Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması
September 23rd, 2022
Mevcut protokol, temsili EV'leri (eksozomlar ve mikro-parçacıklar) kültürlü insan MSC'lerinden izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeyi açıklamaktadır. Bu EV'lerin diğer uygulamaları da bu makalede açıklanmaktadır.
Bu prosedür, basit ve güvenilir mezenkimal kök hücre kaynaklı hücre dışı vezikül toplama ve araştırmanın çevirisinde uygulama ihtiyacını ele almıştır. Diferansiyel santrifüjleme ile hücre dışı veziküllerin toplanması basit, kolayca ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir, bu da alan için yararlı olacaktır. Hücre dışı veziküller belirsiz}den belirsiz}mezenkimal kök hücre, modern hastalık tedavilerinde belirsiz bir uygulamadır.
Hatalardan korkmayacağım. Bu işlem basit ve öğrenmesi kolaydır. Bu basit programda video yoluyla daha iyi sunulabilecek birçok ayrıntı var.
Başlamak için, mezenkimal kök hücreleri% 90'dan fazla birleşime kültürleyin. Her yemekteki kültür ortamını 8 mL takviyeli alfa-MEM ile değiştirin. 48 saatlik kültürden sonra, kültür ortamını 50 mL santrifüj tüplerine tamamen toplamak için hücreler eşit şekilde büyütülmelidir.
Ardından, kültür ortamını 800 x g'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin. Hücre parçalarını ve hücresel kalıntıları çıkarmak için süpernatantı 1.5 mL konik tüplere aktarın. Süpernatantı 16.000 x g'de dört santigrat derecede 30 dakika boyunca santrifüj edin.
Süspansiyonu ultrasantrifüj tüplerine aktarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra, dört santigrat derecede iki saat boyunca 150.000 x g'de santrifüj. Mikro-parçacıklı peleti çanak başına 50 uL PBS'de tekrar askıya alın.
Süpernatantı atın ve eksozomlar olan kalıntıyı toplayın. Eksozomları 50 uL PBS'deki yedi hücre kabından yeniden askıya alın. 15 mL'lik bir tüpte, 1.499 uL PBS'de 1 uL hücre dışı vezikülü seyreltin ve karıştırın.
Ardından, izleme analizörü için uyumlu yazılımı başlatın. Numune hücresini damıtılmış suyla doldurun ve ardından cihazın hücre kontrolünü başlatmasına izin verin. Cihazı hazırlanmış bir standart çözelti ile kalibre edin.
Yazılım algılama arabiriminde görüntülenen parçacık numarasının 50 ila 400 arasında, tercihen 200 civarında olduğundan emin olun ve Tamam'ı tıklatın. Daha sonra, numune hücresini 5 mL damıtılmış su ile durulayın. Numune analizinden önce, kanalı 1 mL damıtılmış su ile yıkayın.
Yazılım algılama arabiriminde görüntülenen parçacık numarasının 10'dan az olduğundan emin olun. 1.5 mL'lik bir konik tüpte, hücre dışı vezikülleri 250 uL PBS ile yeniden askıya alın. Başka bir 1.5 mL konik tüpte, PKH26 boyasının çalışma çözeltisini hazırlayın.
Askıya alınmış hücre dışı vezikülleri çalışma çözeltisi ile karıştırın. Oda sıcaklığında beş dakika bekletin ve ardından reaksiyonu durdurmak için 500 uL EV tükenmiş FBS ekleyin. Mikro-parçacıklar için, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj.
Supernatan'ı atın. Kalıntıyı durulamak için 1 mL PBS ekleyin. Tekrar santrifüj yapın ve bağlanmamış boyayı çıkarmak için süpernatantı atın.
Mikro-parçacıklar için, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj. Kalıntıyı 200 uL PBS ile yeniden askıya alın. Slaytın üzerine 20 uL süspansiyon bırakın ve floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
Hücre dışı vezikülleri 200 uL PBS'de yeniden askıya alın ve daha sonra 10: 1 hacim oranında heparin çözeltisi ile karıştırın. Fareyi kaudal ven görüntüleme sistemine yerleştirin. Kolu kaldırmak için düğmeye basın.
Bir kuyruk damarı illüstratör yardımıyla, hücre dışı vezikül süspansiyonunun kuyruk damarından sistematik bir enjeksiyonunu gerçekleştirin. NTA kullanılarak partikül boyutu dağılımının analizi, insan mezenkimal kök hücrelerinden gelen eksozomların boyutunun, yaklaşık 100 nm'lik bir tepe boyutu ile 40 ila 335 nm arasında değiştiğini göstermiştir. Ayrıca, mikro-parçacıkların boyutu, tepe boyutu 150 nm olan 50 ila 445 nm arasında değişmiştir.
