Sitonem analizi için embriyonik fare dokusunun fiksasyonu

Bu protokolü kullanarak, standart ışık mikroskobu ile tüm embriyo boyunca sabit fare dokusundaki sitonomları görselleştirebiliriz. Bu tekniği kullanarak, floresan etiketli proteinleri kullanan genetik olarak manipüle edilmiş fare modellerine güvenmek yerine, sitonemler boyunca hareket eden endojen sinyal proteinlerini araştırabiliriz. Bu protokolü denerken, sitomenlerin optimal korunması için doku kesitlerini nazikçe ele almak önemlidir.

Bu prosedürü gösteren, grubumda baş araştırmacı olan Miriam Dillard ve St.Jude yüksek lisans öğrencisi Christina Daly olacak. Başlamak için, periton boşluğuna bir Y kesisi yapmak için diseksiyon makası ve forseps kullanın. E 9.5 embriyosu içeren uterusu tüketin.

Embriyoları tam DMEM büyüme ortamında disseke edin. Yumurta sarısı SAC, plasenta ve çevresindeki zarları çıkarmak için forseps kullanın. Artık amniyotik doku ve kanı çıkarmak için izole edilmiş embriyoları HBSS'de durulayın.

Daha sonra,% 4'lük bir paraformaldehit çalışma konsantrasyonu için HBSS'ye paraformaldehit ekleyerek fiksatifi hazırlayın. 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna bu çözeltinin bir mililitresini ekleyin. Embriyoları bireysel kuyucuklara yerleştirin.

Embriyoları 45 dakika boyunca bir rocker üzerinde nazik ajitasyonla inkübe edin. Kuluçkadan sonra, fiksatifi çıkarın ve embriyoları PBS'de 30 dakika boyunca kalsiyum, magnezyum ve% 0.1 Triton eklenerek üç kez yıkayın. Daha sonra embriyoları, her biri bir saat boyunca iki kez nazik ajitasyonla bloke edici çözeltide inkübe edin.

İkinci inkübasyondan sonra, embriyoları taze bloke edici çözelti kullanarak durulayın. Bu arada, takviye edilmiş PBS'deki antikorları seyrelterek birincil antikor çözeltisini hazırlayın. Durulama tamamlandıktan sonra, bloke edici çözeltiyi çıkarın ve her bir oyuğa bir mililitre birincil antikor çözeltisi ekleyin.

Plakayı üç gün boyunca yumuşak bir dönüşle dört santigrat derecede inkübe edin. Birincil antikor inkübasyonunu takiben, embriyoları 20 RPM'de bir rocker üzerinde bir saat boyunca beş kez takviyeli PBS ile yıkayın. Daha sonra her bir kuyucuğa bir mililitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin.

Tabağı üç gün boyunca karanlıkta dört santigrat derecede hafifçe sallanarak inkübe edin. İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve embriyoları takviye edilmiş PBS'de 30 dakika boyunca üç kez yıkayın. PBS'de kalsiyum ve magnezyum içeren düşük erime noktası agarozunun ağırlığına göre% 4'lük bir çözelti hazırlayın.

Aynı zamanda, 55 santigrat derece boncuk banyosuna 12 kuyucuklu bir plaka yerleştirin ve her bir kuyucuğa üç mililitre agaroz ekleyin. Daha sonra, plakayı bir tezgahın üzerine yerleştirin ve embriyoları delikli bir kaşık kullanarak bireysel kuyucuklara aktarın. Embriyoyu, çözelti içinde ortalanacak şekilde nazikçe gömmek ve yönlendirmek için pipet uçlarını kullanın.

Embriyolar yönlendirildikten sonra, katılaşma için plakayı eksi 20 santigrat dereceye 10 dakika yerleştirin. Sonra bir neşter kullanarak, tüm agaroz bloğunu kuyudan çıkarın. Embriyonun etrafında dikdörtgen bir blok kesin, her iki tarafta yaklaşık 0.3 santimetre blok bırakın.

