune ışık yoluna dik olarak yönlendirilecek şekilde bir konuma getirin.
Daha sonra, mikroskoptaki yakınlaştırma gövdesini 4x büyütme veya daha yüksek bir değere ayarlayarak piksel başına 0,75 mikrometre üretin. Inspector Pro yazılımında, sayısal diyafram açıklığı değeri yaklaşık 0,08 olan tek bir ışık sayfası seçin. Eksenel çözünürlüğün görüntünün genişliği boyunca korunmasını sağlamak için Yatay Dinamik Odaklama'yı seçin ve lazer dalga boyuna bağlı olarak önerilen adım sayısını uygulayın.
Ardından, kayıt kanalına göre her kanal için ince odağı ve kanal özelliklerine göre kanal başına lazer gücünü ayarlayın. Ardından, levha gücünün numune boyutu için y boyutunda en uygun şekilde dağıtıldığından emin olmak için ışık tabakası genişliğini yaklaşık% 50'ye ayarlayın. Daha sonra, kutucuk sayısını numunenin boyutuna göre karolar arasında önerilen %15'lik bir örtüşme ile ayarlayın ve belirli bir döşeme konumundaki her yığın için sırayla her kanal için görüntüler yakalayın.
İlk olarak, Linux ve NuMorph görüntü işleme araçları için Conda ortam yöneticisini indirin ve yükleyin. Komut satırında matlab ve NM_setup çalıştırın. Analiz için gerekli görüntü analizi yazılım paketlerini indirmek ve yüklemek için NuMorph'tan m.
Ardından, NM_samples dosyayı düzenleyerek örnek adlarını, giriş ve çıkış dizinlerini, kanal bilgilerini ve ışık sayfası görüntüleme parametrelerini belirtin. Yoğunluk ayarı için, NMp_template bölümünde, yeni bir görüntü kümesiyle çalışırken yoğun ayarı true ve use_processed_images false olarak ayarlayın. Ardından, save_images ve save_samples true olarak ayarlayın.
Ardından, temel algoritmayı kullanarak gölgelendirme düzeltmesi uygulamak için karo gölgelendirmesini temel olarak ayarlayın veya UltraMicroscope II'den belirli ışık tabakası genişliklerinde ölçümleri kullanarak karo gölgelendirme düzeltmesi uygulamak için manuel olarak ayarlayın. Görüntü kanalı hizalaması için NMp_template true olarak ayarlayın ve kanal channel_alignment çeviri veya elastik olarak alignment_method. Ardından, görüntüleme sırasında kutucuk çakışmalarını eşleştirmek için sift_refinement true ve örtüşme değerini 0,15 olarak ayarlayın.
MATLAB'de ön işleme adımlarını çalıştırmak için örnek adını belirtin ve yapılandırmayı NM_config işlem örneği olarak ayarlayın. Ardından, yoğunluk, hizalama veya dikiş kullanarak sahne alanını belirtirken NM_process yapılandırma dikişi belirterek ön işleme adımlarından herhangi birini çalıştırın ve aşamaların her biri için çıktı dosyaları için çıktı dizinini denetleyin. Bir 3B Atlas görüntüsü ve her vokseli belirli bir yapıya atayan ilişkili bir ek açıklama görüntüsüyle başlayın.
Atlas görüntüsünün ve ek açıklama dosyasının doğru yönde doğru şekilde eşleştiğinden emin olmak için hem Atlas görüntüsünü hem de ek açıklama dosyasını hizalayın. Hizalamadan sonra, komutu yürüterek girişleri makalede açıklandığı gibi belirtmek için NuMorph'taki dosyaları işleyin. NMa_template'de, resample_images true ve resample_resolution Atlas'la eşleşecek şekilde ayarlayın.
Ardından, resample_channels kullanılarak yeniden örneklenecek kanal numarasını belirtin. Daha sonra, register_images true olarak ayarlayın, Atlas dizinindeki dosyayla eşleşmesi için atlas_file belirtin ve registration_parameters varsayılan olarak ayarlayın. Ardından save_registered_images true olarak ayarlayın.
Çekirdek algılama, hücre sayımı ve sınıflandırma için hem count_nuclei hem de classify_cells doğru olarak ayarlayın. Ardından, algılanan nesneler için minimum yoğunluk eşiği tanımlamak üzere count_method 3dunet ve min_intensity ayarlayın. Ardından, classify_method merkezcil konumlarda denetlenmeyen bir floresan yoğunluğuna dayanan eşiğe veya denetimli bir doğrusal destek vektör makinesi sınıflandırıcısını modelleyen SVM'ye ayarlayın.
MATLAB'da çözümleme adımlarını gerçekleştirmek için örnek adını belirtin ve yapılandırmayı NM_config çözümleme örneği olarak ayarlayın. Ardından, yeniden örnekleme, kaydetme, sayma veya sınıflandırma kullanarak aşamayı belirtirken NM_analyze yapılandırma aşaması belirterek analiz adımlarından herhangi birini çalıştırın ve aşamaların her biri için çıktı dosyaları için çıktı dizinini denetleyin. NMe_template'de, güncellemeyi true olarak ayarlayın ve dizinlerden birine compare_structures_by ayarlayın.
