Name: Dinamik Arayüzlerin Konfokal Mikroskopi Görselleştirmesi için Mikrotensiyometre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Öğrenin, konfokal mikroskopi ile mikrotensiyometreyi birleştirerek akciğer yüzey aktif maddelerinin yapı-özellik ilişkilerini yüksek çözünürlükte incelemeyi. Bu yöntem, iltihap ürünlerinin solunum sıkıntısına etkisini gerçek zamanlı analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tüm konfokal mikroskopi görüntüleri Nikon A1RHD Multiphoton dik konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Minnesota Üniversitesi Üniversite Görüntüleme Merkezi'ndeki destek personelinin, özellikle Guillermo Marques'in rehberliğini ve yardımını kabul ediyoruz. Bu çalışma NIH Grant HL51177 tarafından desteklenmiştir. SI, Ruth L. Kirschstein NRSA Kurumsal Araştırma Eğitim Hibe F32 HL151128 tarafından desteklenmiştir.

1. Kılcal tüplerin hazırlanması
<ol><li>Kılcal damarı bir kılcal çektirmeye yerleştirin ve ucunda ~ 1 μm dış çapa (OD) sahip iki konik kılcal damar yapmak için istenen çekme programını çalıştırın. NOT: Çekmeden önce kılcal damarın OD'si, mikrotensiyometre hücresindeki kılcal tutucuya sığacak şekilde belirtilen OD olmalıdır. Kılcal damarın iç çapı (ID) değişebilir, ancak çekmeyi takiben kılcal damarın kritik yarıçapını etkileyecektir. Bir çekme programı seçilir, böylece elde edilen konik başlangıçta kılcal OD ve ID'yi hızlı bir şekilde azaltır, daha sonra istenen kılcal OD ve ID'nin yakınında bir yarıçapa ulaşır ve daha sonra çapı daha yavaş azaltır. Bu, ID'de 30-100 μm'lik kullanılabilir bir kılcal damar elde etmek için puanlanabilen daha büyük bir kılcal uzunluk yaratacaktır.</li>
	<li>30-100 μm'lik bir kimlik elde etmek ve ucu kırmak için kılcal damarın ucunu istenen noktada puanlayın. Kılcal damar artık ucunda istenen yarıçapın bir OD'sine ve ID'sine sahip olacaktır (Şekil 1A). Kılcal damarlar 2. adıma kadar saklanabilir. NOT: Kılcal damarın kesme kenarı 90° temiz bir mola olmalıdır. Kesme kenarındaki herhangi bir kusur, kabarcığın kılcal damar ve zayıf yüzey özelliği ölçümlerine kötü sabitlenmesine yol açacaktır. Konik kılcal uçlar çok hassastır. Çözeltilerden başka herhangi bir şeyle temas ederlerse (örneğin, şişe duvarları, hava nozulu) imha edilirler.</li>
</ol>2. Kılcal damarların hidrofobikleşmesi
<ol><li>Çekilmiş cam kılcal damarları, asit temizleme çözeltisini, plastik cımbızları, deiyonize (DI) suyu, hidrofobibizasyon çözeltisini (etanolde% 2 silane), vakum pompasını ve etanol çözeltisini toplayın. Ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın. DİKKAT: Asit temizleme solüsyonu akut toksiktir, cilt ve göz korozyonuna / tahrişine neden olur, oksitleyicidir. Hidrofobizasyon çözeltisi bir cilt / göz / solunum tahriş edicidir. Göz koruyucu, laboratuvar önlükleri ve eldivenler giyin ve duman davlumbazındaki solüsyonlarla çalışın.</li>
	<li>Kılcal damarı asitle temizleyin NOT: Kılcal damarın asit ile temizlenmesi, kılcal damar içindeki organik kalıntıları giderir ve cam yüzeyi, kılcal hidrofobik hale getiren silanizasyon reaksiyonu için hazırlar.<ol>
<li>Cımbızla geniş ucuna sıkıca yakın bir kılcal damar tutun.</li>
		<li>Konik ucu asit temizleme çözeltisine batırarak hortumu vakum pompasından kılcal damarın geniş ucuna takın. Bu, çözeltiyi kılcal damar içine emecektir. NOT: Kılcal hortumun ucuna, kılcal uçla daha iyi oturması için bir pipet ucu takılabilir.</li>
		<li>Asit temizleme çözeltisi kılcal damarın yaklaşık yarısını doldurduğunda durun. NOT: Kılcal ucun asit temizleme çözeltisinden çıkarılmasından sonra, kılcal damarın dışındaki çözelti genellikle kılcal ucun yakınında bir boncuk oluşturur. Fazla çözeltiyi çıkarmak için kılcal damarı çözelti şişesinin boynuna hafifçe dokunun.</li>
		<li>Asit temizleme çözeltisinin kılcal damarlarda en az 30 dakika kalmasına izin verin ve sıvının tıkaçının kılcal damarın konik ucunda kalmasını sağlayın.</li>
		<li>Kılcal damarı cımbızla sıkıca tutarak ve sıvıyı kılcal damarın büyük ucundan çıkarmak için vakum hortumunu kullanarak asit temizleme solüsyonunu kılcal damardan çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kılcal damarı durulayın<ol>
<li>Kılcal damarın konik ucunu DI suyuna batırın, asit temizleme çözeltisine batırılmış herhangi bir dış yüzeyi kaplayacak kadar derine batırılmasını sağlayın. Uç suya batırılmışken, DI suyunu kılcal damardan çekmek için vakum hortumunu kullanın. Kılcal damarı sudan çıkarın ve kalan suyu vakum hortumuyla çıkarın.</li>
		<li>Yukarıdaki adımı en az 4 kat tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>DI suyu yerine etanol koyarak adım 2.3'ü tekrar uygulayın.</li>
	<li>Etanol kılcal damarın içinden tamamen buharlaşana kadar sürekli olarak emme uygulayın. Kılcal damar, etanol buharlaşmaya başladığında dokunmak için bulanık ve serin hale gelecektir, ancak 30 ila 45 s'den sonra temizlenecektir.</li>
	<li>Kılcal damarı hidrofobikleştirme çözeltisi ile kaplayın<ol>
<li>Kılcal damarın geniş ucunu etanol çözeltisindeki ~% 2 silana kısaca batırın. Kılcal hareket, kaplama çözeltisinin kılcal damar içinde yükselmesine neden olur. Kılcal damar içinde ~ 1 cm boyutunda bir tıkaç yükseldikten sonra kılcal damarı çözeltiden çıkarın.</li>
		<li>Kılcal damarı, konik uç aşağı bakacak şekilde yönlendirin, böylece kaplama çözeltisinin yerçekimi ile konik uca doğru düşmesine izin verin.</li>
		<li>Kaplama çözeltisinin kılcal damarda en az 3 dakika kalmasına izin verin. NOT: Konik ucun iç kısmıyla temas eden kaplama çözeltisinin tapasında hava kabarcıkları olmamalıdır. Bir hava kabarcığı varsa, kılcal iç kısım muhtemelen adım 2.5'te yeterince kurutulmamıştır. Bunu gidermek için, 2.4-2.6 arasındaki adımları gerektiği gibi yineleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kılcal damarları etanol 1x ile adım 2.3 ile aynı şekilde durulayın.</li>
	<li>Hidrofobik kaplamayı kılcal damar üzerine yerleştirin<ol>
