Name: Lentivirüs Aracılı CRISPR / Cas9 Gen Düzenleme Kullanarak Nakavt Kas Hücre Hatlarının Geliştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Öğrenin kas hücrelerinde CRISPR/Cas9 ile gen düzenleme yöntemini. Bu protokol myoblastlarda nakavt hücre hatları geliştirerek kas hastalıklarında gen fonksiyonlarını hızlı ve ekonomik şekilde araştırmanızı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) ve Auvergne-Rhône Alpes Région'dan (AURA) gelen hibelerle finanse edildi.

<ol><li>Claussnitzer, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+metabolic+diseases+from+human+genetic+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries.</a> Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).</li>
<li>Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR+tools+for+variant+interpretation+and+disease+modeling+in+inherited+retinal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies.</a> Genes. 11 (5), 473(2020).</li>
<li>Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+therapeutics%3A+current+challenges+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+correction+of+muscular+dystrophy+by+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).</li>
<li>Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+specificity+of+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Target specificity of the CRISPR-Cas9 system.</a> Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).</li>
<li>Merienne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+self-inactivating+KamiCas9+system+for+the+editing+of+CNS+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes.</a> Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).</li>
<li>Marty, I., Fauré, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-contraction+coupling+alterations+in+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Excitation-contraction coupling alterations in myopathies.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li>
<li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick%2C+cost-free+method+of+purification+of+DNA+fragments+from+agarose+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li>
<li>Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+3+and+type+1+ryanodine+receptors+are+localized+in+triads+of+the+same+mammalian+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).</li>
<li>Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+linear+Lowry--Folin+assay+for+both+water-soluble+and+sodium+dodecyl+sulfate-solubilized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins.</a> Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).</li>
<li>Garibaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dusty+core+disease%27+%28DuCD%29%3A+expanding+morphological+spectrum+of+RYR1+recessive+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3(2019).</li>
<li>Marty, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+a+complex+involving+Dihydropyridine+receptor+and+Ryanodine+receptor+in+triad+junctions+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).</li>
<li>Oddoux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triadin+deletion+induces+impaired+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>Cacheux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+central+core+disease+RyR1+mutation+%28p.Y4864H%29+associated+with+quantitative+defect+in+RyR1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).</li>
<li>Luis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+old+and+the+new%3A+Prospects+for+non-integrating+lentiviral+vector+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology.</a> Viruses. 12 (10), 1103(2020).</li>
<li>Leenay, R. T., Beisel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering%2C+communicating%2C+and+engineering+the+CRISPR+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Patolojilerde yer alan bilinmeyen fonksiyona sahip genlerin karakterizasyonuna giden yolda önemli bir adım, bu genlerin işlevini incelemek için ilgili hücresel modellerin geliştirilmesidir. CRISPR / Cas9 kullanarak gen düzenlemenin kullanımı katlanarak büyüyen bir araştırma alanıdır ve burada sunulduğu gibi nakavt modellerinin geliştirilmesi en yaygın kullanılan uygulamaları arasındadır. Bu bağlamda, burada, ilgilenilen herhangi bir gende bir insan hücre hattı nakavtı geliştirmek için çok yönlü bir protokol öneriyoruz ve...