Ardından, hücre sayımını ve hücre türü sınıflandırmasını belirtirken değerlendirilecek tüm olası yapı dizinlerini ve yapılarını belirten şablon dosyasını ve yapı tablosunu ayarlayın. iDISCO + protokolü ve nöronal tabakaya özgü çekirdek belirteçleri kullanılarak doku temizleme, izokortekste üst ve alt tabaka nöronlarının açıkça tanımlanmış hücre gruplarıyla sonuçlandı. NuMorph kullanarak hücre sayımı, yoğunluk ayarı, kanal hizalaması ve dikiş içeren başarılı ön işleme adımlarına bağlıydı.
Bununla birlikte, ön işleme adımlarındaki hatalar yanlış dikişlere neden olabilir, bu da yanlış hizalama ve dikişlere yol açabilir ve bu nedenle odak içi ve odak dışı desene sahip görüntülerle sonuçlanabilir. Belirli beyin bölgelerindeki çekirdekleri saymak için, dikişli görüntülere Atlas kullanılarak açıklama eklenecek ve ek açıklamaların beyin bölgelerine bindirilmesine izin verilecektir. Çekirdeklerin sentroidleri, NuMorph'ta eğitimli bir 3D U-Net modeli ile tespit edildi ve yaklaşık 2.6 milyon beyin-iki-pozitif ve 1.6 milyon CTIP2-pozitif çekirdek ile izokortekste TO-PRO-3-pozitif olan yaklaşık 12 milyon toplam çekirdek vardı.
Bazal gangliyon ve hipokampal allokortekste sırasıyla yaklaşık 3.7 ve 2.9 milyon TO-PRO-3-pozitif toplam çekirdek tespit edildi. Bununla birlikte, bu iki beyin bölgesinde tespit edilen beyin-iki-pozitif hücreler ihmal edilebilir düzeydeydi ve bazal gangliyonlar ve hipokampal allokortekste her biri bir milyondan az CTIP2-pozitif hücrede sadece 1.5 civarında tespit edildi. İyi bir segmentasyon elde etmek için edinme sırasında görsel kalite kontrolleri yapın.
Ayrıca, aşağı akış analizinde hiçbir hatayla karşılaşılmamasını sağlamak için Conda ortamını doğru şekilde ayarlayın. Hücre sayımına ek olarak, bu işlem hattı, hücre boyutunu ve şeklini ölçen ve daha sonra genotip grupları arasında karşılaştırılabilen diğer segmentasyon araçlarıyla entegrasyona izin verir. Boru hattımızla, beyin anatomisinin hücresel çözünürlükte nasıl değiştiğini tanımlayabiliriz, bu da hastalık riski için önemli olan hücre tiplerinin ve beyin bölgelerinin tanımlanmasına yol açar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma; manyetik rezonans görüntüleme, berraklaştırma ve iDISCO+ ile ışık levhası mikroskobisi kullanılarak immünlekeleme yoluyla sağlam fare beyinlerinin görüntülenmesi için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, gelişmiş görüntü analiz araçlarıyla fare korteksindeki hücrelerin doğru şekilde sayılmasını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Görüntüleme Teknikleri
- Hücre Kantifikasyonu
Arka Plan
- Fare beyni yaklaşık 100 milyon hücre içerir.
- Yüksek çözünürlüklü görüntüler terabayt boyutlarına ulaşabilir ve bu durum gelişmiş analiz araçlarını gerektirir.
- iDISCO+ protokolü, beyin örneklerinin şeffaflaştırılması ve immün etiketlenmesi için kritik öneme sahiptir.
- Işık tabakası mikroskobisi (light-sheet microscopy), karmaşık yapıların detaylı şekilde görüntülenmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Fare beyinlerinin 3B görüntülemesini gerçekleştirmek için kullanılan yöntemleri geliştirmek.
- Hücresel verilerin ön işlemesi ve miktar tayini için hesaplamalı bir iş akışı sunmak.
- Çeşitli beyin bölgelerindeki farklı nöron popülasyonlarını ortaya çıkarma yeteneğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için UltraMicroscope II kullanılarak ışık levhası mikroskobisi uygulanmıştır.
- Biyolojik model olarak, özellikle hücre sayımı hedeflenen sağlam fare beyinleri kullanılmıştır.
- Görüntüleme verilerinin ön işleme ve analizi için NuMorph adlı bir hesaplama hattı kullanılmıştır.
- Temel prosedür adımları arasında örneklerin montajı, görüntüleme ayarlarının yapılandırılması ve veri işleme için MATLAB'ın kullanılması yer almıştır.
Temel Sonuçlar
- Çekirdekler, kapsamlı hücresel analize olanak tanıyan eğitimli bir 3D U-Net modeli kullanılarak yüksek hassasiyetle tespit edildi.
- Isokorteks ve diğer beyin bölgelerinde toplam yaklaşık 12 milyon çekirdek sayıldı.