<li>Temiz ve kuru parıltılı şişeleri 120 °C'ye ayarlanmış bir vakumlu fırına yerleştirin. Kaplanmış kılcal damarları, şişenin tabanına dayanan geniş uçlu şişelere (ideal olarak şişe başına bir kılcal damar) yerleştirin. Hidrofobik silan tabakasının kılcal damarlara kalıcı olarak bağlanmasını sağlamak için kılcal damarların fırında en az 6 saat (gece boyunca tercih edilen) kalmasına izin verin. Kılcal damarlar 4. adıma kadar saklanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Numune hazırlama ve depolama
<ol><li>Kirlenmeyi önlemek için yüzey aktif madde ve florofor çözeltilerini temiz asitle yıkanmış şişelerde karıştırın ve saklayın. NOT: Ticari olarak temin edilebilen lipitler en yüksek saflıkta olmalı ve kullanım arasında - 20 ° C'de depolanmalıdır. Eski veya kontamine lipitler genellikle sonuçların çoğaltılmasının zor olmasına neden olur.</li>
</ol>4. Mikrotensiyometrenin kurulması
<ol><li>BGBM hücresini Şekil 2'de açıklandığı gibi birleştirin.<ol>
<li>Kılcal damarın büyük tarafını, hücrenin alt tarafına doğru itinceye kadar CPM hücresinin üstüne yerleştirin.</li>
		<li>Kılcal damarı sabitlemek için PEEK fişini yavaşça sıkın ve ardından tüpü mikroakışkan pompadan kılcal damarın büyük tarafına takın. Konik kılcal uca dokunmamaya dikkat edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gerektiğinde, rezervuar değişimi ve/veya sıcaklık kontrol hortumlarını CPM hücresi üzerindeki ilgili giriş ve çıkışlara takın (Şekil 2); aksi takdirde, kullanılmayan giriş ve çıkışları takın.</li>
	<li>CPM hücresini konfokal mikroskop aşamasına takın, kabaca CFM hedefi, CPM kamera ve CPM ışık kaynağı ile hizalayın (Şekil 3).</li>
	<li>Pompanın önerilen çalışma basıncında (burada kullanılan mikroakışkan pompa için 150 mbar) mikroakışkan pompaya gaz akışını açın ve kılcal damara akışın açık olduğundan emin olun.</li>
	<li>CPM sanal arabirimini (Ek Kodlama Dosyası 1: Mikrotensiyometre Sanal Interface.vi) kılcal basınç salınım frekansı ve genliği sıfıra ayarlanmış olarak Basınç Kontrolü modunda çalıştırmaya başlayın (Şekil 4-7). Şekil 4'te sanal arabirimin ekran görüntüsü gösterilmektedir. DI suyu ve ~35 μm'lik kılcal yarıçap için, ~20 mbar'lık bir basınç, kılcal damara su girmemesini sağlar.</li>
	<li>CPM hücresini pipet kullanarak suyla doldurun.</li>
	<li>Mikrotensiyometre kamerayı kullanarak kılcal uca odaklanın.</li>
	<li>CFM ile kılcal uca odaklanın. Kılcal damarı bulmakta zorluk çekiyorsanız, CFM hedefini bulmak için CPM kamerayı kullanın. Bu, CFM hedefi ile kabarcık arasındaki mesafeyi yaklaşık olarak belirlemeye yardımcı olacak ve doğru çalışma mesafesine ulaşacaktır.</li>
	<li>Anulus (yeşil sektör projeksiyonu) kabarcık üzerinde ortalandıktan sonra, odağı kabarcık kenarının net bir şekilde görülebilmesi için manuel olarak ayarlayın (Şekil 4-3). NOT: Annulusun konumu, başlangıç ve bitiş açısı ile iç ve dış yarıçapları, görünüm penceresinin altındaki menüden ayarlanabilir.</li>
	<li>Balonu Sıfırla'ya tıklayın ve yeni bir kabarcığın oluştuğundan emin olun (biri eski kabarcık patlamasını duyabilecek ve yeni kabarcık kontrol paneli görüntüleme penceresinden gözlemlenebilecektir; Şekil 4-3). Kabarcık açılmazsa, görüntüleme penceresinin altındaki Kabarcık Sıfırlama sekmesinde Sıfırlama Basıncını veya Sıfırlama Gecikme Süresi'ni artırın . Yüzey geriliminin yaklaşık 73 mN/m (tuzlu su veya su/hava kabarcıkları için) olup olmadığını kontrol edin (Şekil 4-9).</li>
	<li>Suyu doğrudan hücreye şırınga yoluyla çıkarın (Şekil 3-13), boşaltın ve tekrar takın. Örnek, denemeyi çalıştırmak için yüklenmeye hazırdır.</li>
</ol>5. Adsorpsiyon çalışması
<ol><li>CPM yazılımını Basınç Kontrolü modunda tutan otoklavlanmış bir pipet kullanarak hücreyi istediğiniz numuneyle doldurun. Yeni bir kabarcık arayüzü oluşturulduğunda ilk yüzey geriliminin yaklaşık 73 mN/m olduğundan emin olun.</li>
	<li>Yeni oluşturulan kabarcığın yarıçapını belirleyin ve bu değeri merkez çizgisi alan kontrolüne girin (Şekil 4-7) ve Alan Kontrolü sekmesine tıklayarak kontrol türünü alan kontrolü olarak değiştirin (Şekil 4-8). NOT: Sabit basınç kontrolü de kullanılabilir, ancak bu, arayüzün yüzey gerilimi değiştikçe kabarcık yarıçapının sürekli değişmesine neden olur. Bu değişen alan, yüzey aktif madde adsorpsiyon oranlarının analizini zorlaştırabilir ve çalışma sırasında kabarcığın patlamasına neden olabilir.</li>
	<li>Konfokal videoyu kaydetmeye başlayın.</li>
	<li>Balonu Sıfırla'ya tıklayın (Şekil 4-5) ve hemen Veri Topla'ya tıklayın (Şekil 4-6). Düğmedeki sinyal ışığı yeşile döner.</li>
	<li>Veri kayıt hızını, Şekil 4-6'da gösterilen çubuğu kaydırarak numunenin konsantrasyonuna göre ayarlayın. Daha yavaş adsorpsiyonlar için daha yavaş bir kayıt hızı kullanın. Bu, daha yüksek bir kayıt hızı erken dönemde istenirse bir çalıştırmanın ortasında ayarlanabilir, ancak dosya boyutunu küçültmek için uzun çalışmalar için daha yavaş bir hız tercih edilir.</li>
	<li>Deneyin bitiminden sonra (son bir yüzey gerilimi platosuna ulaşıldığında), doğru dosya yolunu seçerek (Şekil 4-1) ve Kaydet düğmesine tıklayarak (Şekil 4-2) dosyayı kaydedin.</li>
	<li>Kaydı CFM'de de durdurun ve kaydedin.</li>
</ol>6. Salınım/gevşeme çalışması
<ol><li>CPM yazılımını Basınç Kontrolü modunda tutan otoklavlanmış bir pipet kullanarak hücreyi numuneyle doldurun. Yeni bir kabarcık arayüzü oluşturulduğunda yüzey geriliminin yaklaşık 73 mN/m olduğundan emin olun.</li>
	<li>Örnek arayüze tamamen adsorbe edilene kadar bekleyin. Bu, yeni bir kabarcık arayüzü ile baştan başlamak yerine doğrudan bir adsorpsiyon çalışmasından sonra gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Uygun sekmeyi seçerek (Şekil 4-8) ve istenen taban çizgisi değerini, salınım yüzdesini ve salınım sıklığını girerek (Şekil 4-7) salınımın bir basınç salınımı mı, alan salınımı mı yoksa eğrilik salınımı mı olacağına karar verin. NOT: Testere dişi, kare ve üçgen dalga alanı salınımlarına Diğer Alan Salınımı sekmesindeki açılır menüden de erişilebilir.</li>
