Name: Enfeksiyöz ve Enfeksiyöz Olmayan Virüsleri Ayırt Etmek için Aptamerlerin İn Vitro Seçimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Öğrenin enfeksiyöz ve enfeksiyöz olmayan virüsleri ayırt eden DNA aptamerlerinin in vitro seçim yöntemini. Bu biyoteknik protokol, klinik tanı ve çevresel izleme için duyar sensörler geliştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokolde kullanılan psödovirüs örneklerini (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1) sağladıkları için Chicago'daki Illinois Üniversitesi'nden Bayan Laura M. Cooper ve Dr. Lijun Rong'a ve ayrıca Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi'ndeki Roy J. Carver Biyoteknoloji Merkezi'nin DNA Hizmetleri tesisinden Dr. Alvaro Hernandez ve Dr. Chris Wright'a yüksek verimli dizileme konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. ve in vitro seleksiyon ve aptamer karakterizasyon tekniklerinde bize yardımcı olan Lu grubunun birçok üyesi. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı'ndan (CBET 20-29215) bir RAPID hibesi ve Urbana-Champaign ve Illinois-JITRI Enstitüsü'ndeki Illinois Üniversitesi Sürdürülebilirlik, Enerji ve Çevre Enstitüsü'nden (JITRI 23965) bir tohum hibesi ile desteklenmiştir. A.S.P., finansal desteği için PEW Latin Amerika Bursu'na teşekkür eder. Ayrıca, Austin'deki Teksas Üniversitesi'ndeki Lu grubu araştırma programına destek için Robert A. Welch Vakfı'na (Grant F-0020) teşekkür ederiz.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

SELEX, sadece pM-nM 22,43,44,45 aralığında yüksek afiniteli aptamerlerin tanımlanmasına değil, aynı zamanda yüksek ve ayarlanabilir seçiciliğe sahip aptamerlerin tanımlanmasına da izin verir. Sayaç seçiminden yararlanılarak, zorlu seçiciliğe sahip aptamerler elde edilebilir. Örneğin, Li grubu, patojenik bakteri suşlarını patojenik olmayan suşlardan ayırt edebilen diziler elde etme yeteneğini g...

