Name: Caenorhabditis elegans Bağırsaklarının El Diseksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Öğrenin Caenorhabditis elegans bağırsaklarının el diseksiyonu tekniğini genomik ve proteomik analizler için. Bu yöntem, yüksek kaliteli RNA elde ederek hücreye özgü popülasyonları incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Başlangıçta bu protokolün uyarlandığı bağırsak diseksiyon yöntemini geliştiren James McGhee ve Barb Goszczynski'nin öncü çalışmalarına borçluyuz. Çalışmalarımız, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (Ulusal Sağlık Enstitüleri, R35GM124877'den EON'a) tarafından denetlenen bir MIRA (R35) Ödülü ve NSF MCB Moleküler ve Hücresel Biyobilim Div'i (EON'a Ödül #2143849) tarafından denetlenen bir NSF-KARİYER Ödülü ile desteklenmektedir.

Bu çalışmada CL2122 solucanları kullanılmıştır. Solucanlar, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC, bakınız Malzeme Tablosu) aracılığıyla elde edildi.
1. Diseksiyon için solucanların büyümesi
<ol><li>Standart kültürleme prosedürlerini (yani, E. coli OP50 ile tohumlanmış NGM plakaları) 36,37'yi izleyerek senkronizasyon için karışık aşama CL2122 solucanlarından oluşan büyük bir plaka yetiştirin. NOT: Maksimum yumurtlama kapasitesine ulaşmak genellikle ~ 96 saat sürer.<ol><li>Embriyo solucanları 72-96 saatlik periyotta hazırlar. Embriyo hazırlandıktan sonra, embriyoların M9'da (bakınız Tablo 1) 48 saat boyunca yumurtadan çıkmasına izin verin. Bu, senkronize bir L1 evre solucanı popülasyonu verecektir. NOT: CL2122 solucanları, bağırsağa özgü mtl-2 (MeTaLlothionein 2) promotörü38'den tahrik edilen entegre bir transgen-GFP (yeşil floresan proteini) barındırır. Bu promotör, bağırsak hücresi sitoplazmasına özgüdür ve bağırsağın floresan diseksiyon mikroskobunda görselleştirilmesini sağlar. Eğitildikten sonra, kullanıcılar floresan rehberliğini gerekli bulamayabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaka senkronize L1 solucanları en az iki küçük plaka üzerinde. NGM plakalarında yetişkin aşamasına ulaşana kadar yeterli yiyecekle solucanlar yetiştirin (yumurtlama yeteneğine sahip embriyoların varlığı ile tanımlanır). Bu, 20 °C'de 38-46 saat arasında sürer.<ol><li>Aynı gelişim aşamasının replikalar ve karşılaştırmalı suşlar arasında toplandığından emin olun. NOT: Solucanların yetiştirilme süresinin uzunluğu, suşa, sıcaklığa, besin kaynağına ve hedeflenen gelişim aşamasına bağlıdır39. L4 ve yaşlı yetişkin aşamaları gibi yetişkin aşamasına yakın diğer aşamalar da kullanılabilir. Mikrobiyom deneylerini planlamak için, geleneksel gıda kaynağının (E. coli OP50) ötesindeki farklı bakteriyel gıda kaynakları, CeMbio suşları 4 veya ilgilenilen bir patojen40 gibi solucanlar yetiştirmek için kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Stok çözeltilerinin ve mikrokapiler pipetlerin hazırlanması
NOT: Tablo 1 , bu çalışma için kullanılan tüm tamponların ve çözeltilerin ayrıntılarını vermektedir.
<ol><li>Nükleaz içermeyen konik bir tüpte 50 mL Yumurta tuzu (diğer adıyla Yumurta tamponu) hazırlayın (bkz. Yapıldıktan sonra, oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Nükleaz içermeyen konik bir tüp içinde 10 mL'lik 100 mM levamisol stok çözeltisi hazırlayın. Hazırlandıktan sonra, 500 μL alikot yapın ve bunları -20 ° C'de saklayın. Alikotlar çözülebilir ve bir seferde 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.</li>
	<li>Nükleaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL stok asetillenmiş sığır serum albümini (BSA) çözeltisi hazırlayın. Hazırlandıktan sonra, 50 μL tek kullanımlık alikotlar yapın ve bunları -20 ° C'de saklayın. NOT: BSA'nın asetillenmiş versiyonunu kullanmak önemlidir, çünkü bu nükleaz içermeyen tek BSA şeklidir. Asetilasyonsuz BSA önemli bir nükleaz kaynağı olabilir ve bu nedenle numunelerin bozulmasına neden olabilir.</li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek her biri en az beş adet 50 μm ve 100 μm mikrokapiler pipet hazırlayın.<ol><li>İlk olarak, standart cam kılcal damarları (4 inç uzunluğunda ve 1,2 mm dış çapında) bir iğne çektirme makinesi kullanarak bir enjeksiyon iğnesi şekline çekin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve Sutter Instruments Pipet Yemek Kitabı41'den "Yapışkan Hücre, C. elegans, & Drosophila" için koşullar (Koşullar: Isı = Rampa + 5; Çekme = 100; Vel. = 75; Gecikme = 90; Basınç = 500; 2,5 mm x 2,5 mm Kutu).</li>
		<li>Daha sonra, mikrokapiler pipetleri bir mikroforge kullanarak 50 μm (M5/0.1 hedefi altındaki microforge oküler cetvel tarafından belirtilen üç onay işareti) veya 100 μm (aynı koşullar altında beş onay işareti) boyutuna kadar dövün (bkz. Bu boyutlar mikrokapiler pipetin tahmini açılma çapını temsil eder (Şekil 3).</li>
		<li>Ardından, mikrokapiller pipetlere bir ağız aspiratör tüpü yapıştırın. NOT: Aspiratör pipetleri geleneksel olarak ağızdan pipetleme ile kontrol edilir, ancak birçok modern güvenlik protokolü bu yönteme izin vermez. Bu nedenle, kullanıcılar boruyu parmak ve başparmak arasına sıkıştırarak ağız aspiratör borusu ile aspirasyonu kontrol edebilirler. Ek olarak, daha fazla güvenlik için ağız aspiratör boru sistemine bir şırınga filtresi monte edilebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Deneysel hazırlık
<ol><li>Nükleaz içermeyen konik bir tüpte 5 mL diseksiyon tamponu hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Nükleaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL çalışma asetillenmiş BSA çözeltisi hazırlayın. Buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Nükleaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpünde 350 μL çalışma levamisol çözeltisi yapın. Üçlü olarak hazırlayın (yaklaşık 20 solucan için bir tüp). Buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Şelasyon tamponunu nükleaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın (Tablo 1). Çoğaltın (yaklaşık 10 disseke solucan için bir tüp). Buz üzerinde tutun. El diseksiyonları sırasında şelasyon tamponunun kullanılması RNA kalitesini ve miktarını artırır (Şekil 4).</li>
	<li>Nükleaz içermeyen bir tüpte 500 μL nükleik asit izolasyon reaktifi veya kit tarafından belirtilen izolasyon reaktifi içeren deney grubu başına bir mikrosantrifüj tüpü hazırlayın (bkz. Buz üzerinde tutun. Bu tüp, depolama veya daha sonra kullanım için nihai, izole bağırsakları toplamak için kullanılacaktır.</li>
	<li>Bir M9 banyosu ve bir diseksiyon tampon banyosu hazırlayın. Bunu yapmak için, iki adet 35 mm çapında steril Petri kabı elde edin. Ardından, bir kaba 2 mL M9 ve diğerine 2 mL diseksiyon tamponu ekleyin. Son olarak, her banyoya 100 μL çalışan BSA çözeltisi ekleyin. Karıştırmak için girdap. Banyolara BSA eklenmesi, solucanların plastiğe yapışmasını önleyecektir.</li>
	<li>Diseksiyon dizisini hazırlayın. 2 delikli bir konkavite sürgüsü elde edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ilk kuyucuğa 150 μL çalışma levamisol çözeltisi ekleyin. Ardından, ikinci kuyucuğa 150 μL diseksiyon tamponu ekleyin. Son olarak, her bir kuyucuğa 20 μL çalışan BSA çözeltisi ekleyin. Her bir kuyucuğa BSA eklenmesi, solucanların slayta yapışmasını önleyecektir.</li>
</ol>4. C. elegans bağırsağının el diseksiyonu
<ol><li>Bir solucan toplama yöntemi kullanarak 20 yetişkin solucanı NGM plakasından M9 banyosuna taşıyın (adım 3.6). Bu, solucanlardan dış bakterileri yıkayacaktır.</li>
	<li>Ardından, 20 solucanın tümünü M9 banyosundan diseksiyon tampon banyosuna taşıyın (adım 3.6). Bu, dış bakterileri daha da yıkayacak ve diseksiyon tamponundaki solucanları dengeleyecektir.</li>