	<li>Konfokal videonun kaydını başlatın ve CPM yazılımında Veri Topla'ya (Şekil 4-6) tıklayın.</li>
	<li>Salınımı başlatın. En iyi sonuçlar için en az yedi döngü kaydettiğinizden emin olun. Her salınım döngüsü için yeterli sayıda veri noktası vermek üzere bir veri toplama hızı seçin (Şekil 4-6).</li>
	<li>Diğer salınım genlikleri veya frekansları isteniyorsa, deney sırasında değerleri değiştirin.</li>
	<li>Sonuçları adım 5.6 ve 5.7'deki gibi kaydedin.</li>
</ol>7. Solvent değişim çalışması
<ol><li>CPM yazılımını basınç kontrol modunda tutan otoklavlanmış bir pipet kullanarak hücreyi numuneyle doldurun. Yeni bir kabarcık arayüzü oluşturulduğunda yüzey geriliminin yaklaşık 73 mN/m olduğundan emin olun. NOT: Solvent değişim çalışmasından önce adsorpsiyon ve/veya salınım çalışmaları yapılabilir.</li>
	<li>Giriş tüpünü istenen değişim çözeltisinin şişesiyle (Şekil 3-11) peristaltik pompaya bağlayın (Şekil 3-10).</li>
	<li>Videonun kaydını konfokal yazılımda başlatın ve CPM yazılımında Veri Topla'ya (Şekil 4-6) tıklayın.</li>
	<li>Peristaltik pompa hızını ayarlayın. Bu, sıvı değişim hızını kontrol edecektir ve deneyin gerekliliklerine, yani çözücünün ne kadar hızlı değiştirilmesi gerektiğine göre seçilmelidir.</li>
	<li>Birden fazla sıvının değiştirilmesi gerekiyorsa, peristaltik pompayı durdurun ve girişi başka bir değişim çözümüne bağlayın.</li>
	<li>Değişim bittikten sonra (~20 dakika), sonuçları adım 5.6 ve 5.7'deki gibi kaydedin.</li>
</ol>8. Çözünmeyen yüzey aktif madde adsorpsiyonu
NOT: Adsorbe edilecek yüzey aktif madde rezervuar sıvısında çözünür değilse, bu yöntem hücrenin hava/su arayüzünden kabarcık yüzeyine bir monolayer aktarmak için kullanılabilir. Birçok çift katmanlı oluşturan lipit, tuzlu su çözeltisinde neredeyse çözünmez ve rezervuar çözeltisinde asılı kaldığında kendiliğinden kabarcığa emilmez.
<ol><li>CPM yazılımını Basınç Kontrolü modunda tutan otoklavlanmış bir pipet kullanarak hücreyi numuneyle doldurun. Yeni bir kabarcık arayüzü oluşturulduğunda yüzey geriliminin yaklaşık 73 mN/m olduğundan emin olun.</li>
	<li>Uçucu bir organik çözelti içindeki bir çözeltiden hücrenin hava-su arayüzünde tek katmanlı çözünmez bir yüzey aktif madde biriktirin. Bir şırınga kullanarak, arayüze küçük damlacıklar bırakın ve çözücünün lipiti ince bir film olarak geride bırakarak buharlaşmasına izin verin. DİKKAT: Kloroform, fosfatidilkolinler ve yağ asitleri gibi fosfolipitler için bir çözücü olarak kullanılır. Serpme çözeltileri genellikle çözücünün mL'si başına 0.01-0.02 mg lipittir. Kloroform akut toksiktir, cilt ve göz tahrişine neden olabilir ve kanserojendir. Uygun göz koruması, laboratuvar önlüğü ve eldivenler giyin ve çözeltiyi bir duman başlığında yapın.</li>
	<li>Kabarcığın merkez çizgisi basınç kontrolü (Şekil 4-7) ile yüzey alanını neredeyse düz olana kadar azaltın. Bu, yüzey aktif madde adsorbe edildikten sonra kabarcığın patlamasını önler.</li>
	<li>Hava/su arayüzü kılcal damarın ucundan geçene kadar rezervuar sıvısını doğrudan hücreye şırınga yoluyla hücreden çıkarın. Bir şırınga pompası kullanılabilirken, bu adım şırıngayı manuel olarak kullanarak elde edilebilir.</li>
	<li>Rezervuar sıvı yüksekliğini başlangıç seviyesine yükseltin. NOT: Uç yeniden suya batırıldıktan sonra, şimdi arayüzde adsorbe edilen yüzey aktif madde nedeniyle kabarcık daha büyük olacaktır. Tek katman artık salınım veya çözücü değişim deneyleri için hazır olacaktır.</li>
</ol>9. Temizle
<ol><li>CFM'yi kapatın.</li>
	<li>Basınç Kontrolü moduna geçin.</li>
	<li>Pipet kullanarak numuneyi hücreden çıkarın. Hücreyi DI suyuyla yükleyin ve kabarcıkların kılcal damardan sürekli kaçmasına ve kılcal ucu temizlemesine neden olmak için basıncı ~ 50 mbar'a yükseltin. Bu işlemi 2 kat tekrarlayın.</li>
	<li>Sol üst köşedeki kırmızı düğmeye tıklayarak emniyet valfini kapatın ve CPM'yi kapatın, açık ve mavi basınç kontrol panelini kapatın ve basınç kaynağını kapatın.</li>
	<li>Hücreyi konfokal mikroskop aşamasından çıkarın. Hücreyi etanol ve DI suyu ile durulayın. Kılcal tüpü CPM hücresinden çıkarın.</li>
</ol>10. Hücrenin temizlenmesi
<ol><li>Hücreyi sökün. DI su altında durulamaya devam ederken iç duvarı bir diş fırçasıyla fırçalayın. Parçaları etanol içine batırın ve ~ 30 dakika boyunca sonikleştirin.</li>
	<li>Tüm parçaları birkaç kez DI suyuyla durulayın. Parçaları azot gazı ile üfleyerek veya vakumlu fırında kurutarak kurutun.</li>
</ol>11. Salınım analizi
<ol><li>CPM sanal arabiriminden kaydedilen istediğiniz dosyayı seçerek Dilatational_Rheology_Analysis.m kodunu (Ek Kodlama Dosyası 2) çalıştırın. Örnek veriler ek dosyalara dahil edilir.</li>
	<li>Basınç ve zaman grafiği Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi görünecektir. Salınımın başladığı noktaya sol tıklayın ve salınımın bittiği yere tekrar sol tıklayın. Veriler birden çok salınım içeriyorsa, tüm salınımlar için bu işlemi yineleyin.<ol>
<li>Tüm başlangıç ve bitiş noktaları sol tıklatıldığında, fareyi herhangi bir yere sağ tıklatın. Örneğin, Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi, 1, 2, 3 ve 4 numaralı noktalara sol tıklama ve ardından sağ tıklama yapılabilir. NOT: Kod, dilatasyon modülünü ve faz açısını hesaplar ve sonuçlar orijinal dosya konumundaki yeni bir .csv dosyasına yazılır. Örnek verilerin sonuçları, Ek Kodlama Dosyası 2'de verilen kod sonuçlarında görülebilir. MATLAB ayrıca Ek Şekil 2'de gösterildiği gibi verilerin birkaç grafik gösterimini de oluşturacaktır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Kombine CPM / CFM, ara yüz dinamiklerini, dengeyi ve morfolojiyi incelemek için güçlü bir araçtır. Bu protokol, CPM/CFM ile veri elde etmek için gerekli adımları açıklar.
Şekil 2 , belirtilen kılcal damar, çözücü ve ısı değişimi için kanallara sahip hücre tasarımını göstermektedir. Solvent değişimi için giriş hücrenin altında olmalı, çıkış ise en üstte olmalı ve değişim sırasında hücrenin taşmamasına izin vermelidir. Uygulamada, giriş ve çıkış akış hızları aynı pe...