Virüs enfeksiyonlarının, son COVID-19 pandemisinden itibaren giderek daha belirgin hale geldiği gibi, dünya çapında muazzam ekonomik ve toplumsal etkileri vardır. Zamanında ve doğru tanı, virüslerin sağlıklı insanlara yayılmasını önlerken viral enfeksiyonların tedavisinde çok önemlidir. PCR testleri 1,2 ve inmunoassay3 gibi birçok virüs tespit yöntemi geliştirilmiş olsa da, şu anda kullanılan yöntemlerin çoğu, tespit edilen virüsün gerçekten bulaşıcı olup olmadığını belirleyememektedir. Bunun nedeni, viral nükleik asit veya proteinler gibi tek başına virüsün bileşenlerinin varlığının, sağlam, bulaşıcı virüsün mevcut olduğunu göstermemesi ve bu biyobelirteçlerin seviyelerinin bulaşıcılıkile zayıf korelasyon göstermesidir 4,5,6. Örneğin, mevcut PCR tabanlı COVID-19 testleri için yaygın olarak kullanılan viral RNA, hasta bulaşıcı olduğunda enfeksiyonun erken evrelerinde çok düşük seviyelere sahipken, hastalar enfeksiyondan iyileştiğinde ve artık bulaşıcı olmadığında RNA seviyesi genellikle hala çok yüksektir 7,8. Viral protein veya antijen biyobelirteçleri benzer bir eğilimi takip eder, ancak tipik olarak viral RNA'dan daha sonra ortaya çıkar ve bu nedenle bulaşıcılığın daha az öngörücüsüdür 6,9. Bu sınırlamayı ele almak için, virüsün bulaşıcılık durumu hakkında bilgi verebilecek bazı yöntemler geliştirilmiştir, ancak sonuç elde etmek için uzun zaman (günler veya haftalar) gerektiren hücre kültürü mikrobiyoloji tekniklerine dayanmaktadır 4,10. Bu nedenle, klinik veya çevresel örneklerin bulaşıcılığı hakkında bilgi verebilecek yeni sensörler geliştirmek, tedavideki gecikmeleri ve virüsün daha fazla yayılmasını önleyebilir. Bununla birlikte, çok az yöntem, bozulmamış bir enfeksiyöz viryonu tanıyabilen ve onu bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüsten ayırt edebilen algılama molekülleri elde edebilir.
Bu bağlamda, aptamerler benzersiz bir biyomoleküler araç olarak özellikle uygundur11,12,13,14. Aptamerler, yüksek afinite ve seçiciliğe sahip bir hedefi tanımak için spesifik bir 3D konformasyon oluşturmalarını sağlayan spesifik bir nükleotid dizisine sahip kısa, tek sarmallı DNA veya RNA molekülleridir15,16. İn vitro seleksiyon olarak da bilinen üstel zenginleştirme (SELEX) ile ligandların sistematik evrimi adı verilen ve 10 14-1015 dizili 17,18,19 büyük bir rastgele DNA örnekleme kütüphanesine sahip test tüplerinde gerçekleştirilen kombinatoryal bir seçim süreci ile elde edilirler. Bu yinelemeli işlemin her turunda, DNA havuzu ilk önce istenen koşullar altında hedefle inkübasyon yoluyla bir seçim baskısına tabi tutulur. Hedefe bağlı olmayan tüm diziler daha sonra kaldırılır ve geride yalnızca verilen koşullar altında bağlanabilen birkaç dizi kalır. Son olarak, önceki adımda seçilen diziler PCR ile güçlendirilir, havuzun popülasyonu bir sonraki seçim turu için istenen fonksiyonel dizilerle zenginleştirilir ve işlem tekrarlanır. Seçim havuzunun aktivitesi bir platoya ulaştığında (tipik olarak 8-15 turdan sonra), kütüphane en yüksek afiniteyi sergileyen kazanan dizileri tanımlamak için DNA dizilimi ile analiz edilir.
SELEX, virüsün bulaşıcılık durumu 22 gibi diğer benzer hedeflere karşı daha fazla seçicilik kazanmak için kullanılabilecek benzersiz avantajlara sahiptir20,21. İlk olarak, seçim için küçük moleküllerden ve proteinlerden tüm patojenlere ve hücrelere kadar çok çeşitli farklı tipte hedefler kullanılabilir16. Böylece, bulaşıcı bir virüse bağlanan bir aptamer elde etmek için, viral bir yüzey proteini19 yerine, sağlam bir virüs hedef olarak kullanılabilir. Bütün virüs SELEX, virüsün bozulmasına gerek kalmadan, özellikle virüsün doğal durumuna bağlanan aptamerlerin seçilmesine izin verir. İkincisi, SELEX, diğer benzer virüsler veya bulaşıcı olmayan inaktive virüsler gibi rakip hedefleri 21,23'ü kaldırmak için özel olarak hazırlanabilirve her seçim 22 turunda karşı seçim adımları kullanılabilir. Karşı seçim adımları sırasında, DNA havuzu bağlanma istenmeyen hedeflere maruz bırakılır ve bağlanan diziler atılır.
Bu çalışmada, bulaşıcı bir virüse bağlanan, ancak belirli bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüse veya başka bir ilgili virüse bağlanmayan aptamerleri seçmek için genel olarak uygulanabilecek bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, önceden bilinmesi gerekmeyen virüs yüzeyinin fonksiyonel farklılıklarına dayanarak tanıma ajanlarının elde edilmesini sağlar ve böylece yeni ortaya çıkan patojenlerin tespiti veya az çalışılmış hastalıklar için ek bir avantaj sunar.

