Name: Siyah Ayaklı Kene Gen Düzenleme için Embriyo Enjeksiyon Tekniği, Ixodes scapularis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Keşfedin, Ixodes scapularis embriyo enjeksiyon protokolü ile kene gen düzenleme tekniklerini. Bu yöntem, kene gen fonksiyonları ve patojen etkileşimlerini moleküler düzeyde anlamak için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Channa Aluvihare ve Yonus Gebermicale, ITF, UMD'ye, protokol geliştirmenin ilk aşamasında içgörü ve destek için teşekkür eder. Tungsten iğneleri, David O'Brochta, ITF, UMD'den cömert bir hediyeydi. Bu protokolü I. ricinus'ta test ettiği ve anlayışlı tartışmalar için Dr. Ladislav Simo'ya minnettarız. Bu proje NIH-NIAID R21AI128393 ve Plymouth Hill Vakfı, NY'den MG-N'ye, Nevada Üniversitesi'nden AN'ye başlangıç fonları, MG-N ve AN'ye 2019609 Ulusal Bilim Vakfı Hibe ve IGTRCN'den AS'ye Peer-to-Peer Grant tarafından finanse edildi.

Ixodes scapularis yetişkinleri ya Oklahoma Eyalet Üniversitesi'nden (OSU) satın alındı ya da Nevada Üniversitesi, Reno'da (UNR) yetiştirildi (IACUC protokolü #21-001-1118).
1. Embriyo toplama için dişi kenelerin hazırlanması
NOT: Uygun yaştaki yumurtaları toplamak için, yumurtlamayı senkronize etmek önemlidir. Kenelerde yumurtlama ipuçları belirsizliğini korusa da, standart böcek koşulları altında (27 ° C sıcaklık ve% >90 bağıl nem (RH)), I. scapularis dişileri, konakçı ayrılmasından yaklaşık 8 gün sonra yumurta bırakmaya başlar. Bu zaman çizelgesi, dolu dişileri 4 ° C'de depolayarak uzatılabilir. Kanla beslenen dişileri 4 ° C'de 8 haftaya kadar yumurtlama üzerinde herhangi bir olumsuz etkisi olmadan sakladık. Bu koşulların her böcek için değiştirilmesi gerekebilir.
<ol><li>Tüm dolu dişileri, mikroenjeksiyonlar için kullanılana kadar nemli filtre kağıdı ile kaplanmış 6 litrelik plastik bir kutuda% >90 RH ile 4 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Enjeksiyonlardan bir hafta önce, yumurtlamanın başlatılması için dişileri 4 ° C'den 27 ° C'lik bir inkübatöre aktarın.</li>
	<li>Dişiler yumurta bırakmaya başladığında (onları 27 ° C'ye taşıdıktan 3-4 gün sonra), ince uçlu bir boya fırçası kullanarak yumurtaları çıkarın ve dişileri Gené'nin organ (balmumu bezi) ablasyonu için hazırlayın. NOT: Gené'nin organı, scutum ve capitulum (ağız kısımlarının dorsal tabanı) arasındaki alandan uzanır, ağız kısımları ventral vücut yüzeyi üzerinde bükülür (yüzeye paralel) ve genişletilmiş Gen'in organı, yumurtalar serilir serilmez yumurtaları kaplar (Şekil 1). Gené'nin organının çıkarılmasından veya balmumunun boşaltılmasından önce bırakılan yumurtalar balmumu kaplamasına sahip olacaktır ve enjeksiyonlar için uygun değildir ve atılmalıdır.</li>
	<li>Gené'nin organını çıkarmak veya boşaltmak için, engorged dişiyi mikroskop altında yönlendirilmiş bir cam slayt üzerine konumlandırmak için kil kullanın, böylece ağız kısımları hem ventral hem de dorsal taraflarda görülebilir (Şekil 1B, C).<ol><li>Daha önce yayınlanmış bir protokol16'yı takiben tungsten teli kullanılarak laboratuarda yapılan ince forseps ve tungsten iğneleri kullanarak scutum ve ağız kısımları arasındaki alanı dikkatlice dürtün (iğneler ticari olarak da satın alınabilir ve bir mikro diseksiyon probuna tutturulabilir, bkz.</li>
		<li>Tungsten iğnesi ile içeri girmeye çalışarak, balmumu bezini dışarı çekin (Şekil 1D, E). Bezin çıkarılması birkaç dakika sürebilir. Laboratuvar mendilleri kullanarak sıvı balmumu salgılarını silin. NOT: Bez, ağız kısımlarının hemen altındaki ventral taraftan da çıkarılabilir; arkadan scutuma doğru bir iğne ve forseps ile uzanarak. Ağız kısımlarının etrafına silikon yapıştırıcı uygulanması da Gene'in organ eversiyonunu engeller ve balmumunu çıkarmak veya boşaltmak yerine kullanılabilir (Dr. Ladislav Simo, INRAE, Fransa ile kişisel iletişim). Engorged keneler çift taraflı bantta kalmayacaktır. Keneyi "kundaklamak" için kil kullanmak, manipülasyon sırasında onları yerinde tutmaya yardımcı olur. Diseksiyon için kene ve tungsten