	<li>Daha sonra, solucan gruplarını (yani, 10'lu setler halinde) diseksiyon tampon banyosundan levamisol çözeltisi içeren kuyuya (adım 3.7) taşıyın. NOT: Levamisol solucanları geçici olarak felç edecektir.<ol><li>Solucan hareketleri yavaşladığında, onları levamisol kuyucuğundan diseksiyon tamponunu içeren kuyuya hızla taşıyın (adım 3.7). Solucanları aşırı felç etmemeye dikkat edin. NOT: Gruplar halinde levamisol çözeltisine taşınan solucanların sayısı, kullanıcının rahatlığına bağlı olarak değişebilir. Bu, başlangıçta M9 banyosuna toplanan ve daha sonra diseksiyon tampon banyosuna taşınan solucanların sayısı için de geçerlidir. Özellikle eğitim sırasında, kullanıcı protokolü öğrendiği ve rahat ettiği için diseksiyon için ek solucanlara sahip olmak iyi bir uygulamadır.</li>
	</ol></li>
	<li>Ardından, diseksiyonlara başlamadan önce solucanların diseksiyon tamponunda biraz hareket etmeye başlamasına izin verin. NOT: Bağırsaklar aşırı felçli solucanlardan (yani, hiç hareket etmeyen solucanlardan) iyi ekstrüzyon yapmazlar.</li>
	<li>Hazır olduğunda, solucanları hipodermik bir iğne (yani, 27 G x 1/2 inç) kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu) bir floresan diseksiyon kapsamı altında, farenksin hemen arkasında (Şekil 5Aa) veya rektumun hemen önünde (Şekil 5Ab) bir kesim yaparak diseke edin. Bu, bağırsağın iki büyük bölümünü, bir ön-orta yarısı ve bir orta-arka yarısıI üretecektir. İstenilen toplam bağırsak sayısı elde edilene kadar ön-orta ve orta-arka bölümlerden elde edilen bağırsak bölümlerinin sayısını eşdeğer tutarak solucanların geri kalanı için bu kalıba devam edin. NOT: Hipodermik iğneyi boş bir 1 mL şırınga namlusuna yapıştırmak, el diseksiyonları sırasında manipülasyonuna yardımcı olabilir. Kullanıcının rahatlığına ve deneyimine bağlı olarak, bağırsak parçası vermeyen bir diseksiyon kesimi yapmak nadir değildir. Bununla birlikte, pratikle, bu çok daha az yaygın hale gelir.</li>
	<li>Bağırsakların vücuttan maksimum ekstrüzyon yapması için yaklaşık 1 dakika bekleyin. Genellikle bir döngü şekli alırlar ve gonadların bir kısmına yapışabilirler (Şekil 5A). Beklerken, RNA bozulmasını azaltmaya yardımcı olmak için kuyucuğa 50 μL şelat tamponu ekleyin (Şekil 4).</li>
	<li>Beklerken ve bağırsak ekstrüzyonunu kolaylaştırmaya yardımcı olmak için, bir ağız aspiratörüne bağlı 100 μm mikrokapiller pipeti kullanın ve bağırsak / solucanı pipetin içine ve dışına çekin (Şekil 5B). Bu aynı zamanda bağırsağın gonaddan kurtarılmasına yardımcı olacaktır. Bağırsakları yanlışlıkla mikrokapiler pipete tamamen emerek kaybetmemeye dikkat edin. NOT: Kullanıcı, bağırsağı vücudun geri kalanından ve gonaddan kurtarmak için 100 μm ve 50 μm mikrokapiler pipetler arasında geçiş yapabilir. 50 μm mikrokapiler pipetin daha küçük çaplı açıklığı, yapışkan parçaların bağırsaktan çıkarılması için bir fayda sağlayabilir. Aspiratör pipetleri geleneksel olarak ağızlı pipetleme ile kontrol edilir, ancak birçok modern güvenlik protokolü bu yönteme izin vermez. Bu nedenle, kullanıcılar boruyu parmak ve başparmak arasına sıkıştırarak ağız aspiratör borusu ile aspirasyonu kontrol edebilirler. Ek olarak, daha fazla güvenlik için ağız aspiratör boru sistemine bir şırınga filtresi monte edilebilir.</li>
	<li>Bir bağırsak yeterince ekstrüde edildikten sonra, vücudun geri kalanından ve kalan gonaddan kesmek için 27 G hipodermik iğneyi kullanın. İzole edilen bağırsak bölümünün boyutu, biçerdöverin deneyimine, kesimin kalitesine ve solucandaki felç seviyesine bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. NOT: Bağırsak ve bağırsak parçalarının bütünlüğü, GFP floresanları aracılığıyla protokol boyunca kolayca izlenebilir.</li>
	<li>Şimdi, bağırsak bölümünü aspire etmek için mikrokapiler pipeti kullanın ve kuyudan dışarı ve nükleik asit izolasyon reaktifi veya kit tarafından belirtilen izolasyon reaktifi içeren mikrosantrifüj tüpüne taşıyın. İzole bağırsakları buz üzerindeki reaktifte tutun ve kalan bağırsaklar için tekrarlayın. NOT: Gün boyunca nükleik asit izolasyon reaktifi veya kit tarafından belirtilen başka bir izolasyon reaktifi içeren mikrosantrifüj tüpüne çoklu bağırsaklar eklenebilir. Buz üzerinde tutun. Tüm bağırsaklar 1 günde izole edilemezse, zaten izole edilmiş ve bir nükleik asit izolasyon reaktifinde (nükleik asitleri koruyan) depolanmış olanlar, izolasyonlar devam edene ve / veya tamamlanana kadar -80 ° C'de tutulabilir. Burada, numuneler uzun vadede stabildir (yani, birkaç aydan 1 yıla kadar) ve nükleik asitleri izole etmeye hazır olana kadar kalabilir. Bağırsaklar suya veya herhangi bir kit-spesifik lizis tamponuna toplanabilir. Bununla birlikte, aşağı akış uygulamalarına geçmeden önce bağırsakların buz üzerindeki belirli bir tamponda (veya istenen diğer sıcaklıkta) ne kadar süre kalabileceğini belirlerken dikkate alınmalıdır.</li>
</ol>5. Disseke bağırsaklardan RNA izolasyonu
<ol><li>Nükleik asit izolasyon reaktifinde depolanan edinilmiş dokuları üç donma/çözülme/vorteks döngüsü gerçekleştirerek homojenize edin. Bunu yapmak için, 37 ° C'lik bir boncuk banyosu ve sıvı azot (veya diğer benzer araçlar) kullanın.</li>
	<li>Daha sonra, numuneye 0.2 hacim fenol:kloroform:IAA reaktifi ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) ve vortekse kısaca. Örneğin, 500 μL'lik bir başlangıç numunesi hacmi için, 0.2 hacim kloroform 100 μL olacaktır.</li>
	<li>Tüpü 20 saniye boyunca elle sallayın ve ardından oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Numune fazlarını santrifüjleme ile ayırın (10.000 x g, 18 dakika, 4 °C).</li>
	<li>Sulu fazı çıkarın ve nükleaz içermeyen yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NOT: Arabirimi aspire etmemeye veya rahatsız etmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Daha sonra, sulu faza eşit hacimde% 100 etanol ekleyin ve numuneyi 20 saniye boyunca elle sallayın.</li>
	<li>Numunenin 700 μL'sini spin kolonuna aktarın (bkz. Ardından, RNA'yı santrifüjleme ile sütuna yapıştırın (≥8.000 x g, 30 s, RT [oda sıcaklığı]). Akış akışını atın. Kalan ilave numuneler için bu işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>Numuneyi yıkamak için sütuna 350 μL RW1 tamponu ekleyin (bkz. Ardından, santrifüj yapın (≥8.000 x g, 30 s, RT) ve akışı atın.</li>
	<li>Kolon üzerinde DNA sindirimi gerçekleştirin. Örnek sütuna RDD tamponuna 80 μL DNaz I ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Ardından, RT'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ardından, numuneyi yıkamak için sütuna 350 μL RW1 tamponu ekleyin. Santrifüj (≥8.000 x g, 30 s, RT) ve sütunu yeni bir toplama tüpüne aktarın. Akış ve eski toplama tüpünü atın. Bu yıkama DNase'i temizler.</li>
	<li>Örnek sütuna 500 μL RPE ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Ardından, santrifüj (≥8.000 x g, 30 s, RT) ve akışı atın. İkinci bir yıkama için tekrarlayın.</li>
	<li>Daha sonra, kolon membranını daha da kurutmak için 1 dakika daha santrifüj yapın (≥8.000 x g, 1 dakika, RT). Ardından, numune kolonunu kapaklı taze nükleaz içermeyen bir mikrosantrifüj toplama tüpüne aktarın. Akış ve eski toplama tüpünü atın.</li>
	<li>14 μL nükleaz içermeyen suyu doğrudan numune kolonunun zarına ekleyin. Ardından, numuneyi RT'de 2 dakika inkübe edin. Daha sonra, RNA'yı etkisiz hale getirmek için santrifüj (≥8.000 x g, 1 dakika, RT).</li>
	<li>Numuneyi buz üzerinde saklayın. Daha sonra, ticari olarak temin edilebilen tahlil kitlerini kullanarak numunenin RNA kalitesini ve miktarını değerlendirin (bkz. İşiniz bittiğinde, numuneyi -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın. NOT: RNA genellikle -80 ° C'de bozulmadan 1 yıla kadar kararlıdır.</li>
</ol>