Yüzey aktif madde filmlerinin kapladığı hava-su arayüzleri günlük yaşamda her yerde bulunur. Yüzey aktif madde-su enjeksiyonları, tükenmiş alanlardan petrol geri kazanımını arttırmak için kullanılır ve kaya gazı ve petrol için hidrolik kırılma çözümleri olarak kullanılır. Gaz-sıvı köpükler ve sıvı-sıvı emülsiyonlar, yağlayıcılar ve temizlik maddeleri olarak birçok endüstriyel ve bilimsel proseste ortaktır ve gıdalarda yaygındır. Arayüzlerdeki yüzey aktif maddeler ve proteinler, paketleme, depolama ve uygulama sırasında antikor konformasyonlarını stabilize eder 1,2,3,4,5, gözdeki gözyaşı filmi stabilitesi 6,7,8 ve pulmoner mekanik9,10,11,12,13,14, 15.
Arayüzlere adsorbe olan yüzey aktif ajanların veya yüzey aktif maddelerin ve özelliklerinin incelenmesi, birçok farklı deneysel teknikle uzun bir geçmişe sahiptir 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Son zamanlarda ortaya çıkan bir gelişme, diğer yaygın yöntemlerden önemli ölçüde daha az malzeme kullanırken, çok daha küçük uzunluk ölçeklerinde, yüksek kavisli arayüzlerde ara yüzey özelliklerinin incelenmesine izin veren kılcal basınç mikrotensiyometresidir (CPM) 9,23,24,25. Konfokal floresan mikroskobu (CFM), CPM 22'deki hava-su arayüzlerinde veya Langmuir oluklarında 20,26,27,28,29'daki lipitlerin ve proteinlerin morfolojisini incelemek için kullanılabilir. Burada bir CPM ve CFM, biyolojik ve teknolojik arayüzler için yapı-işlev ilişkileri geliştirmek üzere morfolojik fenomenleri dinamik ve denge ara yüzey özelliklerine bağlamak için birleştirilmiştir.
CPM-CFM'nin erişebildiği ara yüzey aktif madde sistemlerinde çok sayıda önemli parametre vardır. CPM'de, 30-200 μm çapında bir hava kabarcığı bir cam kılcal tüpün ucuna sabitlenir. CPM'nin önceki versiyonlarında, kabarcığın içi ve dışı arasındaki kılcal basınç farkı bir su sütunu ve salınımlı şırınga pompası 9,30 ile kontrol edildi; burada açıklanan yeni versiyon, bunları daha yüksek hassasiyetli, bilgisayar kontrollü bir mikroakışkan pompa ile değiştiriyor. Yüzey gerilimi (γ), ΔP = 2γ / R Laplace denklemi aracılığıyla, pompa tarafından ayarlanan arayüz boyunca basınç düşüşünden, ΔP ve kabarcığın eğrilik yarıçapının optik analizinden, R'den belirlenir. Arayüzün dinamik yüzey gerilimi, çözünür bir yüzey aktif madde içeren dökme bir sıvı ile temas halinde yeni bir kabarcığın oluşturulmasını takiben 10 ms zaman çözünürlüğü ile belirlenebilir. Yüzey aktif madde adsorpsiyon dinamikleri, difüzyon, yüzey kapsamı ve kütle konsantrasyonu ile denge yüzey gerilimi arasındaki ilişki de dahil olmak üzere yüzey aktif maddenin temel özelliklerini belirlemek için klasik Ward-Tordai denklemi 10,31 ile tanımlanabilir. Bir denge yüzey gerilimi elde edildikten sonra, ara yüzey alanı, kabarcık yüzey alanındaki küçük değişikliklerin neden olduğu yüzey gerilimindeki değişiklikleri kaydederek, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq01.jpg" style="margin: auto;">dilatasyonel modülü ölçmek için salınımlı olabilir, A32. Dolaşık polimerler veya proteinler gibi kendi iç yapılarını geliştiren daha karmaşık arayüzler için, yüzey gerilimi, daha genel bir yüzey gerilimi 4,33, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq02.jpg" style="margin: auto;">ile değiştirilir.
Solunum sırasındaki akciğer stabilitesi, alveolar hava-sıvı arayüzünde hem düşük yüzey geriliminin hem de yüksek dilatasyonel modülün korunmasına doğrudan bağlı olabilir 9,10. Tüm iç akciğer yüzeyleri, doku hidrasyonunu korumak için sürekli, mikron kalınlığında bir epitel astar sıvısı filmi ile kaplanmıştır34. Bu epitel astar sıvısı öncelikle sudur, tuzlar ve diğer çeşitli proteinler, enzimler, şekerler ve akciğer yüzey aktif maddesi içerir. Herhangi bir kavisli sıvı-buhar arayüzünde olduğu gibi, alveolusun (veya kabarcığın) iç kısmında daha yüksek olan basınçla kılcal bir basınç indüklenir. Bununla birlikte, yüzey gerilimi akciğerlerin her yerinde sabit olsaydı, Laplace denklemi, ΔP = 2γ / R, daha küçük alveollerin daha büyük alveollere göre daha yüksek bir iç basınca sahip olacağını ve daha küçük alveollerin gaz içeriğini daha büyük, daha düşük basınçlı alveollere akmaya zorladığını gösterir. Bu, "Laplace Kararsızlığı" olarak bilinir9,35. Net sonuç, en küçük alveollerin çökeceği ve sıvı ile doldurulacağı ve akciğerin bir kısmının çökmesine neden olacak şekilde yeniden şişirilmesi zorlaşacak ve diğer kısımların aşırı şişeceğidir, her ikisi de akut solunum sıkıntısı sendromunun (ARDS) tipik semptomlarıdır. Bununla birlikte, düzgün çalışan bir akciğerde, alveolus ara yüz bölgesindeki hava-epitelyal sıvı arayüzü solunum sırasında genişledikçe ve büzüldükçe yüzey gerilimi dinamik olarak değişir. Eğer <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq03.jpg" style="margin: auto;">, veya <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq04.jpg" style="margin: auto;">, Laplace basıncı azalan yarıçapla azalır ve Laplace dengesizliğini ortadan kaldırmak için artan yarıçapla artar, böylece akciğer9'u stabilize eder. Bu nedenle, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq05.jpg" style="margin: auto;">ve frekansa, tek katmanlı morfolojiye ve bileşime ve alveoler sıvı kompozisyonuna nasıl bağlı olduğu akciğer stabilitesi için gerekli olabilir. CPM-CFM ayrıca ara yüzey eğriliğinin yüzey aktif madde adsorpsiyonu25, tek katmanlı morfoloji 22 ve dilatasyonel modül9 üzerindeki etkilerinin ilk gösterimlerini sağlamıştır. CPM'deki rezervuarın küçük hacmi (~ 1 mL), sıvı fazın hızlı bir şekilde tanıtılmasına, çıkarılmasına veya değiştirilmesine izin verir ve gerekli miktarda pahalı protein veya yüzey aktif maddeyi en aza indirir10.
CPM-CFM görüntüsündeki kontrast, floresan olarak etiketlenmiş lipitlerin veya proteinlerin küçük fraksiyonlarınınarayüz 16,27'de dağılmasından kaynaklanmaktadır. İki boyutlu yüzey aktif madde monokatmanları genellikle yüzey gerilimi veya yüzey basıncının bir fonksiyonu olarak yanal faz ayrımı sergiler, π 0 γ temiz bir sıvı-sıvı arayüzünün yüzey gerilimi ile yüzey faktan kaplı bir arayüz arasındaki farktır γ. π, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq06.jpg" style="margin: auto;"> saf sıvı yüzey gerilimini düşürmek için hareket eden arayüzdeki yüzey aktif madde moleküllerinin etkileşimlerinin neden olduğu 2-D "basınç" olarak düşünülebilir. Düşük yüzey basınçlarında, lipit monokatmanları sıvı benzeri düzensiz bir durumdadır; bu, sıvı genişlemiş (LE) faz olarak bilinir. Yüzey basıncı arttıkça ve lipit molekülü başına düşen alan azaldıkça, lipitler birbirleriyle birlikte yönlendirilir ve uzun menzilli sıralı sıvı yoğunlaştırılmış (LC) faz 16,20,27'ye birinci dereceden bir faz geçişine geçebilir. LE ve LC fazları çeşitli yüzey basınçlarında bir arada bulunabilir ve floresan etiketli lipitler LC fazından dışlanıp LE fazına ayrıldığı için görselleştirilebilir. Böylece, CFM16 ile görüntülendiğinde LE fazı parlak ve LC fazı karanlıktır.
Bu makalenin amacı, kombine konfokal mikroskop mikrotensiyometresini oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli adımları tanımlamaktır. Bu, okuyucunun adsorpsiyon çalışmaları yapmasına, yüzey gerilimini, reolojik davranışı ölçmesine ve mikron ölçekli bir hava / su veya yağ / su arayüzünde aynı anda ara yüzey morfolojisini incelemesine olanak tanır. Bu, gerekli kılcal damarların nasıl çekileceği, kesileceği ve hidrofobikleştirileceği, basınç, eğrilik ve yüzey alanı kontrol modlarının kullanımı için talimatlar ve çözünmeyen yüzey aktif maddenin mikrotensiyometre kavisli arayüze ara yüz transferi hakkında bir tartışmayı içerir.