<table><tbody><tr><td>%10 Amonyum persülfat (APS)</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>%100 Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>%40 akrilamid/bisakrilamid (29:1) çözeltisi</td><td>BioRad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Boncukları</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA temizleme boncukları - Bölüm 7.2.2</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Santrifüj Filtre Ünitesi</td><td>Merck</td><td>UFC501024</td><td>kesme 10 kDa</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Santrifüj Filtre Ünitesi</td><td>Merck</td><td>UFC510024</td><td>kesme 100 kDa</td></tr><tr><td>Borik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Çift 48/48 Hızlı Reaksiyon Modüllü Dokunmatik Termal Döngüleyici</td><td>BioRad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi</td><td>BioRad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Kuru Banyolar/Blok Isıtıcılar</td><td>Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Thermo Fisher</td><td>65001</td><td>Streptavidin ile modifiye edilmiş manyetik boncuklar - Bölüm 4.9</td></tr><tr><td>EDTA disodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>324503</tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Lenti-X p24 Hızlı Titre Kiti</td><td>Takara Bio USA, Inc.</td><td>632200</td><td>Lentivirus miktar tayin kiti - Bölüm 3.3.2.1</td></tr><tr><td>MagJET Ayırma Rafı, 12 x 1,5 mL tüp</td><td>Thermo Scientific</td><td>MR02</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR Plaka Sızdırmazlık Filmi, yapışkan, optik,</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>UV emici olmayan</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Hücresi Hazır Jel Prekast Jeller için BioRad</td><td></td><td>1658004EDU</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Kısa Plakalar</td><td>BioRad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 0,75 mm Entegre Ara Parçalı Plakalar</td><td>BioRad</td><td>1653310</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler Biyoloji Sınıfı Su</td><td>Lonza</td><td>51200</td><td></td></tr><tr><td>Çok Plakalı 96 Kuyulu PCR Plakaları, yüksek profilli, eteksiz, şeffaf</td><td>BioRad</td><td>MLP9611</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq DNA Polimeraz</td><td>New England BioLab</td><td>M0480S</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td><td>Tecan</td><td>0344NB-A01</td><td>Yüksek oluk dizileme kitaplığı hazırlama kiti - Bölüm 7.2.</td></tr><tr><td>PIPETMAN G (100-1000 & mikro; L, 20-200 ve mikro; L, 2-20 ve mikro; L ve 0.2-2 &mikro; L)</td><td>Gilson</td><td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td><td></td></tr><tr><td>Arıtıcı Logic+ Sınıf II, Tip A2 Biyogüvenlik Kabinleri</td><td>Labconco</td><td>4261</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>floresan bazlı&nbsp; dsDNA miktar tayini&nbsp; kiti - Bölüm 7.2.3</td></tr><tr><td>SHARP Klasik Düşük Tutmalı Pipet Uçları (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17R</td><td>Mikrosantrifüj Termo Bilimsel</td><td>75002440</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen</td><td>Supermix BioRad</td><td>1725201</td><td>qPCR mastermix - Bölüm 6.2.</td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tüpleri ve Ultra Şeffaf Kapaklar, 8</td><td>ABD bilimsel</td><td>AB1183</td><td>PCR tüpü</td></tr><tr><td>şeritleri Üre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr></tbody></table>

enfeksiyöz ve enfeksiyöz olmayan virüsleri ayırt etmek için aptamerlerin İn vitro seçimi

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

Virüs enfeksiyonlarının toplum üzerinde büyük bir etkisi vardır; Çoğu tespit yöntemi, tespit edilen bir virüsün bulaşıcı olup olmadığını belirlemede zorluk çeker, bu da tedavide gecikmelere ve virüsün daha da yayılmasına neden olur. Klinik veya çevresel numunelerin bulaşıcılığı hakkında bilgi verebilecek yeni sensörler geliştirmek, bu karşılanmamış zorluğun üstesinden gelecektir. Bununla birlikte, çok az yöntem, bozulmamış bir bulaşıcı virüsü tanıyabilen ve dezenfeksiyon yöntemleriyle bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüsten ayırt edebilen algılama molekülleri elde edebilir. Burada, üstel zenginleştirme (SELEX) ile ligandların sistematik evrimini kullanarak bulaşıcı virüsleri ve bulaşıcı olmayan virüsleri ayırt edebilen aptamerleri seçmek için bir protokol açıklıyoruz. SELEX'in iki özelliğinden yararlanıyoruz. İlk olarak, SELEX, sayaç seçimi kullanılarak bulaşıcı olmayan virüsler veya diğer benzer virüsler gibi rakip hedefleri kaldırmak için özel olarak hazırlanabilir. Ek olarak, tüm virüs, örneğin viral bir yüzey proteini yerine, SELEX'in hedefi olarak kullanılabilir. Bütün virüs SELEX, virüsün bozulmasına gerek kalmadan, özellikle virüsün doğal durumuna bağlanan aptamerlerin seçilmesine izin verir. Bu yöntem, patojenlerin yüzeyindeki fonksiyonel farklılıklara dayanarak önceden bilinmesi gerekmeyen tanıma ajanlarının elde edilmesini sağlar.