<ol><li>Riddel, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiddel%2C+DL+%22C.+elegans+II%22">C. elegans II</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1997).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).</li>
<li>Roy, P. J., Stuart, J. M., Lund, J., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+clustering+of+muscle-expressed+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromosomal clustering of muscle-expressed genes in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 418 (6901), 975-979 (2002).</li>
<li>Pauli, F., Liu, Y., Kim, Y. A., Chen, P. -J., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+clustering+and+GATA+transcriptional+regulation+of+intestine-expressed+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Chromosomal clustering and GATA transcriptional regulation of intestine-expressed genes in C. elegans.</a> Development. 133 (2), 287-295 (2005).</li>
<li>Spencer, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+and+temporal+map+of+C.+elegans+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A spatial and temporal map of C. elegans gene expression.</a> Genome Research. 21 (2), 325-341 (2011).</li>
<li>Spencer, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+specific+neurons+from+C.+elegans+larvae+for+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of specific neurons from C. elegans larvae for gene expression profiling.</a> PLoS One. 9 (11), 112102(2014).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+C.+elegans+muscle+transcriptome+using+trans-splicing-based+RNA+tagging+%28SRT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of C. elegans muscle transcriptome using trans-splicing-based RNA tagging (SRT).</a> Nucleic Acids Research. 44 (21), 156(2016).</li>
<li>Blazie, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+RNA-Seq+analysis+reveals+pervasive+tissue-specific+alternative+polyadenylation+in+Caenorhabditis+elegans+intestine+and+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles.</a> BMC Biology. 13 (1), 4(2015).</li>
<li>Blazie, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+directs+tissue-specific+miRNA+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+somatic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation directs tissue-specific miRNA targeting in Caenorhabditis elegans somatic tissues.</a> Genetics. 206 (2), 757-774 (2017).</li>
<li>Gómez-Saldivar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Tissue-specific+transcription+footprinting+using+RNA+PoI+DamID+%28RAPID%29+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">et al.Tissue-specific transcription footprinting using RNA PoI DamID (RAPID) in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 216 (4), 931-945 (2020).</li>
<li>Katsanos, D., Barkoulas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+DamID+in+C.+elegans+reveals+a+direct+role+for+LIN-22+and+NHR-25+in+antagonizing+the+epidermal+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Targeted DamID in C. elegans reveals a direct role for LIN-22 and NHR-25 in antagonizing the epidermal stem cell fate.</a> Science Advances. 8 (5), 3141(2022).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+adult+neuronal+IIS%2FFOXO+transcriptome+reveals+adult+phenotype+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators.</a> Nature. 529 (7584), 92-96 (2015).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).</li>
<li>Mathies, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+profiling+reveals+significant+transcriptional+differences+between+a+multipotent+progenitor+and+its+differentiated+sister%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">mRNA profiling reveals significant transcriptional differences between a multipotent progenitor and its differentiated sister.</a> BMC Genomics. 20 (1), 427(2019).</li>
<li>Liang, X., Calovich-Benne, C., Norris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron+transcriptomes+reveal+complex+neuron-specific+function+and+regulation+of+mec-2%2F+Stomatin+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron transcriptomes reveal complex neuron-specific function and regulation of mec-2/ Stomatin splicing.</a> Nucleic Acids Research. 50 (5), 2401-2416 (2021).</li>
<li>Glenwinkel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+analysis+of+the+transcriptional+regulatory+logic+of+neuronal+identity+specification+throughout+the+C.+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In silico analysis of the transcriptional regulatory logic of neuronal identity specification throughout the C. elegans nervous system.</a> eLife. 10, 64906(2021).</li>
<li>Taylor, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+topography+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular topography of an entire nervous system.</a> Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).</li>
<li>Charest, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+action+of+temporally+segregated+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial action of temporally segregated transcription factors.</a> Developmental Cell. 55 (4), 483-499 (2020).</li>
<li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Research. 22 (4), 766-777 (2012).</li>
<li>Tintori, S. C., Nishimura, E. O., Golden, P., Lieb, J. D., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+lineage+of+the+early+C.+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A transcriptional lineage of the early C. embryo.</a> Developmental Cell. 38 (4), 430-444 (2016).</li>
<li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq%3A+Single-cell+RNA-Seq+by+multiplexed+linear+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq: Single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li>
<li>Hashimshony, T., Feder, M., Levin, M., Hall, B. K., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+transcriptomics+reveals+the+evolutionary+history+of+the+endoderm+germ+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal transcriptomics reveals the evolutionary history of the endoderm germ layer.</a> Nature. 519 (7542), 219-222 (2015).</li>
<li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 365 (6459), 1971(2019).</li>
<li>Warner, A. D., Gevirtzman, L., Hillier, L. W., Ewing, B., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+embryonic+transcriptome+with+tissue%2C+time%2C+and+alternative+splicing+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The C. elegans embryonic transcriptome with tissue, time, and alternative splicing resolution.</a> Genome Research. 29 (6), 1036-1045 (2019).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li>
<li>Durham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+characterization+of+tissue-specific+chromatin+accessibility+in+L2+Caenorhabditis+elegans+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive characterization of tissue-specific chromatin accessibility in L2 Caenorhabditis elegans nematodes.</a> Genome Research. 31 (10), 1952-1969 (2021).</li>
<li>King, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+ELT-2+positively+and+negatively+impacts+direct+target+genes+to+modulate+the+Caenorhabditis+elegans+intestinal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The transcription factor ELT-2 positively and negatively impacts direct target genes to modulate the Caenorhabditis elegans intestinal transcriptome.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+analysis+in+the+C.+elegans+germline+with+the+thymidine+analog+EdU%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cell cycle analysis in the C. elegans germline with the thymidine analog EdU.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58339(2018).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-unsaturated+fatty+acids+link+H3K4me3+modifiers+to+C.+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan.</a> Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).</li>
<li>Edgar, L. G., Wolf, N., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+transcription+in+Caenorhabditis+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early transcription in Caenorhabditis elegans embryos.</a> Development. 120 (2), 443-451 (1994).</li>
<li>Edgar, L. G., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+manipulation+of+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Culture and manipulation of embryonic cells.</a> Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).</li>
<li>Nishimura, E. O., Zhang, J. C., Werts, A. D., Goldstein, B., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+transcript+discovery+by+RNA-seq+in+C.+elegans+blastomeres+identifies+neg-1%2C+a+gene+important+for+anterior+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Asymmetric transcript discovery by RNA-seq in C. elegans blastomeres identifies neg-1, a gene important for anterior morphogenesis.</a> PLoS Genetics. 11 (4), 1005117(2015).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+Synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+aggregation+of+%CE%B2-amyloid+peptide+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo aggregation of β-amyloid peptide variants.</a> Journal of Neurochemistry. 71 (4), 1616-1625 (1998).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormAtas+Hermaphrodite+Handbook+%E2%80%93+Introduction+to+C.+elegans+Anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22WormAtlas%22%5BJournal%5D)">WormAtas Hermaphrodite Handbook – Introduction to C. elegans Anatomy.</a> WormAtlas. , (2006).</li>
<li>Tan, M. -W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+Caenorhabditis+elegans+by+Pseudomonas+aeruginosa+used+to+model+mammalian+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 715-720 (1999).</li>
<li>Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22Sutter+Instrument+Company%22">Sutter Instrument Company</a>. , Novato, CA. https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2018).</li>
<li>Dineen, A., Nishimura, E. O., Goszczynski, B., Rothman, J. H., McGhee, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+transcription+factor+redundancy%3A+The+relative+roles+of+the+ELT-2+and+ELT-7+GATA+factors+in+the+C.+elegans+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitating transcription factor redundancy: The relative roles of the ELT-2 and ELT-7 GATA factors in the C. elegans endoderm.</a> Developmental Biology. 435 (2), 150-161 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu makalede, bağırsakların yetişkin C. elegans'tan elle diseke edilmesi için adım adım protokol açıklanmakta ve aşağı akış tahlilleri için saf preparatlar üretilmektedir. Bu protokoldeki kritik adımlar arasında (1) solucanların aşırı felç edilmemesini sağlamak, (2) doğru diseksiyon kesimleri yapmak, (3) diseksiyon için uygun boyutta mikro pipetler dövmek ve (4) son hasat sırasında sağlıklı bağırsakların hızlı bir şekilde iyileşmesini sağlamak yer almaktadır. Bu nedenlerden dolayı, solucanları levamisol çözeltisine maruz bırakırken dikkatli olunmalı ve maksimum keskinliği sağlamak için hipodermik iğnelerin sık sık yenilenmesi gerekir. Mikrokapiler pipet ve ağız aspiratörü kullanılarak bağırsağın elleçlenmesi de pratik yapacak bir diğer adımdır. Uygun boyutta düzgün bir şekilde dövülmüş mikro pipetler, mikro pipet içindeki bağırsakları kaybetme riskini azaltmanın yanı sıra, diseksiyonlar sırasında bağırsağın büyük bölümlerinin izole edilmesinde de önemli bir fark yaratır. Yeni protokol kullanıcıları, izolasyon reaktifine atılmadan önce mikrokapiler pipetin iç kenarındaki bağırsakları genellikle kaybederler. Bu sorun uygulama ve uygun şekilde dövülmüş mikrokapiler pipetlerle değiştirilebilir.
Burada açıklanan protokol yetişkin solucanlarda kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Ön denemeler, bu protokolün L4 solucanlarında ve yaşlı yetişkin solucanlarda kullanım için de etkili olduğunu desteklemektedir. Bununla birlikte, bu protokolün etkinliği henüz erken larva evre solucanlarda değerlendirilmemiştir. Bu yaklaşımın bir sınırlaması, ürettiği az miktarda malzemedir. Miktarlar RNA-seq ve PCR için yeterli olsa da, diğer tahliller için yeterli olmayabilir. Bu nedenle, kullanıcıların bir tahlil için gereken minimum girdinin bu protokolle fizibil olarak toplanıp toplanamayacağını belirlemeleri gerekir.
Laboratuvarımız rutin olarak izolasyon sonrası bağırsak hücrelerini arındırmak için FACS'ı kullanmaktadır 30, bağırsak hücresi tanımlaması için post-hoc analiz yöntemleri ve bu el diseksiyonu yöntemi30,42. El diseksiyonu, solucan ayrışması ve hücre izolasyonu daha az başarılı olduğunda yetişkin solucanlarda kullanım için uygun olma avantajına sahiptir. Ayrıca, el diseksiyonu preparatlarından ekstrakte edilen toplam RNA'nın etkinliği ve kalitesi yüksektir, çünkü muhtemelen dokular solucanlardan hızla koparılır ve daha sonra RNA bozulmasını azaltarak bir nükleik asit izolasyon reaktifinde hızlı bir şekilde biriktirilir. El diseksiyonu yönteminin bir diğer faydası da düşük maliyetli, kolay öğrenilebilir olması ve özel ekipman gerektirmemesidir. Son olarak, bu yaklaşım bağırsak bakterilerinin solucan bağırsaklarından toplanmasına ve izole edilmesine izin vererek aşağı akış mikrobiyom çalışmalarına olanak tanır.
Bağırsakları yetişkin C. elegans'tan izole etmek için burada açıklanan el diseksiyonu protokolü, C. elegans biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek için güçlü bir araçtır. Örneğin, bağırsakların saf bir şekilde hazırlanmasıyla, araştırmacılar bağışıklık, yaşlanma, metabolizma ve mikrobiyom arasındaki kesişimi araştırabilirler.