Gen diziliminin ilerlemesi ve belirli bir dokudaki bilinmeyen fonksiyonlara sahip genlerdeki mutasyonların tanımlanmasıyla, yeni bir hedef genin işlevini anlamak ve ilgili patofizyolojik mekanizmalara katılımını doğrulamak için ilgili hücresel modellerin geliştirilmesi önemli bir araç oluşturmaktadır. Ek olarak, bu modeller gelecekteki terapötik gelişmeler için büyük önem taşımaktadır 1,2 ve deneylerde hayvanların kullanımının azaltılmasına yönelik uluslararası önerilerle aynı doğrultuda nakavt hayvan modellerinin geliştirilmesine ilginç bir alternatif oluşturmaktadır. CRISPR / Cas9 kullanarak gen düzenleme, şu anda mevcut olan en güçlü araçlar arasındadır, bu da birçok nakavt / knock-in modelinin geliştirilmesine izin vermiştir ve CRISPR / Cas9 kullanarak hedeflenen gen doğrulaması, CRISPR / Cas93'ün en yaygın kullanılan uygulamaları arasındadır. Gen düzenlemenin başarısı, hedef hücre modelinde CRISPR araçlarını (kılavuz RNA'lar ve nükleaz Cas9) tanıtma yeteneğine dayanır; bu,kas hücreleri 4 gibi transfekt edilmesi zor birçok hücrede zor olabilir. Bu zorluk, birçok hücre tipini verimli bir şekilde dönüştürmek ve transgenini iletmek için büyük avantaja sahip olan virüsün, genellikle lentivirüsün kullanılmasıyla aşılabilir. Ancak en büyük dezavantajı, transgenin konakçı hücre genomuna entegrasyonudur, bu da entegrasyon bölgesinde lokalize genlerin potansiyel olarak değişmesine ve transgenin kalıcı ekspresyonuna yol açar, bu da nükleaz Cas9 durumunda zararlı sonuçlara neden olur5. Merienne ve meslektaşları6 tarafından, Cas9 geninin kendisini hedef alan ve Cas9 inaktivasyonuna yol açan bir kılavuz-RNA'nın hücrelerine girişten oluşan akıllı bir çözüm önerilmiştir. Bu stratejinin bir uyarlaması, burada, transfekte edilmesi zor hücrelerdeki hemen hemen her genin yok edilmesine izin veren kullanıcı dostu ve çok yönlü bir protokol olarak sunulmaktadır.
Burada sunulan protokolün amacı, ölümsüzleştirilmiş kas hücrelerine ilgi duyan bir genin inaktivasyonunu indüklemektir. Farklı ölümsüzleştirilmiş hücre türlerinde ilgilenilen herhangi bir geni yok etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan protokol, kılavuz RNA'ları ve bunların lentiviral plazmidlere klonlanmasını tasarlamak, lentiviral vektörlerde CRISPR araçlarını üretmek, hücreleri farklı lentivirüslerle dönüştürmek ve homojen düzenlenmiş bir hücre hattı üretmek için hücreleri klonlamak için adımlar içerir.
Bu protokolü kullanarak, ölümsüzleştirilmiş insan iskelet kası hücreleri, hücre içi kalsiyum salınımı ve kas kasılmasında rol oynayan temel bir kalsiyum kanalı olan tip 1 ryanodin reseptörünün (RyR1) silinmesiyle geliştirilmiştir7. Genin nakavtı (KO), Western blot kullanılarak protein seviyesinde ve kalsiyum görüntüleme kullanılarak fonksiyonel düzeyde doğrulanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Anti-CACNA1S antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA048892</td><td>Primer antikor</td></tr><tr><td>Blp I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0585S</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>CalPhos Memeli Transfeksiyon Kiti</td><td>Takara</td><td>631312&nbsp;</td><td>Transfeksiyon kiti</td></tr><tr><td>Kolay leke önleyici Fare IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221667-01</td><td>HRP ikincil antikoru</td></tr><tr><td>Kolay leke anti Tavşan IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221666</td><td>HRP ikincil antikoru</td></tr><tr><td>Fluo-4 doğrudan</td><td>Moleküler Problar</td><td>F10472</td><td>Kalsiyum görüntüleme</td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Tavşan mAb ve nbsp;</td><td>Hücre Sinyalleme Teknolojisi</td> <td># 2118</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Fermentas</td><td>ER0501</td><td>Kısıtlama enzimi</td></tr><tr><td>InFusion HD Precision Plus</td><td>Takara</td><td>638920</td><td>Ligasyon kiti</td></tr><tr><td>MasterMix Phusion GC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F532L</td><td>ile Yüksek Sadakat Yüksek kaliteli Taq polimeraz ve dNTP'ler</td></tr><tr><td>Miyozin Ağır Zincir antikoru</td> ile PCR reaksiyonu için karıştırın<td>DHSB</td><td>MF20</td><td>Primer antikor</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>REF&nbsp; 740424</td><td>Plazmitlerin saflaştırılması için Maxipreparation kiti</td></tr><tr><td>NucleoSpin Jel ve PCR Temizleme</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td>DNA saflaştırması</td></tr><tr><td>NucleoSpin Doku</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952</td><td>Hücreden DNA ekstraksiyonu için kit</td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Kimyasal Olarak Yetkin&nbsp;E. coli</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>C737303</td><td>Kimyasal olarak yetkin hücreler</td></tr><tr><td>Plazmid #87904</td><td>Addgene</td><td>87904</td><td>SpCas9'u kodlayan Lentiviral plazmit (LV-Cas9 için)</td></tr><tr><td>Plazmid #87919</td><td>Addgene</td><td>87919</td><td>Kılavuzlu kasetin yerleştirilmesi için lentiviral omurga (LV-kılavuz-hedef için)</td></tr><tr><td>Plazmid #12260</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Lentiviral plazmid kodlama lentiviral ambalajı GAG POL</td></tr><tr><td>Plazmid #8454</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>Lentiviral ve MuLV retroviral partikülleri üretmek için lentiviral plazmid kodlayan zarf proteini</td></tr><tr><td>V5 Etiketi Monoklonal Antikor</td><td>Invitrogene</td><td>R96025 & nbsp;</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>XL10-Altın Ultra Yetkin Hücreler</td><td>Agilent</td><td>200317</td><td>Kimyasal olarak yetkin hücreler</td></tr><tr><td>Xma I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0180S</td><td>Kısıtlama enzimi</td></tr></tbody></table>