DNA aptamerleri bir test tüpü15'te SELEX kullanılarak elde edilebildiğinden, bu SELEX stratejisi, hem sağlam, tüm enfeksiyöz virüse doğru pozitif seleksiyon adımlarını (yani, bulaşıcı virüse bağlanan DNA moleküllerini tutmak) hem de belirli bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilen aynı virüs için karşı seçim adımlarını içerecek şekilde dikkatlice tasarlanmıştır. Özellikle UV tedavisi, bulaşıcı olmayan virüse bağlanabilen DNA dizilerini atarak. Seçim sürecinin şematik bir göste...

Genel olarak, bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilmiş virüslere veya diğer benzer virüslere değil, yalnızca bulaşıcı virüslere bağlanan belirli aptamerlere uygulanabilecek bir protokol sunuyoruz. Bu, taşınabilir ve hızlı testlerde bulaşıcılık durumunu belirleme olasılığını açar.

Enfeksiyöz ve Enfeksiyöz Olmayan Virüsleri Ayırt Etmek için Aptamerlerin İn Vitro Seçimi

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

Bu protokol, klinik veya çevresel örneklerin bulaşıcılığını bildirebilecek algılama molekülü elde etmek için bulaşıcı virüsleri bulaşıcı olmayan virüslere karşı ayırt edebilen DNA aptamerlerinin nasıl seçileceğini açıklar. Bu teknik, ortaya çıkan virüsler de dahil olmak üzere diğer birçok virüs için seçici aptamerler elde etmek için uygulanabilir, çünkü virüsün yapıları veya dizileri hakkında önceden bilgi gerektirmez. Bu teknik, birinin bulaşıcı olup olmadığını veya çevresel bir dezenfeksiyon yönteminin amaçlandığı gibi çalışıp çalışmadığını tespit etmek için bulaşıcı virüslerin klinik teşhisi ve çevresel izlenmesi için aptamer sensörlerinin geliştirilmesine izin verir.Seçim, özellikle yeni olanlar için zor bir süreç olabilir. PCR koşullarını optimize etmek ve qPCR ile seçimin ilerlemesini izlemek önemlidir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Marcos Gramajo olacak.Başlamak için, ilk tek sarmallı veya SS-DNA kütüphanesini ve primerlerini tasarlayın. DNA oligolarını standart tuzdan arındırma saflaştırma ile ticari kaynaklardan elde edin. SS-DNA kütüphanesini ve primerleri% 10 denatüre edici poliakrilamid jel elektroforezi ve ardından etanol çökeltmesi ile saflaştırın.Daha sonra, bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan virüslerin stok çözeltisini elde edin veya bunları metin makalesinde açıklandığı gibi hazırlayın. SS-DNA kütüphanesinin denatürasyonu için, 10 mikrolitre 100 mikromolar SS-DNA kütüphanesini 240 mikrolitre SELEX tamponu ile karıştırın. Karışımı kuru bir banyoda 15 dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın, ardından tüpü 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.Pozitif seleksiyon için 250 mikrolitre SS-DNA kütüphanesini SELEX tamponunda 50 mikrolitre bulaşıcı virüs ile karıştırın. Oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Ardından, spesifik olmayan bölgeleri engellemek için 0,5 mililitrelik bir filtreye bir milimolar T20 dizisinin 400 mikrolitresini ekleyin.Filtreleri 30 dakika boyunca inkübe edin. T20 çözeltisini çıkarmak için filtreyi 14.000 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Ardından, fazla T20 dizilerini gidermek için filtreyi SELEX tamponu ile üç kez yıkayın.Ardından, SS-DNA kütüphanesi enfeksiyöz virüs karışımını bloke edilmiş 100 kilodalton filtreye ve bağlanmamış dizileri yıkamak için santrifüje ekleyin. 