Sadece 959 hücreye ve 4 günlük yumurtadan yumurtaya yaşam döngüsüne sahip Caenorhabditis elegans nematod solucanı, birçok genetik, genomik ve gelişimsel çalışma için ideal bir model sistemidir 1,2. İleri ve geri genetik taramanın kolaylığı, mühendislik floresan belirteçlerinin yaygınlığı, nükleotidi spesifik genom düzenlemesi yapma kapasitesi ve topluluk çapında sayısız kaynak, C. elegans sistemindeki büyük keşiflere ve içgörülere katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, önemli bir dezavantaj, küçük, kırılgan ve birbirine bağlanabilen saf hücre, doku veya organ popülasyonları elde etmenin zorluğudur. RNA-seq, ChIP-seq ve ATAC-seq gibi genomik testler için saf hücre popülasyonları önemli olduğundan, C. elegans hücrelerinin, dokularının ve organlarının saf preparatlarını elde etmek için çeşitli yaklaşımlar ortaya çıkmıştır. Burada, bağırsakları, büyük bölümlerde, yetişkin C. elegans solucanlarından elle diseke etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Elde edilen preparatlar aşağı akış genomik testleri için uygundur (Şekil 1).
Burada açıklanan ince ölçekli doku diseksiyonu yöntemi (Şekil 2) sadece bir yaklaşımdır. Moleküler etiketleme, solucanları ayrıştırma ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ve post hoc analiz ile ilgilenen hücre tiplerini saflaştırma gibi diğer alternatif teknikler de C. elegans moleküler biyolojisinin dokuya özgü özelliklerini araştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Bununla birlikte, el diseksiyonunun bu diğer yaklaşımlara göre bir avantajı, C. elegans bağırsağının özelliklerini ve bakteri içeriğini aynı anda araştırmak için kullanılabilmesidir 3,4,5. Bu, 16S rRNA gen dizilimini mümkün kılar ve C. elegans sistemi içinde mikrobiyom çalışmalarını kolaylaştırır. Bununla birlikte, önemli bir sınırlama, bağırsak hücrelerinin ayrı ayrı izole edilmemesidir.
Moleküler etiketleme, yalnızca belirtilen doku veya ilgili hücreler içindeki moleküllere hücre tipine özgü bir etiket verir. Bu etiketler daha sonra toplam solucan preparatlarından izole edilebilir. Bu şekilde, etiketli bir poliA bağlayıcı protein veya eklenmiş lider kullanan dokuya özgü promotörler, dokuya özgü transkriptom profillemesini 6,7,8,9,10 ve 3'UTR haritalama 11,12'yi etkinleştirmiştir. Benzer şekilde, dokuya özgü transkripsiyon faktörü profilleri, promotöre özgü transkripsiyon faktörü varyantlarının etiketler veya enzim füzyonları13,14 ile eklendiği ChIP-seq ve DamID kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
FACS, ilgilenilen hücre tiplerini, içsel hücresel özelliklerine ve floresan özelliklerine dayanarak ayrışmış solucanlardan izole etmeyi sağlar. Bu yaklaşım, 8,15,16 ve bireysel nöronal hücre tipleri8,9,15,16,17,18 olmak üzere çeşitli organlardan dokuya özgü transkriptomlar üretmiş ve tüm C. elegans sinir sisteminin ekspresyon haritasını oluşturmak için kullanılmıştır 19,20 . FACS ve kuzeni floresan ile aktive edilen çekirdek sıralama (FANS), hücreye özgü kromatin profilleri21,22 oluşturmak için de kullanılmıştır.
Son olarak, post-hoc analiz, tek hücreli çözünürlük tahlillerinde gerçekleştirilebilir. Bu yöntemde, tüm bireysel hücreler incelenir, analiz aşamasında her birinin hücre tipi atfedilir ve ilgilenilen hücre tipleri daha fazla çalışma için seçici olarak filtrelenir. Post-hoc analiz, C. elegans embriyoları 23,24,25,26,27 ve L1 28 evre solucanlarında hem yüksek uzamsal hem de zamansal çözünürlüğe sahip gelişmekte olan hücrelerin transkriptomlarını elde etmek için başarıyla kullanılmıştır. Kromatin erişilebilirliği, benzer bir strateji29 kullanılarak RNA-seq yerine ATAC-seq kullanılarak da karakterize edilmiştir.
Her yaklaşımın avantajları ve sınırlamaları vardır. C. elegans bağırsağı için, bağırsak hücrelerinin solucan ayrışması ve FACS izolasyonu, embriyo ve larva evreleri30'da elde edilebilir, ancak yetişkinlerde zordur. Bunun, bağırsağın büyük, endo-reporte edilmiş ve güçlü bir şekilde yapışan hücrelerinden kaynaklandığı düşünülmektedir ve bu da onları hasarsız olarak ayrıştırmayı zorlaştırmaktadır. Burada açıklanan el diseksiyonu yöntemi, yetişkin solucanın bağırsağının büyük bölümlerinin izole edilmesine izin vererek bu zorlukları aşar. Aynı aşamadan gonadların elle diseksiyonu uygulaması yaygın ve basittir. Bağırsak diseksiyonu gonad diseksiyonuna benzer, ancak daha az sıklıkla yapılır32. Burada sunulan protokol, Dr. James McGhee ve Barb Goszczynski tarafından geliştirilen daha uzun, yayınlanmamış bir protokolden uyarlanmıştır. Bu kolaylaştırılmış protokol, blastomerleri erken evre embriyolardan izole etmek için teknikler ödünç alır 23,33,34,35. C. elegans'ta çoğu hücre veya doku tipini izole etmek için el diseksiyonu mümkün olmasa da, bağırsakları yetişkin solucanlardan izole etmek için idealdir. Bu nedenle, el diseksiyonu, bağırsağa özgü hücre preparatları elde etmek için diğer araçları tamamlar.