lentivirüs aracılı crispr / cas9 gen düzenleme kullanarak nakavt kas hücre hatlarının geliştirilmesi

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

Kümelenmiş düzenleyici aralıklı kısa palindromik tekrarların (CRISPR) / Cas 9'un önemli bir uygulaması, özellikle genetik tanı sırasında tanımlanan bir hastalıkla ilişkili yeni genlerin / proteinlerin işlevini incelemek için nakavt hücre hatlarının geliştirilmesidir. Bu tür hücre hatlarının gelişimi için, iki ana konunun çözülmesi gerekir: CRISPR araçlarının (Cas9 ve kılavuz RNA) seçilen hücrelere yüksek verimlilikle yerleştirilmesi ve Cas9 aktivitesinin seçilen genin spesifik olarak silinmesiyle sınırlandırılması. Burada açıklanan protokol, CRISPR araçlarının kas hücreleri gibi transfekte edilmesi zor hücrelere yerleştirilmesine adanmıştır. Bu protokol, halka açık plazmidlerle üretilen lentivirüslerin kullanımına dayanmaktadır ve tüm klonlama adımlarının ilgilenilen bir geni hedeflemek için tanımlandığı bilinmektedir. Cas9 aktivitesinin kontrolü, Cas9'u hedef alan bir kılavuz RNA'yı kodlayan bir lentivirüs ile hücrelerin transdüksiyonunun Cas9 ekspresyonunun aşamalı olarak ortadan kaldırılmasına izin verdiği KamiCas9 adı verilen daha önce tanımlanmış bir sistemin adaptasyonu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokol, kas hücre içi kalsiyum salınımında ve uyarım-kasılma eşleşmesinde yer alan bu önemli kalsiyum kanalının nakavtını doğrulamak için protein ve fonksiyonel düzeyde daha da karakterize edilen bir RYR1-nakavt insan kas hücresi hattının geliştirilmesine uygulanmıştır. Burada açıklanan prosedür, kas hücrelerindeki diğer genlere veya transfekte edilmesi zor diğer hücrelere kolayca uygulanabilir ve bu genleri insan hücrelerinde incelemek için değerli araçlar üretebilir.

Bu protokol, RyR1 proteinini kodlayan RYR1 genini yok etmek için RyR1'in daha önce16 olarak karakterize edildiği sağlıklı bir denek15'ten (insan miyoblastları için HM hücreleri olarak adlandırılır) ölümsüzleştirilmiş miyoblastlara uygulandı. RNA kılavuzlarının tasarımı, genin ekzon 101 ve intron 101'in bir kısmını kapsayan diziyi silmek için yapıldı. Ekzon 101'in bir kısmının silinmesinin okuma çerçevesinin bozulmasına neden olması öngörülmektedir. Ek olarak, ekzon...

Protokol, kılavuz-RNA'ların tasarımından hücresel klonlamaya ve nakavt klonlarının karakterizasyonuna kadar CRISPR / Cas9 kullanarak nakavt miyoblastlarının nasıl üretileceğini açıklar.