- Önişlemedeki hatalar, doğru görüntü hizalaması ve hücre sayımının sağlanması için kritik noktalar olarak vurgulandı.
- Başarılı işleme süreci, spesifik nöron popülasyonlarının net bir şekilde görselleştirilmesini sağlayarak kortikal yapının anlaşılmasına yardımcı oldu.
Sonuçlar
- Bu protokol, beyin mimarisinin ayrıntılı çalışmalarına olanak sağlamak için görüntüleme metodolojilerini geliştirmektedir.
- iDISCO+ ve ışık-levha mikroskobisinin entegre kullanımı, doğru analizler için ön işlemenin önemini göstermektedir.
- Bulgular, nöronal mekanizmalar ve hastalık modellerine yönelik daha fazla araştırma için önemli çıkarımlar taşımaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
MRI, doku şeffaflaştırma ve ışık-tabakası mikroskobisi ile gerçekleştirilen tüm beyin tek hücre görüntüleme, benzeri görülmemiş bir ölçek ve çözünürlükte kantitatif, bölgeye özgü hücresel analizlere olanak tanır. Bu entegre iş akışı, nörobiyolojik ilaç keşfinde hedef doğrulaması ve mekanik risklerin azaltılması için kritik olan, yüksek güvenilirlikli yapısal ve hücresel haritalamayı destekler. Bu yaklaşım, sağlam beyin bölgeleri genelinde hücresel fenotiplerin kapsamlı ve tarafsız kantifikasyonunu sağlayarak, erken keşif ve translasyonel araştırmalar için öngörü değerini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Beyin yapısı üzerindeki genetik veya çevresel perturbasyonların tek hücre çözünürlüğünde kantitatif olarak incelenmesini sağlar.
- Hücre tipi dağılımlarını ve bölgeye özgü değişiklikleri haritalandırarak fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Yansız, tüm beyin hücresel kantifikasyonu yoluyla mekanistik risk azaltmayı kolaylaştırır.
- Kesitlenmiş doku analizleriyle gözden kaçan ince fenotipik farkları ortaya çıkararak portföy önceliklendirmesi için öngörü güvenini artırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Sonraki fenotipik tarama iş akışları için doğrulanmış ve açıklama eklenmiş 3D beyin modelleri hazırlar.
- Tekrarlanabilir, yüksek kapasiteli hücresel analizler için görüntüleme ve nicelleştirme protokollerini standartlaştırır.
- Genotipler veya tedavi grupları arasında karşılaştırmalı çalışmalara uygun, ölçeklenebilir ve nicel çıktılar sağlar.
- Bileşiklerin beyin hücresi popülasyonları ve mimarisi üzerindeki etkilerinin güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hücresel fenotiplemeyi, hastalıkla ilgili beyin bölgeleri ve biyobelirteçlerle uyumlu hale getirir.
- Hücresel mimarinin çalışmalar arası karşılaştırmalarını mümkün kılarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Hastalık modelleriyle ilgili yapısal ve hücresel son noktaları nicelendirerek, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını destekler.
- Translasyonel nörobilim portföyleri için öngörülü risk azaltma süreçlerini geliştirir.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu iş akışı, tüm beyin düzeyinde tek hücreli analiz için ölçeklenebilir bir platform sağlayarak erken keşif, öncü bileşik belirleme ve preklinik araştırma aşıkları arasında bir köprü kurmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Bölgeye özgü hücresel değişiklikleri nicelendirerek hipotez testlerini ve yolakların açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Assay geliştirme ve bileşik tarama işlemleri için tekrarlanabilir, kantitatif görüntüleme çıktıları sağlar.
- Analitik: Deneysel koşulların sağlam bir şekilde karşılaştırılması için yüksek içerikli ölçümler ve istatistiksel çıktılar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hücresel fenotiplerin hastalık modelleri ve biyobelirteç stratejileriyle uyumlandırılmasına olanak tanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli nörobiyolojik çalışmalara uyarlanabilir, yeniden kullanılabilir ve açık kaynaklı bir hesaplama hattı sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nörobiyolojik hedef doğrulamada öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir, yüksek kapasiteli çalışmalar için tüm beyin görüntüleme ve analizini standartlaştırır ve ölçeklendirir.
- Stratejik Değer: Kapsamlı ve tarafsız hücresel sayımlara olanak tanıyarak devam/durdur kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Nörobilim varlıklarının risk ayarlı önceliklendirmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Gelişmiş mikroskopi, doku berraklaştırma ve hesaplamalı görüntü analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- Işık sayfası mikroskopi platformlarına ve yüksek performanslı hesaplama altyapısına erişim gereklidir.
- Görüntüleme ve analiz protokollerinin ekipler arası titiz bir şekilde standartlaştırılmasını gerektirir.
- Uygun immünlekeleme stratejileri ile çeşitli fare modellerine ve beyin bölgelerine uyarlanabilir.
- Doğru nicelendirme ve açıklama için güçlü ön işleme ve kalite kontrol süreçlerine bağımlıdır.