400 mikrolitre SELEX tamponu ve santrifüjleme ekleyerek filtreyi üç kez yıkayın. Kesiri filtrede tutun ve akışı atın.Bağlı dizileri elde etmek için, santrifüj filtresinin toplama tüpünü değiştirin ve filtreye sekiz molar üre içeren 300 mikrolitre SELEX tamponu ekleyin. Filtreyi 15 dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın, ardından salınan dizileri içeren akışı toplamak için santrifüj yapın. İşiniz bittiğinde, malzemeleri% 10 ağartıcı ile yıkayın.Daha sonra, önceki adımda toplanan SS-DNA bulaşıcı virüs çözeltisini bloke edilmiş 10 kilodalton filtreye ekleyin, 15 dakika boyunca 14.000 G'de santrifüj yapın ve akışı atın. Üreyi santrifüjleme ile çıkarmak ve akışı atmak için filtreyi 300 mikrolitre SELEX tamponu ile üç kez yıkayın. Filtredeki çözeltiyi temiz bir toplama tüpünde baş aşağı çevirerek ve beş dakika boyunca santrifüj yaparak geri kazanın.Bir pipet kullanarak geri kazanılan çözeltinin son hacmini ölçün ve Round 1A numune olarak etiketleyin. İlk turda Round 1A örneğinin %90'ını şablon olarak alın ve optimize edilmiş koşulları kullanarak PCR'yi çalıştırın. Streptavidin modifiye manyetik boncuklar veya MB kullanarak SS-DNA'yı kurtarmak için, ürünü 50 mikrolitre alikotlara bölün ve bunları 50 mikrolitre MB içeren mikrosantrifüj tüplerine ekleyin. Tüpü oda sıcaklığında hafif ajitasyonla 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, MB'yi izole etmek ve süpernatantı pipetleme ile çıkarmak için tüpü manyetik rafa yerleştirin. Tüpe 200 mikrolitre bağlama ve yıkama tamponu ekleyerek MB'yi iki kez yıkayın. Ardından tüpü manyetik raftan çıkarın ve MB'yi pipetleme yoluyla homojen bir çözeltiye yeniden askıya almadan önce tüpe dokunun.Tüpü tekrar manyetik rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. İkinci yıkamadan sonra, MB'yi 100 mikrolitre SELEX tamponunda tekrar askıya alın ve çözeltiyi 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın. Tüpü hemen manyetik rafa yerleştirin ve SS-DNA havuzunu içeren süpernatantı toplayın.50 mikrolitre SELEX tamponu ekleyerek bu kurtarma adımını tekrarlayın. Geri kazanılan fraksiyonun son hacmini ölçün ve Yuvarlak 1X olarak etiketleyin. SS-DNA havuzunun denatürasyonu için, Round 1X numunesinin% 60'ını alın ve 50 mikrolitre SELEX tamponu ile karıştırın.Numuneyi kuru bir banyoda ısıtın, ardından tüpü 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, denatüre SS-DNA havuzunu SELEX tamponunda karşı seçim adımı olarak her virüsün 50 mikrolitresi ile karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Santrifüj filtrelerinde spesifik olmayan bölgeleri bloke ettikten sonra, bir virüs çözeltisi ile inkübe edilmiş karışım denatüre SS-DNA havuzunu bloke edilmiş 100 kilodalton filtreye ekleyin.Filtreyi 14.000 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve akışı toplayın. 