Lentivirüs Aracılı CRISPR / Cas9 Gen Düzenleme Kullanarak Nakavt Kas Hücre Hatlarının Geliştirilmesi

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Bu protokol, bu genin kastaki işlevini daha fazla incelemek için herhangi bir gende kas hücresi nakavtının gelişmesine izin verir. Bunun avantajı, herhangi bir geni incelemek için nakavt hayvanların gelişiminden daha ucuz ve hızlı olmasıdır. Bu teknik, örneğin, yeni tanımlanmış bir genin bir miyopatiye katılımını incelemek için kullanılabilir.Burada açıklanan teknik iPS hücrelerine uygulanırsa, herhangi bir hücre türündeki herhangi bir gen için nakavt hücrelerin gelişmesine yol açabilir. Kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlara veya CRISPR aracılı gen delesyonuna başlamak için, önce ensembl gibi genom tarayıcı araçlarını kullanın. Hedef geni, her iki tarafındaki DNA dizileri ile birlikte tanımlamak için organizasyon.Gen ekzonlarının listesini almak için, önce protein kodlama dizisinin transkriptine ve ardından ekzonlara tıklayın. Ardından, Sırayı indir'e tıklayın ve tüm genin tam fikir birliği dizisini indirmek için yalnızca Genomik dizi'yi seçin. Hedeflenenleri seçmek için genin ekzonların ve intronlarının listesini kaydırın.Kılavuz RNA'yı tasarlamak için, önce hedef dizinin hemen yukarı ve aşağı akış intronlarının nükleotid dizilerini seçin. Ardından crispr.tefor gibi bir web sitesine gidin. ağ ve seçilen dizileri, birkaç yüz baz çifti ile ayrılmış Protospacer Bitişik Motif olmadan her biri 20 nükleotid uzunluğunda iki kılavuz RNA tasarlamak için kullanın.Daha sonra her kılavuz RNA için ters kompleman dizisini belirleyin ve primerleri sıralayın. Plazmid klonlaması için kılavuz RNA kasetleri oluşturmak için, önce metinde açıklanan tarif ve programı kullanarak bir dizi primer içeren bir PCR çalıştırın, ardından PCR ürünlerini Tris-borat-EDTA tamponunu kullanarak% 1 agaroz jelinde ayırın. Daha sonra 300 baz çift parçasını tüketin ve bir kit kullanarak saflaştırın.Benzer şekilde, diğer astar seti ile başka bir PCR çalıştırdıktan sonra, 400 baz çifti uzunluğundaki DNA fragmanını 20 mikrolitre elüsyon tamponuna saflaştırın. Kılavuz RNA kasetlerini lentiviral plazmid omurgasına yerleştirmek için, önce metinde açıklandığı gibi Xma 1 ve Blp 1 kısıtlama enzimleri ile plazmidin çift sindirim reaksiyonunu ayarlayın. Reaksiyon tüpünü bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, 20 dakika boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin, ardından sindirim ürününü% 1'lik bir agaroz jeli içinde çalıştırın ve uygun bir kit kullanarak yaklaşık 10 kilobaz çiftinin plazmidini arındırın.Ayrıca optik yoğunluğu ölçerek saflaştırılmış ürünü ölçün. Kılavuz RNA kasetini plazmidle bağlamak için, saflaştırılmış kılavuz RNA, doğrusallaştırılmış plazmid DNA'sı, enzim ve su ile 10 mikrolitrelik bir son hacme kadar bir reaksiyon karışımı hazırlayın, ardından reaksiyon tüpünü 15 dakika boyunca 50 santigrat derecede inkübe ederek pGuide adı verilen son plazmidi üretin. Lentivirüs üretimi için, ilk önce DMEM'de 1 milyon HEK 293 hücreli 145 santimetrelik bir plakayı,% 10 FBS ve% 1 penisilin veya streptomisin ile desteklenmiş yüksek glikoz ve piruvat ile tohumlayın.Daha sonra hücreleri% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe üç gün boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Dördüncü günde,% 60 ila% 65 akıcılık sağlamak için hücreleri kontrol edin. Daha sonra ilgilenilen plazmid, virüs zarfını kodlayan plazmid, lentiviral ambalaj plazmidi psPAX2 ve kalsiyum fosfattan oluşan transfeksiyon çözeltisini hazırlayın.Son ses seviyesini suyla 1000 mikrolitreye ayarlayın. Daha sonra transfeksiyon çözeltisini çalkalama altında bir mililitre 2X HBS'ye damla damla ekleyin ve oda sıcaklığında en az 10 dakika inkübe edin. Bundan sonra, çözeltiyi hücrelere damla damla ekleyin.Transfeksiyon çözeltisinin homojen bir dağılımı için, plakayı yavaşça her yöne eğin, ardından hücreleri en az beş saat boyunca% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, ortamı plakalardan çıkarın ve transfeksiyon reaktiflerinden kurtulmak için hücreleri PBS ile yıkayın, ardından 12 mililitre taze ortam ekleyin. 