<table><tbody><tr><td>1.5 OD Tygon boru</td><td>Fischer Bilimsel</td><td></td><td>Boru</td></tr><tr><td>A1RHD Multifoton dik konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Konfokal Mikroskop</td></tr><tr><td>Asit Temizleme Çözeltisi</td><td></td><td></td><td>Hacimce %50 su ile seyreltilmiş sülfürik asit ve Alnochromix,</td></tr><tr><td>Alnochromix</td><td>Alconox</td><td>2510'u</td> <td>seyreltmek için berraklaşana kadar bekleyinPaket talimatına sülfürik asit ile karıştırılır ve asit temizleme çözeltisi yapmak için seyreltilir</td></tr><tr><td>Seramik cam kesici</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650471</td><td>HPLC Plus</td></tr><tr><td>Curosurf</td><td>Chiesi</td><td></td><td>&nbsp; Akciğer Yüzey Aktif</td></tr><tr><td>Madde Di Su</td><td></td><td></td><td>18.5 M & Omega; - cm</td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td> hidrofobikleştirme için kullanılan herhangi bir <td></td><td>200 kanıt, temizlik için kullanılan denatüre</td></tr><tr><td>Fiber-Lite Model 190 fiber optik aydınlatıcı</td><td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td><td>281900100</td><td>Işık kaynağı; diğer ışık kaynakları da çalışmalıdır</td></tr><tr><td>Flow EZ F69 mbar, Link Modülü ile</td><td>Fluigent</td><td>LU-FEZ-0069</td><td>Mikroakışkan Pompa</td></tr><tr><td>Fluigent SDK VI'lar</td><td>CPM sanal Arayüzü için</td><td>Fluigent</td><td></td> Gereklidir</tr><tr><td>Floroelastomer contalar</td><td></td><td></td><td>1 mm kalınlığında Viton levhadan işlenmiştir, Şekil 3'e bakın</td></tr><tr><td>Gaz filtresi</td><td>Norgren</td><td>F07-100-A3TG</td><td>Mikroakışkan pompa ile basınç regülatörü arasına koyun</td></tr><tr><td>Gaz regülatörü</td><td>Norgren</td><td>10R0400R</td><td>Gaz filtresi aralığına bağlı 2-120 psi</td></tr> Cam <tr><td>Kapiller</td><td>Sutter Aletleri</td><td>B150-86-10</td><td>Borosilikat cam OD 1,5 mm İç Çap 0,86 mm</td></tr><tr><td>Cam Kaydırma</td><td>herhangi bir</td><td></td><td>75 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>Cam Şırınga</td><td>Hamilton</td><td>84878</td><td>25 &mu; L cam şırınga</td></tr><tr><td>Hidrofobik Ajan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>667420</td><td>1H, 1H, 2H, 2H-Perfloro-oktiltrietoksisilan% 98, diğer hidrofobik trietoksisilan ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Çözünmeyen yüzey aktif madde</td><td>Avanti</td><td>850355C-200mg</td><td>16: 0 DPPC kloroform</td></tr><tr><td>LabVIEW Yazılımı</td><td>National Instruments</td><td></td><td>2017</td></tr><tr><td>Uzun Geçiren Filtre</td><td>ThorLabs</td><td>FEL0650</td><td>650 nm Uzun geçiren filtre, dalga boyu uyarma lazer frekansını kaldırmalıdır</td></tr><tr><td>Lyso-PC</td><td>Avanti</td><td>855675P</td><td>16:0 Lyso PC 1-palmitoil-2-hidroksi-sn-glisero-3-fosfokolin</td></tr><tr><td>Masterflex L/S değişken hızlı analog konsol pompa sistemi w/&nbsp; Easy-Load II pompa kafası</td><td>Masterflex</td><td>HV-77916-20</td><td>Peristaltik Pompa</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>R2019</td></tr><tr><td>Mikropipet Çektirme P-1000</td><td>Sutter Aletleri</td><td></td><td>Kılcal Çektirme</td></tr><tr><td>Mikrotansiyometre Hücresi ve Tutucu</td><td></td><td></td><td>Hücresi PEEK'ten işlenmiş, tutucu alüminyumdan işlenmiş, Bkz. Şekil 3 ve 4</td></tr><tr><td>Mikrotansiyometre Objektifi</td><td>Nikon</td><td></td><td>Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 &infin;/0 WD 2.0 mm</td></tr><tr><td>NI Vizyon Geliştirme Modülü</td><td>CPM sanal Arayüzü için Gerekli</td><td>Ulusal Aletler</td><td></td></tr><tr><td>PEEK parmak sıkı bağlantı parçaları</td><td>IDEX</td><td>F-120x</td><td>10-32 Konik</td></tr><tr><td>Bağlantı Noktaları PEEK fişi</td><td>IDEX</td><td>P-551</td><td>10-31 Konik Bağlantı Noktaları</td></tr><tr><td>pippette uçları</td><td>Eppendorf</td><td>22492225</td><td>100 &mu; L - 1000 &mu; L, Otoklavlı</td></tr><tr><td>Plastik Forseps</td><td>Thermo Scientific</td><td>6320-0010</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Şırınga</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-459</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Sıhhi tesisat parçaları</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td>3 vanalar ve boruları bağlamak için diğer sıhhi tesisat parçaları.</td></tr><tr><td>Research Plus 1 kanallı 100 &mu; L&ndash; 1000 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td>Mikro pipetleyici</td></tr><tr><td>Sülfürik Asit</td><td>herhangi bir</td><td></td><td>Asit temizleme çözeltisi için kullanılır</td></tr><tr><td>T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm</td><td>Nikon</td><td></td><td>Konfokal Mikroskop Objektif</td></tr><tr><td>Texas Kırmızı DHPE trietilamon tuzu</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>1395MP</td><td>Florofor</td></tr><tr><td>Vakum Pompası</td><td>Gast</td><td>DOA-P704-AA</td><td></td></tr></tbody></table>