300 mikrolitre fraksiyon alın ve mililitre başına 100 milyon kopya içeren 50 mikrolitre bulaşıcı virüs ile karıştırın. Oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.Standart bir qPCR ana karışımı ve metinde açıklandığı gibi saflaştırılmış SS-DNA kütüphanesinin seyreltmelerini hazırlayın. Eşik döngüsünü belirlemek için qPCR'yi çalıştırın. Koşudan sonra, Round 1A ve Round 1X'teki SS-DNA miktarını ölçmek için standart bir eğri kullanın.Daha sonra elüsyon verimini, bağlı DNA miktarının ilk DNA miktarına bölünmesiyle hesaplayın ve elüsyon verimini yuvarlak sayıya karşı çizin. Son olarak, farklı turlar için erime eğrilerini çizin. Yüksek verimli sıralama için, piyasada bulunan uygun bir kit seçin.Yüksek, orta ve düşük zenginleştirmeyi temsil eden birden fazla seçim turu havuzunun yanı sıra her havuz için bağdaştırıcılarda farklı bir dizin çifti kullanarak son havuzu hazırlayın. Daha sonra hazırlanan son kütüphaneyi sıralama tesisine gönderin. Sıralama analizi için, diziler sıralama tesisi tarafından çoğuldan arındırılmıştır.Cutadapt komut satırı programını kullanarak sıralama bağdaştırıcılarını ve seçim astarlarını çıkarın. Ardından, düşük kaliteli dizileri kaldırmak için FASTX-Toolkit programını kullanın. Ardından, ters yön dosyalarındaki FASTX-Araç Seti FASTX_reverse_ tamamlama işlevini kullanarak sıra dosyalarını ters yöndekilerle birleştirin.Ardından, dosyaları tek bir dosyada birleştirmek için yerleşik CAT programını kullanın. Farklı seçim havuzlarındaki dizilerin zenginleştirilmesini analiz etmek için FASTAptamer analiz araç setini kullanın. İlk olarak, benzer dizileri kümeler halinde gruplandırmak için FASTAptamer sayısı ve FASTAptamer küme işlevlerini kullanmak.Ardından, dizilerin ve kümelerin zenginleştirilmesi hakkında bilgi almak için FASTAptamer zenginleştirme işlevini kullanın. Dizi analizi yoluyla elde edilen zenginleştirme bilgilerinden aday aptamer dizilerini tanımlayın. Birkaç aptamer dizisi seçin ve bir bağlama testi kullanarak ilk taramayı gerçekleştirin.Bu analizde, enfeksiyöz SARS-CoV-2 spesifik aptamerlerinin SELEX'inin ilerlemesini izlemek için qPCR kullanılmıştır. Elüsyon verimi başlangıçta her SELEX turunda arttı ve sekizinci ve dokuzuncu turlarda seviyelendirildi. Erime eğrilerini karşılaştırarak, 77 ila 79 santigrat derece arasında yüksek bir erime sıcaklığında zirveden bir kayma gözlendi.Dahası, son iki turda, düşük erime sıcaklığında bir tepe gözlendi. Ardışık seçim turlarında elde edilen sıralı SARS2 AR10 için milyonda okumalardaki göreceli bolluk gösterilmiştir. SARS2 AR10'un öngörülen yapısı, virüsün tanınmasında rol oynayabilecek bir kök döngü bölgesi içeren yapılandırılmış bir ikincil yapı gösterdi.Aptamerler elde edildikten sonra, virüs bulaşıcılığını bildirebilecek portal ve hızlı virüs tespit testi geliştirmek için başka bir sensör türü olan elektriksel optiklere dahil edilebilirler. Farklı varyantlara veya virüs klişelerine özgü aptamerlerin elde edilebileceğini ve toplum için en büyük tehdit olan varyantların hızlı bir şekilde izlenmesini mümkün kılacağını öngörüyoruz.