37 santigrat derecede 48 saatlik inkübasyondan sonra, medyayı tüm plakalardan bir tüp halinde toplayın.Tüpü kapalı bir kovaya koyun ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 800 kez G'de santrifüj yapın, ardından süpernatantı 0.45 mikrometrelik bir filtre kullanarak filtreleyin ve sallanan bir kova rotoru kullanarak filtratı dört santigrat derecede iki saat boyunca 68, 300 kez G'de santrifüj edin. Süper natantı çıkardıktan sonra, peletlerden maksimum sıvı uzaklaştırılması için tüpleri bir güvenlik dolabında bir kağıt havlu üzerinde baş aşağı tutun. 100 mikrolitre HEC çoğalma ortamı ekleyin ve tüpleri en az iki saat boyunca dört santigrat derecede tutun.Daha sonra pipetle pelet ile yeniden askıya alın. Tüm askıya alınmış peletleri topladıktan sonra, 10 veya 25 mikrolitrelik alikotlar yapın, ardından sıvı hidrojende dondurulduktan sonra alikotları eksi 80 santigrat derecede saklayın. Miyoblast transdüksiyonu için, ilk önce 10.000 miyoblast hücresi içeren 100 mikrolitre proliferasyon ortamı içeren 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna tohumlayın.Ertesi gün, bir güvenlik kabinindeki hücrelere önceden hesaplanmış hacimlerde AG kılavuzları ve LV Cas9 ekleyin. Beş günlük inkübasyondan sonra, tripsin ekleyerek hücreleri kuyudan serbest bırakın. Hücre sayılarını saydıktan sonra, hücreleri% 40 ila% 50 akıcılığa sahip kuyulardan yeni bir plakaya aktarın.Beş saatlik inkübasyondan sonra, 20 enfeksiyon çokluğunda hesaplanan LV öldürücü hacimlerini ekleyin ve beş ila 10 gün veya aralarında en az iki pasaj için kuluçkaya yatırın. Kalsiyum görüntüleme ile gen düzenlenmiş klonların fonksiyonel karakterizasyonu için, laminin kaplı 35 milimetrelik bir kabın merkezinde 50.000 hücre plakası. Farklılaştırmayı tetiklemek için, metinde açıklandığı gibi farklılaştırma ortamını ekleyin.Altı günlük inkübasyondan sonra, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri hidrofobik bir kalemle tanımlayın. Daha sonra farklılaşmış miyotüplere farklılaşma ortamında bire bir seyreltilmiş 50 mikrolitre Fluo-4 Direct ekleyin. Bulaşıkları 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, hücreleri mililitre glikoz başına bir miligram ile desteklenmiş Krebs tamponu ile iki kez yıkayın.Daha sonra, floresan varyasyonlarını 90 saniye boyunca saniyede bir kare hızında ölçmek ve en az 10 miyotüp içeren bir alan seçmek için ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu veya 10X hedefli bir konfokal mikroskop kullanın. Ek Krebs tamponunu çıkardıktan sonra, membran depolarizasyonu veya iki mililitre florokloral metakresol veya 4CmC veya RyR1 doğrudan stimülasyonu için hücreleri iki mililitre potasyum klorür ile uyarın. Stimülasyondan sonra floresan varyasyonunu görselleştirin, ardından her miyotüpteki floresan varyasyonunu ölçün.Bu protokol, RyR1 genini insan miyoblastlarından nakavt etmek için başarıyla kullanılabilir ve bu da hücrelerde daha kısa genomik DNA ile sonuçlanır. RyR1 nakavtı, RyR1 proteininin hedeflenen hücrelerde Batı lekelenmesiyle tespit edilemediği için protein düzeyinde de doğrulandı. RyR1 nakavt hücrelerinden farklılaşan miyotüplerde RyR1 aktivitesinin yokluğu, 4CmC ile doğrudan RyR1 stimülasyonundan veya potasyum klorür kaynaklı membran depolarizasyonu ile dolaylı stimülasyondan sonra Fluo-4 kalsiyum görüntüleme ile daha da doğrulanmıştır.Silinecek dizi, fonksiyonel bir proteinin tahmini için gerekli olmalıdır. Bu teknik, kas hastalığında yeni genin katılımını incelemek için post-genomik araçların geliştirilmesi için idealdir.