dinamik arayüzlerin konfokal mikroskopi görselleştirmesi için mikrotensiyometre

Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces

Yüzey-aktif moleküllerin sıvı-sıvı arayüzlerine adsorpsiyonu doğada her yerde bulunur. Bu arayüzlerin karakterize edilmesi, yüzey aktif madde adsorpsiyon oranlarının ölçülmesini, denge yüzey gerilimlerinin toplu yüzey aktif madde konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak değerlendirilmesini ve yüzey geriliminin dengeyi takiben ara yüzey alanındaki değişikliklerle nasıl değiştiğini ilişkilendirmeyi gerektirir. Yüksek hızlı konfokal mikroskopla floresan görüntüleme kullanılarak arayüzün eşzamanlı olarak görselleştirilmesi, yapı-fonksiyon ilişkilerinin doğrudan değerlendirilmesini sağlar. Kılcal basınç mikrotensiyometresinde (CPM), kılcal damarın ucunda 1 mL hacimli bir sıvı haznesinde yarım küre şeklinde bir hava kabarcığı sabitlenir. Kabarcık arayüzü boyunca kılcal basınç, Laplace denklemine dayalı model tabanlı basınç, kabarcık eğriliği veya kabarcık alanı kontrolüne izin veren ticari bir mikroakışkan akış kontrolörü aracılığıyla kontrol edilir. Langmuir oluğu ve kolye damlası gibi önceki tekniklerle karşılaştırıldığında, ölçüm ve kontrol hassasiyeti ve tepki süresi büyük ölçüde geliştirilmiştir; kılcal basınç değişimleri milisaniyeler içinde uygulanabilir ve kontrol edilebilir. Kabarcık arayüzünün dinamik tepkisi, kabarcık genişledikçe ve büzüldükçe ikinci bir optik lens aracılığıyla görselleştirilir. Kabarcık konturu, kabarcık eğriliği yarıçapını, R'yi ve sonuçları geçersiz kılacak dairesellikten sapmaları belirlemek için dairesel bir profile uygundur. Laplace denklemi, arayüzün dinamik yüzey gerilimini belirlemek için kullanılır. Dengeyi takiben, dilatasyon modülünü belirlemek için kabarcık yarıçapını (0.001-100 döngü / dak frekansları) salınımına sokmak için bilgisayar kontrollü mikroakışkan pompa tarafından küçük basınç salınımları uygulanabilir Sistemin genel boyutları, mikrotensiyometrenin yüksek hızlı bir konfokal mikroskobun merceğinin altına sığacak kadar küçüktür.