Embriyonun kaudal ucu boyunca bloğun ekstra bir uzunluğunu bırakın. Embriyoyu vibratom üzerine monte etmek için, önce numune tutucuya bir bant şeridi uygulayın. Embriyoyu bloğun üst kısmında dik bir konumda yönlendirin ve agaroz bloğunu banda süper yapıştırın, böylece bıçak önden arkaya doğru bir sekansta eksenel bölümler üretecektir.

Daha sonra, numuneyi tamamen batırmak için vibratom odasını soğuk HBSS ile doldurun ve ardından odayı buzla çevreleyin. Vibratom üzerindeki parametreleri ayarlayın ve embriyonun seri eksenel kesitlemesini gerçekleştirin. Tek tek bölümleri HBSS ile dolu ayrı bir kaba aktarmak için forseps kullanın.

Doku hasarını ve sitonomların tahrip olmasını önlemek için sadece agarozu tutmak için forseps kullanmayı unutmayın. F-aktin boyama işlemini gerçekleştirmek için HBSS'yi çıkarın ve bölümleri takviyeli PBS'de ActinRed ve DAPI çözeltisi ile 40 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bölümleri takviye edilmiş PBS'de 20 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Hidrofobik bir işaretleyici kalemle, yüklü bir mikroskop slaytının kenarlarına bir bariyer çizin ve doldurma alanına az miktarda HBSS ekleyin. Ardından, bölümleri slayda aktarmak için forseps kullanın. Forseps kullanarak fazla agarozu çıkarın.

Tüm bölümler kızağa aktarıldıktan sonra, pipetle pipetleyerek ve emici bir havlunun köşesini kullanarak fazla sıvıyı çıkarın. Ardından slayda birkaç damla montaj ortamı ekleyin. Kapak kaymasını yavaşça kızağa yerleştirerek monte edin.

Analiz için, konfokal veya herhangi bir yüksek çözünürlüklü mikroskopta genotip başına en az üç embriyo için doku kesitlerinin görüntülenmesini gerçekleştirin. Bu protokol kullanılarak hazırlanan doğru yönlendirilmiş bölümler burada gösterilmiştir. Vibratom kesiti ile karşılaştırıldığında, dokunun kriyostat kesiti hücresel uzantıları korumadı.

Notochord ve nöral tüp hücreleri arasında ve kriyostat kesitlerinde bitişik nöral tüp hücreleri arasında birkaç GFP-pozitif membran fragmanı tespit edildi. Bununla birlikte, nöral tüpü çevreleyen mezenkimal hücrelerdeki hücresel uzantıların F-aktin boyanması kriyostat kesitlerinde bozulmuştur. Vibratom kesitlemesi, tüm embriyonun ve bireysel doku kesitlerinin minimum bozulmasını sağladı.

Optimal olarak ele alınan kesitler, bitişik lokalize taban plakası nöral epitel hücreleri ile mezenkimal hücreler arasındaki ktionemlerin saptanmasına izin verdi. Katlanmış veya tokalı bölümler, notokord ile nöral tüpün ventral taban plakası arasındaki büyük bir ayrımla belirgindi. Ve epitel hücreleri arasında göç eden hücresel membran uzantılarının kaybı.

F-aktin ve DAPI boyalı kesitler, nöral tüp ve notokord çevreleyen mezenkimal hücrelerin ve ktionemlerin tutarlı bir aralığına sahipti. Bölümlerdeki küçük bozulmalar, aktin bazlı uzantıların parçalanmasına ve hücreler arasında büyük boşlukların oluşmasına neden olmuş olabilir ve bu da hassas kullanım ihtiyacının altını çizer. Embriyo kesitinden sonra, doku bölümlerinin bükülmesini veya katlanmasını en aza indirmek zorunludur.

sitonomların kırılmasını önlemek için. Bu tekniği kullanarak, morfojenler gibi sinyal moleküllerinin dokulara nasıl yayıldığını doğrudan görselleştirebiliriz. Bu bize dokuların ve organların nasıl desenlendiğine dair yeni bilgiler veriyor.