development-knock-out-muscle-cell-lines-using-lentivirus-mediated

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

Bir iletişim kuralı için hızlı fare CRISPR/Cas9-aracılı gene bozulma ve insan birincil hematopoetik hücreler bu makalede açıklanan. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins elektroporasyon ile vitro transkripsiyon ve ticari Cas9 ile oluşturulan sgRNAs ile tanıtılmaktadır. Yüksek Düzenleme verimliliği sınırlı zaman ve maliyet ile elde edilir.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Burada, genetik olarak Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) kullanarak birincil veya genişletilmiş insan doğal öldürücü (NK) hücreleri değiştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralını kullanarak, biz insan NK hücreleri dönüştürme büyüme faktörü-b reseptör 2 (TGFBR2) ve hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) için eksik oluşturulan.

Cas9 Ribonucleoproteins kullanarak Knock-out birincil ve genişletilmiş insan NK hücre üretimi

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Burada, embriyonik kök hücreler kullanarak, özellikle büyük DNA knock-in (KI) için genetiği değiştirilmiş fare modelleri geliştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, CRISPR / Cas9 genom düzenlemesi kullanılarak ayarlanır ve geleneksel homolog rekombinasyon aracılı doğrusallaştırılmış DNA hedefleme yöntemine kıyasla önemli ölçüde iyileştirilmiş KI verimliliği ile sonuçlanır.

Genle Manipüle Edilmiş Fare Modelleri Geliştirmek için Embriyonik Kök Hücrelerde CRISPR / Cas9 Aracılı Yüksek Verimli Gen Hedefleme

CRISPR ile ilgili protokoller giderek daha kullanışlı ve erişilebilir hale geldikçe, belirli deneysel koşullar altında komplikasyonlar ve engeller hala ortaya çıkabilir. Bu protokol, CRISPR/Cas9 kullanarak reseptörle etkileşime giren bir serin/treonin-protein kinaz 1 (RIPK1/RIP1) nakavt insan hücre hattının oluşturulmasını ana hatlarıyla belirtir ve bu işlem sırasında karşılaşılan potansiyel zorlukları vurgular.

CRISPR-Cas1 Sistemini Kullanarak Bir RIP937 Nakavt U9 Hücre Hattının Oluşturulması

Sunulan yöntem, yüksek verimli bir lentiviral aracılı gen dağıtım sistemi kullanarak L2HGDH genini hedefleyen sgRNA'ları kararlı bir şekilde ifade eden insan embriyonik kök hücre (hESC) hattı H9'da CRISPR aracılı bir gen nakavtının oluşturulmasını açıklar.

Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

THP-1 hücre hattı, biyoloji ile ilgili çeşitli araştırma alanlarında insan monositlerinin / makrofajlarının işlevlerini araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, sağlam ve tekrarlanabilir fenotipik verilerin üretilmesini sağlayan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik ve tek hücreli klon izolasyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

Detaylar, Toxoplasma gondii'de bir ilaca direnç genini tanımlamak için bütün genom dizisi tabanlı bir genetik harita ile QTL haritalamasının nasıl kullanılacağı ve bunun, bir genomik hedefi verimli bir şekilde düzenleyen CRISPR / Cas9 sistemi ile nasıl doğrulanabileceği üzerine sunulmaktadır; bu durumda Ilaç direnci geni.

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için<emToksoplasma gondii</em

Öğrenin kas hücrelerinde CRISPR/Cas9 ile gen düzenleme yöntemini. Bu protokol myoblastlarda nakavt hücre hatları geliştirerek kas hastalıklarında gen fonksiyonlarını hızlı ve ekonomik şekilde araştırmanızı sağlar.

Lentivirüs Aracılı CRISPR / Cas9 Gen Düzenleme Kullanarak Nakavt Kas Hücre Hatlarının Geliştirilmesi

Daha fazla video keşfet