Caenorhabditis elegans'ta İki Kimyasalın Eşleştirilmesiyle Engelleyici İlişkisel Öğrenme ve Hafıza Oluşumu

Öğrenme ve hafıza, hayvanların sürekli değişen ortamlarda verimli bir şekilde gezinerek hayatta kalmaları ve üremeleri için hayati öneme sahiptir. Aynı zamanda sinirbilimde incelenen başlıca konulardan biridir. Caenorhabditis elegans, sinir sisteminin basitliği nedeniyle öğrenme ve hafıza çalışmaları için çekici bir organizmadır.

Kimyasal ve elektrik kablolama şemaları da tamamen yeniden yapılandırılmıştır. Caenorhabditis elegans'ın davranışsal analizi son derece zordur ve kimyasal, mekanik ve sıcaklık gerilmeleri gibi bir dizi parametreden etkilenir. Başlamak için, bir Luria-Bertani ortamında 0.2 mililitre E.coli OP50 sıvı kültürü yayarak ve bunları oda sıcaklığında 24 saatten fazla olmamak üzere inkübe ederek altı santimetre nematod büyüme ortamı veya NGM plakaları hazırlayın.

İlk gün, bir platin solucanı toplayıcı ile her altı santimetrelik NGM plakasına beş iyi beslenmiş gravid hayvanı toplayın ve yerleştirin ve senkronize bir yetişkin hayvan popülasyonu elde etmek için oda sıcaklığında üç saat boyunca yaklaşık 50 yumurta bırakmalarına izin verin. Yumurtlamayı durdurmak için, ebeveyn hayvanları plakalardan platin solucan toplayıcı ile çıkarın. Genç yetişkin aşamasına değil, olgun yetişkin aşamasına ulaşmak için hayvanları yaklaşık beş gün boyunca oda sıcaklığında yetiştirin.

Beş gün sonra, her plakayı bir mililitre% 0.25 sulu jelatin ile yıkayarak bir hayvan toplayıcısında yaklaşık 200 yetişkin hayvan toplayın, bu da hayvanların pipet uçları gibi plastiklerin yüzeyine yapışmasını önleyecektir. Daha sonra, toplayıcıyı 10 mililitre çift damıtılmış suda iki kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek hayvanları yıkayın. İşlemi iki kez tekrarlayın.

Yaklaşık 200 hayvan içeren hayvan toplayıcıyı, pH 4'te% 1-1-propanol ve hidroklorik asit karışımının 40 mililitrelik bir karışımına bir saniye boyunca kristalleştirici bir kaba yavaşça daldırın. Kollektörü, 10 mililitre çift damıtılmış su içeren 6 delikli doku kültürü plakasının bir kuyucuğuna bir kez çok nazikçe batırarak toplayıcıdaki hayvanları yıkayın. Daha sonra toplayıcıyı, hayvanların dinlenmesi için 10 dakika boyunca altı santimetrelik bir NGM plakası üzerindeki bir E.coli OP50 çimine yerleştirin.

Daha sonra, kolektörü yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirerek toplayıcıdaki hayvanları 10 mililitre çift damıtılmış suyla yıkayın. Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın ve kemotaksis testine devam edin. Hayvanları sırayla bir toplayıcıda propanol karışımı ve çift damıtılmış su ile yıkayın, her biri daha önce gösterildiği gibi.

Daha sonra toplayıcıyı, hayvanların dinlenmesi için 10 dakika boyunca altı santimetrelik bir Petri kabında bir NGM agar üzerindeki bir E.coli OP50 çimine yerleştirin. Daha sonra, bakteriyel kontaminasyonu önlemek ve kemotaksis testine devam etmek için toplayıcıyı 10 mililitre çift damıtılmış suda iki kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek hayvanları üç kez yıkayın. Kemotaksis testi için altı santimetre plastik Petri kaplarında burgu plakaları hazırlayın.

Ardından, hayvanları toplayıcıdan bir mililitre% 0,25 sulu jelatin içeren iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için bir milimetreden fazla açıklığa sahip kesilmiş bir pipet ucu kullanın. Hayvanlar tüpün dibine yerçekimi ile yerleştikten sonra, süpernatantı tüpten çıkarın. Hayvanları bir mililitre kemotaksis tahlil tamponunda yeniden askıya alın ve yaklaşık bir dakika boyunca yerçekimi ile tüpün dibine yerleşmelerine izin verin.

Ardından, pipetleme ile mümkün olduğunca fazla süpernatant çıkarın. Daha sonra, iki yerde dört mikrolitre% 5 sulu 1-propanol çapraz olarak tespit edin, ardından Petri plakasının diğer iki yerinde dört mikrolitre çift damıtılmış su tespit edin. Ardından, üç plakanın merkezinde yaklaşık 60 hayvan içeren bir kemotaksis tahlil tamponunda altı mikrolitre hayvan süspansiyonunu tespit etmek için bir milimetre açıklığa sahip kesilmiş bir pipet ucu kullanın.

Sıvıyı, hayvanlara dokunmadan bir laboratuvar doku fitili ile mümkün olduğunca çıkarın. Tabağa bir kapak yerleştirin ve hayvanların oda sıcaklığında 10 dakika boyunca plaka üzerinde serbestçe hareket etmesine izin verin. Kemotaksisi durdurmak için, bu tabağı üç dakika boyunca buz üzerinde bir cam Petri kabına aktarın.

Daha sonra, plakadaki hayvan sayısını sayana kadar tabağı bir buzdolabına yerleştirin. Stereo mikroskop altında merkez dairedekiler dışında dört bölümdeki hayvan sayısını sayın ve denklemi kullanarak kemotaksis indeksini hesaplayın. Kemotaksis indeks değerlerinden, öğrenme indeksi değerlerini, referans hayvanların kemotaksi indeks değeri ile şartlandırılmış hayvanların kemotaksi indeks değeri arasındaki fark olarak hesaplayın.

Kemotaksis tahlilinde, 1-propanol ve hidroklorik asit karışımı ile şartlandırılan hayvanlar, agar plakalarında lekelenen% 51-propanol'a çekilmezken, naif ve referans hayvanlar% 51-propanol'a çekilmiştir. Sulu 1-propanol ve hidroklorik asit karışımı ile aralıklı eğitim ile şartlandırılan hayvanlar, sadece% 1-1-propanol veya hidroklorik asit veya sadece çift damıtılmış su ile muamele edilmiş hayvanlara kıyasla% 5-1-propanol'a çekilmemiştir. Mutasyonların hafıza üzerindeki etkisini incelemek, kısa süreli ve uzun süreli hafıza oluşumunun, hayvanların klasik koşullanmasında önemli rol oynayan genlere bağlı olduğunu ortaya koymuştur.

Her koşullandırmadan sonra, hayvanlar sadece bir kez çift damıtılmış su ile nazikçe yıkanmalıdır. Prosedür kullanılarak uzun süreli hafıza oluşturulduktan sonra, kalsiyum görüntüleme ve elektrofizyoloji hafızadan sorumlu nöronal devreleri tanımlayabilir. Genetik ve tek nöron analizleri sayesinde, hafıza depolama ve geri alma süreçleri moleküler ve tek hücre seviyelerinde ele alınabilir.