Ölçüm hatasının önemli bir kaynağı, kesme işleminden (Şekil 5A,B) veya kaplama işleminden (Şekil 5D) kusurları olan kılcal damarlardan kaynaklanmaktadır. Her iki kusur türü de optik görüntü analiz sistemi tarafından kabarcık şeklinin ve boyutunun belirlenmesinde hatalara yol açarak yanlış yüzey gerilimi değerlerine yol açar. Kılcal damarı CPM'ye yerleştirmeden önce optik mikroskop altında çekildikten ve kaplandıktan sonra her yeni kılcal damarı ...

Bu yazıda, ara yüz morfolojisini görselleştirirken ara yüz gerilimi ve yüzey dilatasyonel reolojisinin eşzamanlı ölçümlerini yapmak için bir mikrotensiyometre/konfokal mikroskobun tasarımı ve çalışması anlatılmaktadır. Bu, teknoloji ve fizyolojide önemli olan arayüzlerin yapı-özellik ilişkilerinin gerçek zamanlı olarak inşasını sağlar.

Dinamik Arayüzlerin Konfokal Mikroskopi Görselleştirmesi için Mikrotensiyometre

Adsorption of surface-active molecules to fluid-fluid interfaces is ubiquitous in nature. Characterizing these interfaces requires measuring surfactant ...

Yöntem, bir konfokal mikroskobu kılcal basınç mikro tensiyometresi ile birleştirir ve eğri akışkan akışkan arayüzlerini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte incelemek için kullanılabilecek güçlü bir araç oluşturur. Bu teknik, yüzey özelliklerinin eşzamanlı ölçümlerini ve yüksek kavisli arayüzlerde yüzey morfolojilerinin konfokal görüntülerini alarak yüzey aktif malzemeler için yapı ve fonksiyon ilişkilerini inceleyebilir. Enflamasyon ürünlerinin, doğru solunum sıkıntısı sendromu ile ilişkili solunum problemlerine neden olan akciğer sürfaktanını inhibe ettiğini varsayıyoruz.Bu kapı, akciğer sürfaktan özelliklerini, morfolojisini ve bu tür materyallere maruz kalan akciğer stabilitesini araştırabilir. Başlamak için, kılcal damarın büyük tarafını hücrenin alt tarafına doğru itene kadar hücrenin üstüne yerleştirerek CPM hücresini birleştirin. Kılcal damarı sabitlemek için tepe konektörünü yavaşça sıkın ve ardından tüpü mikroakışkan pompadan kılcal damarın büyük tarafına takın.Gerektiğinde, solvent değişim haznesini ve/veya sıcaklık kontrol banyosunu CPM hücresi üzerindeki ilgili giriş ve çıkışlara takın. Aksi takdirde, kullanılmayan giriş ve çıkışları takın. CPM hücresini konfokal mikroskop aşamasına takın ve kabaca CFM hedefi, CPM kamera ve CPM ışık kaynağı ile hizalayın.Mikroakışkan pompaya giden gaz akışını, pompanın önerilen çalışma basıncında açın ve kılcal damara akışın açık olduğundan emin olun. Temel basıncı 25 milibara ayarlayan CPM sanal arabirimini çalıştırmaya başlayın ve basınç kontrol moduna geçin. Ardından CPM hücresini bir pipet kullanarak suyla doldurun.Mikro tensiyometre kamerayı kullanarak kılcal uca odaklanın ve annusu kabarcıkla üst üste binecek şekilde düzenleyin. Konfokal mikroskobun daldırma hedefini hücredeki sıvı ile temas ettirin ve konfokal mikroskobu kullanarak kabarcığa odaklanın. Balonu sıfırla'ya tıklayın ve yeni bir kabarcık oluştuğundan emin olun.Kabarcık açılmazsa, görüntüleme penceresinin altındaki kabarcık sıfırlama sekmesinde sıfırlama basıncını veya sıfırlama gecikme süresini artırın. Doğrudan hücre şırıngası yoluyla suyu çıkarın ve boşaltın ve tekrar takın. Hücreyi istediğiniz numuneyle doldurun.CPM yazılımını basınç kontrol modunda tutan otoklavlanmış bir pipet kullanarak, yeni bir kabarcık arayüzü oluşturulduğunda ilk yüzey geriliminin metre başına yaklaşık 73 mili Newton olmasını sağlar. Yeni oluşan kabarcık yarıçapı belirlendikten sonra o değerin merkez çizgisine girilmesi alan kontrolü ve alan kontrolü sekmesine tıklayarak kontrol türünü alan kontrolü olarak değiştirin. Konfokal videoyu kaydetmeye başlayın, ardından balonu sıfırla'ya tıklayın ve hemen veri topla'ya tıklayın.Çubuğu kaydırarak veri kayıt hızını numunenin toplam emilim süresine göre ayarlayın. Deneyin bitiminden sonra. Doğru dosya yolunu seçip kaydet düğmesine tıklayarak dosyayı kaydedin.Kaydı CFM'de de durdurun ve kaydedin. İstenilen temel değer salınım yüzdesini ve salınım sıklığını girin ve salınımın basınç salınımı mı, alan salınımı mı yoksa eğrilik salınımı mı olacağına karar vererek uygun sekmeyi seçin. Konfokal videoyu kaydetmeye başlayın ve CPM yazılımında veri topla'ya tıklayın.Her salınım döngüsüne yeterli sayıda veri noktası vermek için bir veri toplama hızı seçin. Başka salınım genlikleri veya frekansları isteniyorsa, deney sırasında değerleri değiştirin ve sonuçları kaydedin. İlk olarak, peristaltik pompanın giriş tüpünü istenen değişim çözeltisinin şişesine yerleştirin ve çıkış tüpünü atık kabına yerleştirin.Videoyu konfokal yazılımda kaydetmeye başlayın ve ardından CPM yazılımında veri topla'ya tıklayın. Ardından, peristaltik pompa hızını ayarlayın. Birden fazla sıvının değiştirilmesi gerekiyorsa, peristaltik pompayı durdurun ve girişi başka bir değişim çözümüne bağlayın.Değişim bittikten sonra sonuçları daha önce gösterildiği gibi kaydedin. Sabit bir basınç absorpsiyonu için mikrotensiyometre sonuçları, kabarcık yüzey alanının çalışma boyunca önemli ölçüde arttığını ve sabit yüzey alanı durumundan çok daha yavaş emilime yol açtığını göstermiştir. Absorpsiyon işlemi sırasında, arayüzden gelen floresan sinyali düşük başladı ve yüzey aktif madde arayüze emildikçe arttı.Yüzey aktif madde yüzey alanları oluşturursa, bu alanların oluştuğu ve büyüdüğü gözlemlenebilir. Bir salınım çalışması yaparken, salınım sadece kontrol edilen parametre için gerçekten sinüzoiddir. Yüzey alanı kontrollü bir çalışma için burada gösterildiği gibi, alandaki salınımın sinüzoidal olması gerektiğinden, yüzey dilatasyonel modülünü hesaplarken bu önemlidir.Bir salınım çalışmasından toplanan yüzey gerilimi ve alan verileri, yüzey aktif madde tabakasının ara yüzey dilatasyon modülünü doğrudan hesaplamak için kullanıldı. Bir fosfo lipid mono tabakasını salgılarken, siyah sıvı yoğunlaştırılmış alanların hareketi, sürekli renkli sıvı genişlemiş faz boyunca gözlemlenebilir. Arayüzdeki farklı alanlar, salınımlar kavisli kabarcık üzerinde gerçekleştikçe arayüzü kapsayacak şekilde büyüyen bir dallanma ağına yeniden düzenlendi.Bu, yüzey gerilimi ve yüzey dilatasyon modülündeki eşzamanlı bir değişiklikle doğrulanır. Tampon çözeltisi ve daha sonra kement PC çözeltisi ile bir akciğer yüzey aktif madde monokatmanı için bir çözücü değişim çalışması sırasında, değişim gerçekleştikçe alanların morfolojisi büyük ölçüde değişti. Kılcal damarın kare olduğundan ve kabarcığın küresel şeklini koruduğundan emin olmak için kabarcığın salınımını ve sabitlenmesini görsel olarak takip etmek önemlidir.Hava-su arayüzlerine ek olarak, emülsiyonların stabilitesini ve özelliklerini belirlemek için yağ-su arayüzleri de incelenebilir. Bu teknik, eğri arayüzlerinin yapı özellik ilişkilerini oluşturmak için tek bir değişiklik yaklaşımı sunar. Daha önce sadece düz arayüzlerde çalışılan ırklar arası morfolojiyi yöneten faktörlerin yeni araştırılmasına izin verir.