Eksozomların morfolojik karakterizasyonu, tipik bir fincan şekli sergilediklerini göstermiştir. Hücre dışı veziküller, etiketli peletler olarak brüt görünüm ve floresan mikroskopi ile gözlemlenen PKH26 tarafından etkili bir şekilde etiketlendi. Operatör süpernatant toplama sırasında dikkat etmelidir, çünkü mezenkimal kök hücrelerin belirsizliğinde tutulan serbest bırakılan EV'leri tam olarak toplamak için hücreler eşit şekilde üflenmelidir.
Enjeksiyonun başarısını doğrulamak için, floresan etiketli EV'lerin biyodağılımının in vivo görüntülemesi veya engraftmanın spesifik doku bölgelerinin dondurulmuş bölümleri yapılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, kültürlenmiş insan mezenkimal kök hücrelerinden (MSC'ler) ekstrasellüler veziküllerin (EV'ler), özellikle ekzosomların ve mikrovezikullerin izolasyonu ve karakterizasyonu için detaylı bir protokol sunmaktadır. Bu yaklaşım, bu EV'lerin hastalık tedavilerinde ve araştırma uygulamalarında önemli potansiyel taşıdığı hassas bir yöntem sağlamak için farklı santrifüjlemeyi kullanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Ekstrasellüler veziküller
- Mezenkimal kök hücreler
- Hastalık tedavilerinde biyolojik uygulamalar
Arka Plan
- EV'lerin izolasyonu, hücre iletişiminde ve terapötik potansiyele rollerini anlamak için kritik öneme sahiptir.
- EV toplamak için mevcut yöntemlerin basit, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir olması gerekmektedir.
- Bu protokol, araştırma uygulanabilirliğini artırırken bu ihtiyaçları karşılamayı amaçlamaktadır.
Kullanılan Yöntemler
- EV izolasyonu için farklı santrifüjleme
- Biyolojik sistem olarak insan mezenkimal kök hücreleri
- EV karakterizasyonu ve analizi için floresan mikroskopi
Ana Sonuçlar
- Tanımlı boyut aralıklarında ekzosomlar ve mikrovezikullerin başarılı bir şekilde izole edilmesi: ekzosomlar (40-335 nm, 100 nm'de tepe) ve mikrovezikuller (50-445 nm, 150 nm'de tepe).
- Mikroskop altında karakterize edilen tipik fincan şekilli morfoloji sergilenmesi.
- Takip ve analiz için PKH26 boyası kullanılarak EV'lerin verimli bir şekilde etiketlenmesi.
Sonuçlar
- Çalışma, MSC'lerden EV toplamak için tekrarlanabilir bir yöntemi etkili bir şekilde gösterir.
- Hücresel iletişim ve terapötik uygulamalarda EV araştırmasını ilerletmek için yöntemin faydasını vurgular.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of extracellular vesicles (EVs) from human mesenchymal stem cells (MSCs) addresses a critical need for scalable, reproducible tools in early-stage biopharma R&D. This protocol enables standardized EV preparation, supporting translational research and facilitating the development of EV-based therapeutics. The approach enhances predictive confidence and operational efficiency at key discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of MSC-derived EVs as functional mediators in disease-relevant pathways.
- Supports biological de-risking by providing well-characterized vesicle populations for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in target validation through quantitative EV characterization.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized EV samples for downstream labeling, imaging, and functional assays.
- Improves assay reproducibility and scalability by using defined isolation and quantification steps.
- Enables reliable compound or intervention evaluation in EV-modulated systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV isolation with translational workflows for local transplantation and systemic injection studies.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling in vivo biodistribution and tissue targeting analysis.
- Provides a platform for risk-adjusted advancement of EV-based therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized EV isolation, quantitative characterization, and downstream application in both in vitro and in vivo models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification using MSC-EVs as functional probes.
- Screening: Delivers reproducible, quantifiable EV preparations for assay development and screening readiness.
- Analytics: Provides particle size distribution and fluorescence-based tracking for comparative analysis.
- Translational Research: Enables biodistribution and tissue targeting studies to inform preclinical development.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable protocol for repeated use across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in EV-based research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable EV isolation and characterization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in early pipeline stages.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EV-based therapeutic and biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, differential centrifugation, and nanoparticle tracking analysis.
- Needs access to ultracentrifugation and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible EV isolation and quantification.
- Adaptable to various MSC sources and downstream model systems.
- Careful handling during supernatant collection is critical for optimal EV yield and purity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:04
Differential Centrifugation for Isolation of Exosomes and Microvesicles
2:25
Detection of Particle Numbers and Size Distribution of Extracellular Vesicles
3:29
Labeling of Extracellular Vesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells
4:50
Systemic Injection of Extracellular Vesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells
5:24
Results: Characterization of Extracellular Vesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells
6:19
Conclusion