in-vitro-selection-aptamers-to-differentiate-infectious-from-non

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Amiloid beta-Protein, Alzheimer hastalığının etkeni Aptamers Seçimi

SELEX protokolleri da rasgele kütüphane bölgeleri kuşatan sabit primer dizilerinden gerektiren bağlı ligandlar, yenilenme gerektiren her hangi seçimin birden fazla mermi, oluşmaktadır. Bu sabit astar dizileri seçim süreci (yanlış pozitif ve negatif) ile karışabilir. Burada bir astar ücretsiz protokol sunuyoruz.

Rastgele bir DNA Kütüphane Kullanımı Primer-Aptamer Seçimi

Nanomole afinite ile HIV 1BA-L gp120 karşı çeşitli 2'-Fluoro RNA aptamers bir RNA kütüphanesi ile izole edilmiştir.

Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme

Sitopatik etki (CPE)-bazlı analiz, doz-yanıt tahlil ve Time-of-adisyonu (TOA) deneyi de dahil olmak üzere üç deneyleri yanı sıra, gelişmiş optimize edilmiş, doğrulanmış ve Bluetongue virüsüne karşı yeni antiviraller (BTV) tanımlamak için kullanılmıştır yeni tespit antiviraller için olası Mekanizması-of-Eylem (MoA) belirlemek gibi.

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

Virüs çoğaltma ölçmek için in vitro deneylerinde önemli ölçüde lusiferaz veya biyolüminesans edebilen diğer enzimleri ifade eden rekombinant RNA virüslerinin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir. Burada ayrıntılı kızamık ve kimyasal kütüphanelerden geniş spektrumlu antiviral izole etmek Chikungunya virüsler, rekombinant suşlar birleştiren bir yüksek verimli tarama hattını.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

Ayarlanabilir sıkılık manyetik boncuk seçim yöntemine dayalı olarak küçük moleküllü hedefler için yapı anahtarlamalı aptamerleri seçmek için bir protokol sağlanır. Yapı değiştirme özelliklerine sahip olarak seçilen aptamerler, tarif edilen altın nanopartikül tahlili gibi bir hedefin varlığını işaret etmek için konformasyonel bir değişiklik gerektiren tahliller için faydalıdır.

Bir Kolorimetrik Altın Nanopartikül Testi Uygulanan Yapı-anahtarlama aptamers seçilmesi için bir yöntem

Burada, yeni antiviral ajanları tanımlamak ve değerlendirmek için viral girişin belirli adımlarını inceleyen bir protokol sunuyoruz.

Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

Arenavirüs yaşam döngüsünün ilk adımı, viral partiküllerin konak hücrelere bağlanmasıdır. Arenavirüs bağlanma olaylarının ultra hassas tespiti ve kantitasyonu için kantitatif (q) RT-PCR tabanlı bir test sunuyoruz.

Arenavirüs hücre Ek Ölçümü için son derece hassas Deneyi

Viral genom amplifikasyon kullanan rutin algılama yöntemleri bulaşıcı olmayan parçacıklar bulaşıcı ayırımcılık için kendi yetersizlik tarafından sınırlıdır. Bu makalenin amacı, aptamer bağlama, dinamik ışık saçılma ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak bulaşıcı norovirus parçacıkların ayrımcılık yardım etmek alternatif yöntemler detaylı protokollerde sağlamaktır.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

Antikanser aptamer gelişiminde gerekli bir adım, hedefe bağlanmasını test etmektir. Bu bağlanmayı incelemek için akış sitometrik tabanlı bir tahlil gösteriyoruz ve negatif bir kontrol aptamer ve bu belirli protein için pozitif veya negatif olan kanser hücrelerinin dahil edilmesinin önemini vurguluyoruz.

Bir Antikanser Aptamerinin Seçiciliğini ve Özgüllüğünü Değerlendirmek için Akış Sitometrisine Dayalı Hücre Yüzeyi Protein Bağlama Testi

Öğrenin enfeksiyöz ve enfeksiyöz olmayan virüsleri ayırt eden DNA aptamerlerinin in vitro seçim yöntemini. Bu biyoteknik protokol, klinik tanı ve çevresel izleme için duyar sensörler geliştirmeyi sağlar.

Enfeksiyöz ve Enfeksiyöz Olmayan Virüsleri Ayırt Etmek için Aptamerlerin İn Vitro Seçimi

Daha fazla video keşfet