<table><tbody><tr><td>Asetillenmiş Sığır Serum Albümini (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-420</td><td>Nükleaz içermeyen</td></tr><tr><td>BSA CL2122 solucan suşu</td><td>CGC (Caenorhabditis Genetik Merkezi)</td><td>CL2122</td><td>dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vektör) + (pCL26) mtl-2::GFP]. CL2120 için kontrol gerilimi. Fenotip görünüşe göre WT.</td></tr><tr><td>Yumurta Tuzları yapmak için gerekli</td> <td>Kalsiyum Klorür Dihidrat</td><td>Fisher</td><td>C79</td></tr><tr><td>50 mL Santrifüj Tüpleri, Dökme</td><td>Olympus Plastikler</td><td>28-108</td><td>Çözelti yapımı için nükleaz içermeyen konik tüp gereklidir.</td></tr><tr><td>15 mL Santrifüj Tüpleri, Dökme</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-103</td><td>Çözelti yapımı için nükleaz içermeyen konik tüp gereklidir.</td></tr><tr><td>İçbükeylik lam (2 kuyulu)</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>71878-08</td><td>12 pk 2 oyuklu içbükey slaytlar</td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis (2-amino-etileter) -N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA)</td> <td>Şelasyon tamponu yapmak için gerekli</td>olan <td>Millipore Sigma</td><td>E3889</td></tr><tr><td>Floresan Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Leica</td><td>M205 FCA</td><td>Bu, el diseksiyonları sırasında kullanıcılara yardımcı olmak için floresan C. elegans suşları ile kullanılabilen isteğe bağlı bir ekipman parçasıdır</td></tr><tr><td>N- (2-Hidroksietil) piperazin-N ve prime; - (2-etansülfonik asit), 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>H4034</td><td>diseksiyon tamponu yapmak için gereklidir</td></tr><tr>Yüksek<td>Hassasiyetli RNA ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5579</td><td>toplam RNA kalitesinin değerlendirilmesi için gereklidir ve Toplam</td></tr><tr><td>RNA kalitesi ve miktarının değerlendirilmesi için</td>miktar<td>Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTape Merdiveni</td><td>Agilent</td><td>5067-5581</td> Toplam RNA</tr><tr><td>kalitesi ve miktarının değerlendirilmesi için</td><td>Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTape Numune Tamponu</td><td>Agilent</td><td>5067-5580</td></tr><tr><td>HostZERO Mikrobiyal DNA Kiti</td><td>Zymo Research</td><td>D4310</td><td>Solucan bağırsaklarından/solucanlarından mikrobiyal DNA'nın izolasyonu</td></tr><tr><td>Hipodermik İğne (27G x 1/2 ")</td><td>BD</td><td>Bağırsakların el diseksiyonu için gerekli</td><td>bilimsel 305109</td></tr><tr><td>Levamizol (diğer adıyla (-) - Tetramizol hidroklorür)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>L9756</td>, <td>bağırsakların elle diseksiyonundan önce solucanları geçici olarak felç etmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Luer-Lok Genel Kullanım Tek Kullanımlık Şırınga (1 mL)</td><td>BD Scientific</td><td>309628</td><td>İsteğe Bağlı. Hipodermik iğneyi sabitlemek için kullanılabilir, bu da diseksiyon sırasında iğnenin daha kolay manipüle edilmesini sağlar. Pistonu çıkarın.</td></tr><tr><td>Yumurta Tuzları yapmak için gerekli</td>olan <td>Magnezyum Klorür Heksahidrat</td><td>Fisher</td><td>M33</td></tr><tr><td>M9 tamponu yapmak için gerekli</td><td>Magnezyum Sülfat Hpetahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-500G</td></tr><tr><td>MF-900 Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Mikrokılcal pipetleri dövmek için kullanılır. Tritech Research aracılığıyla edinilebilir.</td></tr><tr><td>1,7 mL Mikrotüpler, Şeffaf</td><td>Olympus Plastics</td><td>22-282</td><td>Çözelti yapımı ve numune saklama için gerekli nükleaz içermeyen mikrofüj tüpü.</td></tr><tr><td>Ağız Aspiratör Tüpü</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5177</td><td>Ağız aspiratör tüpü, diseke edilmiş bağırsakların aspirasyonuna izin vermek için mikrokapiller pipet ile kombinasyon halinde gereklidir.</td></tr><tr><td>16S Pan-Bakteriyel Kontrol TaqMan Testi</td><td>Thermo Fisher</td><td>A50137</td><td>Test Kimliği: Ba04930791_s1. qPCR ile bağırsak mikrobiyal tespiti için kullanılan test.</td></tr><tr><td>P-1000 Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Aletleri</td><td>Model P-1000</td><td>Dövmeden önce mikrokılcal pippetleri çekmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Petri Kabı (35 x 10 mm)</td><td>Genesee Scientific - Olympus Plastics</td><td>32-103</td><td>Diseksiyondan önce solucanları yıkamak için M9 banyosu ve Dissekiton Tampon banyosu yapmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Fenol: Kloroform: IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9730</td><td>Toplam RNA'nın izolasyonunda kullanılır</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Kırlangıç Sigma</td><td>529552</td><td>Yumurta Tuzları yapmak için gereklidir</td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td>M9 tamponu yapmak için gerekli</td></tr><tr><td>Qubit 3 Florometre</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>Qubit RNA HS Test Kitine eşlik eder. Agilent ScreenTape üzerinde numune çalıştırmadan önce RNA'yı ölçmek için kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q32852</td><td>Agilent ScreenTape'te numune çalıştırmadan önce RNA'yı ölçmek için kullanılabilir.</td></tr><tr><td>RNasin Ribonükleaz İnhibitörü</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td>Ortak ökaryotik Rnazların geniş spektrumlu inhibisyonu</td></tr><tr><td>RNaz İçermeyen DNaz Seti</td><td>Qiagen</td><td>79254</td>, <td>RNA izolasyon protokolü sırasında kolon üzerinde DNA sindirimi için kullanılır.</td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Solucan bağırsaklarından/solucanlardan toplam RNA'nın izolasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Standart Cam Kılcal Damarlar</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>4 in OD 1.2 mm standart borosilikat cam kılcal damarlar diseksiyon için mikrokılcal pipetler</td></tr><tr>yapmak için kullanılır<td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td>Yumurta Tuzları yapmak için gerekli</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik heptahidrat</td><td>M9 tamponu yapmak için</td>gerekli olan <td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td></tr><tr><td>Şırınga filtresi (0,2 mikrometre SCFA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>72302520</td><td>Ağız pipetlemesi sırasında ağız aspiratörü tüpü ile kullanım için isteğe bağlıdır.</td></tr><tr><td>4150 TapeStation Sistemi</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td>, <td>RNA kalitesini ve miktarını değerlendirmek için RNA ScreenTape reaktiflerine eşlik eder</td></tr><tr><td>TaqPath BactoPure Mikrobiyal Tespit Master Karışımı</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>qPCR</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td> için kullanılan A52699 ana karışım <td>Nükleik asit izolasyonu ve korunması. Tercih edilirse QIAzol (Qiagen; 79306) ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>Solucan Kazması</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Evde bir pastör pipeti ve bir platin telden yapılmıştır. Ayrıntılar için solucan kitabına bakın.</td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans bağırsaklarının el diseksiyonu