microtensiometer-for-confocal-microscopy-visualization-dynamic

Research

JoVE Journal

Engineering

Mühendislik

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Bu videoda, uygun bir tampon varlığında bir lamel yüzeyinde büyüyen mikrotübülleri görselleştirmek için girişim yansıma mikroskobu (IRM) tekniğini açıklıyoruz. Gelen ışıkla aydınlatıldıktan sonra, lamel tampon arayüzü ve tampon-mikrotübül arayüzü ışığı yansıtır, bu da bir girişim deseni oluşturmak için birleşerek mikrotübüllerin parlak bir arka plana karşı yüksek kontrastlı görüntüler olarak görselleştirilmesini sağlar.

Mikrotübül Dinamiğinin Etiketsiz Görselleştirilmesi için Girişim Yansıma Mikroskobu

Integrin gerginlik çeşitli hücre işlevlerinde önemli rol oynar. Bir bütünleştirici gerilim sensör ile integrin gerginlik picoNewton (pN) hassasiyeti ile kalibre edilmiş ve Mikronaltı çözünürlükte görüntüsü.

Integrin gerginlik ve hücresel kuvvet bütünleştirici gerilim sensör ile Mikronaltı çözünürlükte görüntüleme

Bu protokol, etiket içermeyen, yüksek kontrastı, yüksek hızlı görüntüleme için standart bir floresan mikroskop üzerinde girişim yansıma mikroskopisi uygulamak için bir kılavuzdur mikrotubules in vitro yüzeyler kullanarak.

Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması

Burada, izole embriyonik zebra balığı hücrelerinin hücre içi mekanik özelliklerini optik bir tuzakla doğrudan kuvvet ölçümü ile üç boyutlu hapsetmede araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

TGT yüzeyi, büyüme faktörü-integrin çapraz konuşmasını incelemek için yenilikçi bir platformdur. Esnek prob tasarımı, adezyon ligandının özgüllüğü ve stimülasyon koşullarının hassas modülasyonu, EGFR-integrin etkileşiminin sağlam nicel değerlendirmelerine izin verir. Sonuçlar, EGFR'yi fokal adezyon montajını ve hücre yayılımını etkileyen bir 'mekanik-düzenleyici' ayar integrin mekaniği olarak vurgulamaktadır.

Büyüme Faktörü Aracılı İntegrin Mekaniği ve Yapışmasını Ölçmek için Gerilim Ölçer Tether Probları

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Bu protokol, tek objektifli, hafif tabakalı bir floresan mikroskobunun nasıl oluşturulacağını ve hücre iskeleti ağlarını görselleştirmek için kullanımını ayrıntılı olarak açıklar.

Hücre iskeleti ağlarının görselleştirilmesi için özelleştirilebilir, tek objektifli, ışık tabakalı floresan mikroskobunun tasarımı ve inşası

Burada, pnömatik olarak çalıştırılan ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile uyumlu çok yönlü bir eşbiaksiyel germe cihazı sunuyoruz.

Yüksek Büyütmeli Canlı Hücre Konfokal Floresan Mikroskobu için Equibiaxial Germe Cihazı

Öğrenin, konfokal mikroskopi ile mikrotensiyometreyi birleştirerek akciğer yüzey aktif maddelerinin yapı-özellik ilişkilerini yüksek çözünürlükte incelemeyi. Bu yöntem, iltihap ürünlerinin solunum sıkıntısına etkisini gerçek zamanlı analiz eder.

Dinamik Arayüzlerin Konfokal Mikroskopi Görselleştirmesi için Mikrotensiyometre

Daha fazla video keşfet