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

Sadece 20 hücreden oluşan Caenorhabditis elegans bağırsağı , sindirim, metabolizma, yaşlanma, bağışıklık ve çevresel tepki dahil olmak üzere yaşamı destekleyen birçok fonksiyonun bağlantı noktasıdır. C. elegans konağı ve çevresi arasındaki kritik etkileşimler, bağırsak mikrobiyotasının yoğunlaştığı bağırsakta birleşir. Bu nedenle, bağırsak dokusunu solucanın geri kalanından uzaklaştırma yeteneği, bağırsağa özgü süreçleri değerlendirmek için gereklidir. Bu protokol, yetişkin C. elegans bağırsaklarını elle diseke etmek için bir yöntemi açıklar. Prosedür, kolaylık veya eğitim amacıyla floresan etiketli suşlarda gerçekleştirilebilir. Teknik mükemmelleştirildikten sonra, bağırsaklar herhangi bir genotipteki etiketsiz solucanlardan toplanabilir. Bu mikrodiseksiyon yaklaşımı, konakçı bağırsak dokusunun ve bağırsak mikrobiyotasının eşzamanlı olarak yakalanmasını sağlar, bu da birçok mikrobiyom çalışmasına fayda sağlar. Bu nedenle, bu protokol tarafından üretilen bağırsak preparatları için aşağı akış uygulamaları, bağırsak hücrelerinden RNA izolasyonunu ve yakalanan mikrobiyotadan DNA izolasyonunu içerebilir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Genel olarak, C. elegans bağırsaklarının el diseksiyonu, bağırsak biyolojisinin kritik yönlerini araştırmak için basit ve sağlam bir yöntem sağlar.

Bu protokol, bağırsağın büyük bölümlerini erişkin C. elegans'tan elle izole etmek için kullanıldı (Şekil 2). Gösterilen her deney grubu için son bağırsak örneği, anterior-orta ve orta-posterior bağırsak kesitlerinin eşit bir koleksiyonundan oluşur. Bununla birlikte, deneysel soruya bağlı olarak, sadece ön, orta veya arka bağırsak bölümlerinin bir koleksiyonunu da içerebilir. Toplu olarak, bu protokol için üç temsili sonuç sunulmaktadır. Birincisi, bağırsakların başarılı diseksiyonunu ve izolasyonunu göstermektedir (Şekil 6). İkincisi, izole bağırsaklardan RNA izolasyonunun sonuçlarını bildirmektedir (Şekil 7). Üçüncüsü, izole bağırsaklardan mikrobiyal sürveyansın sonuçlarını göstermektedir (Şekil 8).
İlk sonuç için, Şekil 6A, yetişkin CL2122 solucanları içindeki Şekil 5A'daki "a" bölgesinde birincil bir kesi yaptıktan sonra ekstrüde bir bağırsağın nasıl göründüğünü göstermektedir. CL2122 solucanları, GFP'ye (mtl-2 p::GFP) kaynaşmış bağırsağa özgü mtl-2 promotörünü barındırdığından, izole bağırsaklar floresan diseksiyon kapsamı altında yeşil renkte parlar. Bir bağırsak segmentinin başarılı diseksiyonu daha sonra Şekil 6B'de gösterilmiştir. Bu bağırsak bölümü, gonad veya karkastan gelen döküntüler gibi görünür kirleticilerden arındırılmıştır. Buna karşılık, Şekil 6C, gonad ve karkas hala bağırsak segmentine gözle görülür şekilde bağlı olduğu için başarılı bir şekilde diseke edilmemiş bağırsakları göstermektedir.
İkinci sonuç için, bağırsaklar bir nükleik asit izolasyon reaktifine toplandı ve ertesi gün düşük girişli toplam RNA ekstraksiyon protokolü kullanılarak işlendi (bkz. Anterior-orta ve orta-posterior kesitlerden 60 toplam bağırsak kesitinin son bir bağırsak örneği, kabaca 15 ng yüksek kaliteli toplam RNA verir (Şekil 7A). Bu miktarda toplam bağırsak tek bir günde kolayca elde edilebilir, ancak gerekirse birkaç gün içinde parçalanabilir. El diseksiyonundan elde edilen RNA verimleri, solucan ayrışmasından ve bağırsak hücrelerinin FACS izolasyonundan daha verimlidir, çünkü toplam RNA'nın orantılı miktarlarını elde etmek için yüz binlerce bağırsak hücresi gereklidir (Şekil 7B). Önemli olarak, el diseksiyonu ile üretilen RNA verimleri, 2 pg RNA kadar az alabilen ticari RNA-seq kütüphane kitleri (yani, NEBNext Ultra II ve NEBNext Tek Hücre / Düşük Giriş) için girdi olarak fazlasıyla yeterlidir.
Üçüncü sonuç için, bağırsaklar steril ddH20'a toplandı ve aynı gün ticari bir mikrobiyal DNA izolasyon kiti kullanılarak işlendi (bkz. Anterior-orta ve orta-posterior kesitlerden 40 toplam bağırsak kesitinin son bir bağırsak örneği, bir pan-bakteriyel tespit testi kullanılarak yaklaşık 0.009 pg toplam mikrobiyal DNA verir (bkz. Bu miktarlar geleneksel niceleme yöntemleri için çok düşüktür ve qPCR standart eğrilerinden tahmin edilmelidir. İdeal olarak, kullanıcılar nihai bir toplam bağırsak miktarını &gt;40 hedeflemelidir, çünkü bu, reaktif kontaminasyon seviyeleri ile ilgili sinyal-gürültü algılama sınırını ve sınırını arttırır.
Deneysel tasarım göz önüne alındığında, uygun kontrol numunelerinin toplanması her zaman gereklidir. Transkriptomik deneyler için, uygun bir deneysel kontrol, bağırsaklarla aynı şekilde toplanan tüm solucanın preparatlarını içerebilir. Bununla birlikte, bağırsakların C. elegans'tan diseksiyonu ve izolasyonu sırasında, bağırsak bölümlerine yapışan karkas ve gonad parçalarını görmek yaygındır. İdeal olarak bu kirletici dokular, aşağı akış kullanımı için depolanmadan önce bağırsaklardan çıkarılacak olsa da, ek deneysel kontroller, bağırsak diseksiyonu sonrası kalan solucan karkaslarının toplanmasını ve / veya disseke edilmiş gonadların toplanmasını içerebilir. Mikrobiyom deneyleri için kontroller, geleneksel pozitif (bakteri kültürü) ve negatif (su) kontrollere ek olarak, bağırsaklarla aynı şekilde toplanan tüm solucanın preparatlarını da içerebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig01.jpg"> Şekil 1: Çok çeşitli aşağı akış omik testlerinde kullanılmak üzere dokuya özgü preparatlar üretmek için kullanılan yetişkin C. elegans'tan bağırsakların elle diseksiyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig02.jpg"> Şekil 2: El diseksiyon protokolü şeması. Bu protokol, bağırsağın büyük bölümlerini yetişkin C. elegans'tan elle izole etmek için kullanıldı. Bağırsaklar farklı aşağı akış tahlilleri için izole edilebilir. Burada RNA izolasyonu ve mikrobiyal DNA izolasyonu için bağırsakların kullanımı gösterilmektedir. BioRender.com ile oluşturulan görüntü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig03.jpg"> Şekil 3: Mikrokapiler pipet üretimi. (A) Yeni çekilmiş ancak dövülmemiş bir mikrokapiler pipet, bir mikrodemirin oküler parçasından gösterilir. Oküler cetvel, 50 μm boyutundaki mikrokapiler pipetleri tahmini üç kene işaretinin iç çapına (gösterilmiştir, okla gösterilir) ölçmek için kullanılır. (B) Dövülmemiş, 50 μm ve 100 μm mikrokapiler pipetler, diseksiyon kapsamı altında, 1 div = 0,1 mm'lik bir kalibrasyon cetvelinin yanında gösterilir. (C) (B)'den gelen 50 μm ve 100 μm mikrokapiler pipetler tekrar ancak farklı bir bakış açısından gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig04.jpg"> Şekil 4: RNA verimini artırmak için el diseksiyonu sırasında şelasyon tamponunun (CB) kullanımı. Düşük girişli toplam RNA ekstraksiyon protokolü, adlandırılmış dokulardan RNA preparatları üretti. İzole edilmiş toplam RNA kalitesini (RIN, RNA bütünlük numarası) ve miktarını karakterize eden temsili jel elektroforez çalışmaları gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig05.jpg"> Şekil 5: El diseksiyon adımları. (A) Protokolde açıklanan diseksiyon adımları burada özetlenmiştir. (1)'de, solucanın bağırsağı GFP floresansı ile görselleştirilir. Birincil kesi bölgesi, bağırsağın tüm uzunluğu boyunca eşit kapsama alanı sağlamak için solucanlar arasında eşit olarak dağıtılabilir. Alternatif olarak, anterior-orta veya orta-posterior intestinal fragmana özgü bir preparat elde etmek için "a" veya "b" primer insizyon bölgeleri seçilebilir. (2)'de, bağırsak ekstrüde olmuş ve bir döngü şekli almıştır. (3)'te, bağırsak ilk önce karkas ve gonaddan kurtulmaya çalışırken solucan gövdesinden kesilir. Bağırsak daha sonra çıkarılamayan kalan karkas veya gonaddan çıkarılır. (4)'te, bağırsağın temizlenmiş bir bölümü izole edilir ve depolamaya hazırdır. (B) Kritik bir adım, yapışan kalıntıları (yani gonad, karkas) ağız aspiratörünün sonunda bulunan mikrokapiller pipetin içine ve dışına geçirerek bağırsaktan çıkarmaktır. Ölçek çubukları = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig06.jpg"> Şekil 6: El diseksiyonu adımlarının temsili sonuçları. (A) bağırsağın solucandan ekstrüzyonunu gösteren temsili bir görüntü. Bunlar, bağırsak hücresine özgü mtl-2 promotörü altında GFP'yi eksprese eden CL2122 genotipinin solucanlarıdır. İki temsili görüntü, (B) bağırsağın temizlenmiş ve tamamen izole edilmiş bir bölümünü ve (C) kirletici gonad ve karkas dokuları olan izole bir bağırsağı göstermektedir. Ölçek çubukları = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig07.jpg"> Şekil 7: İzole bağırsaklardan toplam RNA ekstraksiyonunun temsili sonuçları. (A) İzole edilmiş toplam RNA'ların kalitesini (RIN'ler, RNA bütünlük numarası) ve miktarını karakterize eden agaroz jel elektroforezi ile çözülen RNA preparatlarının temsili bir görüntüsü gösterilmiştir. (B) Karşılaştırma için, L1 evre solucanlarından floresan aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) yoluyla toplanan bağırsak hücrelerinden izole edilen toplam RNA'nın temsili bir jeli gösterilmiştir. Bağırsak başına 20 hücrede, el diseksiyon yönteminin bağırsak başına FACS-saflaştırılmış bağırsak hücrelerinden daha fazla toplam RNA verdiği sonucuna varılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig07large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64120/64120fig08.jpg"> Şekil 8: İzole bağırsaklardan toplam mikrobiyal DNA ekstraksiyonu için temsili sonuçlar. Ticari bir mikrobiyal DNA izolasyon kiti, bağırsaklardan, bütün solucanlardan ve kontrollerden DNA preparatları üretti. Örneklerdeki bakteri sayısını ölçmek için bir pan-bakteriyel gen testi kullanıldı. (A) üretilen qPCR amplifikasyon eğrilerinin, (B) numuneleri ölçmek için kullanılan E. coli OP50 standart eğrisinin ve (C) numunelerin temsili bir görüntüsü. (B)'de, E. coli standartlarının log başlangıç konsantrasyonları CT değerlerine göre grafiklendirilir. (C)'de, 40 bütün solucanın iki replikası (tekrarı) medial olarak kesildi ve mikrobiyal gDNA izolasyonu için 40 izole bağırsak bölümü işlendi. qPCR çalıştırmasındaki No-Template-Control (NTC) de gösterilir. Y ekseni, örnek CT değerlerini temsil eder. PCR'lerden ölçülen DNA miktarı, örnek çubukların üzerindeki toplam pikogram (pg) değerleri olarak gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120fig08large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan tampon ve çözeltilerin bileşimleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64120/64120_Table%201.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Mevcut protokol, genomik, proteomik, mikrobiyom veya diğer tahlillere giriş için bağırsakları yetişkin Caenorhabditis elegans nematod solucanlarından elle izole etmek için bir prosedürü açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarının El Diseksiyonu

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, ...

Bu elegan'ın bağırsağının el diseksiyonu, hücreye özgü popülasyonlarda dokuyu izole ederek post biyolojinin çeşitli yönlerinin araştırılmasını sağlayan güçlü ama basit bir tekniktir. Bu ince ölçekli doku diseksiyon tekniğinin uygulanması kolaydır ve standart laboratuvar ekipmanlarını kullanır, bu da onu birçok kişi için sağlam ve erişilebilir bir yöntem haline getirir. 4 inç uzunluğunda ve 1,2 milimetre dış çaplı standart cam kılcal damarı bir iğne çektirme makinesi kullanarak enjeksiyon iğnesi şekline çekerek başlayın.En az 5 adet 50 ve 100 mikrometre mikro kılcal pipet hazırlayın. Mikro kılcal pipetleri, 5X objektif lensin altındaki mikro dövme oküler cetvel tarafından belirtildiği gibi sırasıyla 3 veya 5 onay işaretini işaretleyerek 50 mikrometre veya 100 mikrometreye dövmek için bir mikro dövme makinesi kullanın. Daha sonra ağız aspiratör tüpüne mikro kılcal bir pipet yapıştırın.35 milimetre çapında steril Petri kabına 2 mililitre M9 ve diğer 35 milimetre çaplı steril Petri kabına 2 mililitre diseksiyon tamponu ekleyerek bir M9 banyosu ve bir diseksiyon tampon banyosu hazırlayın. Son olarak, her banyoya 100 mikrolitre çalışan sığır serum albümini veya BSA çözeltisi ekleyin ve döndürerek karıştırın. Diseksiyon dizisini hazırlamak için, iki kuyu konkavite sürgüsünün ilk kuyucuğuna 150 mikrolitre çalışma levamisol çözeltisi ve ikinci kuyucuğa 150 mikrolitre diseksiyon tamponu ekleyin.Her bir kuyucuğa 20 mikrolitre çalışan BSA çözeltisi ekleyin. Caenorhabditis elegans CL2122 solucan bağırsağını elle incelemek için, 20 yetişkin solucanı nematod büyüme ortamından veya NGM plakasından bir solucan toplama kullanarak M9 banyosuna taşıyın. Ardından 20 solucanın tümünü M9 banyosundan diseksiyon tampon banyosuna taşıyın.Daha sonra 10 solucan partilerini diseksiyon tampon banyosundan levamisol çözeltisi içeren kuyuya taşıyın. Solucan hareketi yavaşladığında, onları levamisol kuyucuğundan diseksiyon tamponunu içeren kuyuya hızla hareket ettirin. Diseksiyona başlamadan önce solucanların diseksiyon tamponunda biraz hareket etmeye başlamasına izin verin.Bir floresan diseksiyon kapsamı altında, bağırsağın eşit sayıda ön orta yarı ve orta arka yarım bölümünü üretmek için hipodermik bir iğne kullanarak farenksin hemen arkasında veya rektumun önünde bir kesim yapın. Bağırsakların vücuttan maksimum ekstrüzyon yapması için yaklaşık bir dakika beklerken, RNA bozulmasını azaltmaya yardımcı olmak için kuyucuğa 50 mikrolitre şelatasyon tamponu ekleyin. Bağırsak ekstrüzyonunu kolaylaştırmak için ağız aspiratörüne bağlı 100 mikrometre mikro kılcal pipeti kullanın ve solucanı pipetin içine ve dışına çekin.Bir bağırsak yeterince ekstrüde edildikten sonra, vücudun geri kalanından ve kalan gonaddan kesmek için 27 gauge hipodermik iğneyi kullanın. Mikro kılcal pipeti kullanarak bağırsak bölümünü aspire edin ve nükleik asit izolasyon reaktifi içeren mikro santrifüj tüpüne aktarın. İzole bağırsakları buz üzerinde tutun ve kalan bağırsaklar için prosedürü tekrarlayın.Bu yöntemle bağırsakların başarılı diseksiyonu ve izolasyonu gösterilmiştir. Yöntem ayrıca izole bağırsaklardan RNA izolasyonu ve mikrobiyal sürveyans bildirdi. CL2122 solucanları, GFP'ye kaynaşmış bağırsağa özgü metal iki promotörü barındırdığından, bağırsak, floresan diseksiyon kapsamı altında yeşil bir parıltı olarak gözlendi.Yetişkin solucanın diseksiyonu, farenksin hemen arkasında birincil bir kesi yapıldıktan sonra ekstrüde bir bağırsak gösterdi. Bir bağırsak segmentinin başarılı diseksiyonu, gonad veya karkastan gelen döküntüler gibi görünür kirleticilerden arındırılmış olarak ortaya çıktı. Buna karşılık, başarısız diseksiyon, bağırsak segmentine bağlı gonad ve karkası gösterdi.El diseksiyonundan elde edilen RNA verimleri daha verimliydi, çünkü 60 toplam bağırsak kesitinin son örneği kabaca 15 nanogram yüksek kaliteli toplam RNA verdi. Bağırsak hücrelerinin solucan ayrışması ve FACS izolasyonu daha az verimliydi, çünkü bunlar orantılı miktarlarda toplam RNA elde etmek için yüz binlerce bağırsak hücresi gerektiriyordu. Bir pan-bakteriyel tespit testi kullanılarak yapılan toplam mikrobiyal genomik DNA amplifikasyonu, ön, orta ve orta arka bölgelerden 40 toplam bağırsak kesitinin son örneğinin, toplam mikrobiyal DNA'nın yaklaşık 0.009 pikogramının düşük ancak tespit edilebilir miktarını verdiğini göstermiştir.Bu prosedürü uygularken hatırlanması gereken en önemli şey, diseksiyondan önce solucanları aşırı felç etmemektir, çünkü bu maksimum bağırsak ekstrüzyonunu engelleyebilir.

hand-dissection-of-caenorhabditis-elegans-intestines

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz canlı manikür görselleştirmek için bir yöntem...

Görselleştirme Caenorhabditis Elegans Tırnak Yapıları Lipofilik Vital Boya, DII

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Bu videoda, yetişkin C. elegans hermafroditlerinden gonadları incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır, bu da immün boyama ve floresan görüntüleme için uygun dokularla sonuçlanır.

C. elegans Gonad Ekstrüzyonu: Hızlı Bir Diseksiyon Tekniği

Kaynak: Morgan, E. ve diğerleri. Bağırsak mikrobiyomu bakterilerini zenginleştirmek amacıyla yabani caenorhabditis nematodlarının seçici temizlenmesi. J. Vis. Exp. (2021)Bu video, yabani Caenorhabditis solucanlarından ilgilenen bağırsak bakterilerinin izole edilmesi için bir protokolü göstermektedir. Solucanlar önce açlıktan kurtulup yıkanarak yüzeylerinden ve bağırsak lümenlerinden kalan besleyici bakterileri yok ederken, hedef mikropları korur. Yüzey temizliği ve birden fazla sürünme...

Bağırsak mikrobiyotasının zenginlenmesi için Caenorhabditis solucanlarının seçici temizlenmesi

Çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöral tepe hücre göçü potansiyelinin hassas miktar tayinine izin veren bir ex vivo hücre göçü deneyi mevcut.

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

Saydam C. elegans bağırsak "sırasında çok hücreli tubulogenesis apicobasal membran ve Lümen Biyogenez tek hücre ve hücre altı düzeyde çalışmak için birvivo içinde doku odası" olarak hizmet edebilir. Bu protokolü nasıl standart etiketleme birleştirmek için işlev kaybı genetik/RNAi ve moleküler düzeyde bu işlemleri incelemek için mikroskobik yaklaşımları açıklar.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Biz üç boyutlu Caenorhabditis elegans germline. inşası için otomatik yöntemi mevcut Bizim yöntem sayısını ve her çekirdek germline ve analizleri germline protein dağıtım ve hücre iskeleti yapısı içindeki konumunu belirler.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

Yabani Caenorhabditis nematodları, genellikle bağırsak lümeninde veya bağırsağı enfekte eden birçok mikropla ilişkilidir. Bu protokol, dauer lütikülün direncinden yararlanarak bağırsağı kolonlaştıran kültürsüz mikropları zenginleştirmek için bir yöntemi detaylandırıyor.

Bağırsak Mikrobiyom Bakterileri İçin Zenginleştirmek için Yabani Caenorhabditis Nematodlarının Seçici Temizliği

Hücre dışı bakteriler ve Orsay virüsü ve mikrosporidia (mantarlar) gibi hücre içi patojenler de dahil olmak üzere bağırsak mikropları genellikle vahşi Caenorhabditis nematodları ile ilişkilidir. Bu makalede, C. elegans nematodlarını kolonize eden ve/veya enfekte eden mikropların tespiti ve nicelleştirilmesi ve laboratuvarda kontrollü enfeksiyonlardan sonra patojen yükünün ölçülmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

Bu, C. elegans gonad diseksiyonu ve ardından antikor boyama yoluyla immünofloresan için germline örnekleri üreten donma çatlağı veya DNA'yı görselleştirmek için basit DAPI boyama için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu protokol, bir araştırma laboratuvarında ve ders tabanlı bir lisans araştırma deneyiminde lisans öğrencileri için başarılı olmuştur.

C. elegans · İmmünofloresan ve DAPI Boyama için Gonad Diseksiyonu ve Dondurucu Çatlak

Caenorhabditis elegans , biyolojideki ana model türlerden biridir, ancak neredeyse tüm araştırmalar doğal olarak ilişkili mikroplarının yokluğunda gerçekleştirilir. Burada açıklanan yöntemler, gelecekteki fonksiyonel C. elegans araştırmalarının temeli olarak ilişkili mikropların çeşitliliği hakkındaki anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olacaktır.

Model Nematod Caenorhabditis elegans'ın Doğal Mikrobiyotasının İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Öğrenin Caenorhabditis elegans bağırsaklarının el diseksiyonu tekniğini genomik ve proteomik analizler için. Bu yöntem, yüksek kaliteli RNA elde ederek hücreye özgü popülasyonları incelemeyi sağlar.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarının El Diseksiyonu

Daha fazla video keşfet