iğnesini tutmak için forseps kullanın. Ventral kısmın iğne ile delinmesi daha kolaydır ve yazarlar tarafından tercih edilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Bezi boşaltmak için, gravid kenesini adım 1.4'te belirtildiği gibi düzenleyin. Dorsal taraftaki ağız kısımlarının arkasındaki alanı dikkatlice delin ve forseps kullanarak ventral tarafa baskı uygulayın. NOT: Alternatif olarak, balmumu bezinin çıkarılması gerekli değildir; balmumu bezinin boşaltılması birkaç gün sürecektir. Yumurtlayan dişiler, ağız kısımlarının etrafında, balmumu bezinin yerini gösteren ve referans olarak kullanılabilecek beyaz bir alana sahiptir.<ol><li>Tüy bırakmayan bir laboratuvar mendilinin kenarını yerleştirin ve delinme bölgesinden çıkan sıvı balmumunu çıkarın. Hafif sarımsı viskoz balmumu ile karşılaştırıldığında berrak bir sıvı olan hemolenf sekresyonundan kaçındığınızdan emin olun. Balmumunun çoğu çıkarılana kadar 5-10 dakika sürebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Manipülasyondan sonra, dişileri 27 ° C'de (% >90 RH) bir inkübatöre yerleştirin ve 1-2 gün boyunca iyileşmelerine izin verin. NOT: Tedavi edilen dişilerin iyileşmesi ve tekrar yumurta bırakmaya başlaması genellikle 1-2 gün sürer.</li>
	<li>Dişiler tekrar yumurta bırakmaya başladığında, taze birikmiş yumurtaları toplamak için ince bir boya fırçası kullanın (yumurtlamadan 0-18 saat sonra) ve bunları 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. NOT: Zamanla aynı dişiden yumurta kullanılıyorsa, bezler çıkarılmamışsa, bu prosedür yumurtlamadan 4-5 gün sonra tekrarlanmalıdır.</li>
</ol>2. Mikroenjeksiyonlar için embriyo tedavisi
<ol><li>0-18 saat eski yumurta içeren tüpe ~ 200 μL (veya yumurta sayısına bağlı olarak yumurtaları örtmek için yeterli hacim) % 5 (ağırlık / hacim) benzalkonyum klorür / su (bkz. Yumurtaların tüpün dibine yerleşmesini önlemek için yumurtaları boya fırçasıyla 5 dakika boyunca yavaşça döndürün (ayrıntılar için Sharma ve ark.4'e bakınız). Süpernatantı bir mikropipet kullanarak çıkarın ve yumurtaları tüp içinde geride bırakın. DİKKAT: Benzalkonyum klorür cilt ve gözler için aşındırıcıdır, eldiven giyin ve göz koruması kullanın.</li>
	<li>Yumurta içeren tüpe ~ 200 μL damıtılmış (DI) su ekleyin, bir boya fırçasıyla döndürün ve bir mikropipet kullanarak suyu mikrosantrifüj tüpünden çıkarın. DI su ile yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>DI suyu ile yıkadıktan sonra, ~ 200 μL% 5 (w / v) sodyum klorür (NaCl) ekleyin ve 5 dakika boyunca bir boya fırçası ile hafifçe döndürün. Çözeltiyi 5 dakika sonra tüpten çıkarın ve yumurtaları iki kez DI suyuyla yıkayın.</li>
	<li>Yumurta içeren mikrosantrifüj tüpüne ~100 μL% 1 (w / v) NaCl çözeltisi ekleyin. Yumurtaları enjeksiyonlar için kullanılana kadar% 1 (w / v) NaCl çözeltisinde tutun.</li>
	<li>Yaklaşık bir saat sonra mikroenjeksiyonlara başlayın. Bu zaman çizelgesi, yumurtaların uygun şekilde kurutulmasına yardımcı olur ve patlamalarını önler. NOT: Yumurtalar, sağkalımı önemli ölçüde etkilemeden 7-8 saat boyunca% 1 (w / v) NaCl çözeltisinde tutulabilir. Yumurtaların enjekte edilmesi veya patlaması zorsa, yumurtalar yeterince kurutulmaz ve 5 dakika daha% 5 (w / v) NaCl ile muamele edilebilir.</li>
</ol>3. Enjeksiyon iğnelerinin hazırlanması
<ol><li>Üreticinin talimatlarını izleyerek iğne çektiricisine bir alüminosilikat kılcal cam (filamentli, Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.</li>
	<li>İğne çektiricisini şu ayarlara ayarlayın: Isı: 575, Çekme: 20, Hız: 50, zaman: 200 ve Basınç: 700.</li>
	<li>İğne çektiricisinin çekme işlevini etkinleştirin ve ek iğneler için işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>Çekilen iğneleri, temiz bir Petri kabında modelleyicinin kil hatlarına yapıştırarak saklayın.</li>
	<li>İğneyi bir mikro yükleyici ucu kullanarak enjeksiyon karışımıyla doldurun (bkz. NOT: Kene ve sivrisinek embriyosu enjeksiyonu için kullanılan iğnelerin karşılaştırılması Şekil 2'de gösterilmiştir.</li>
</ol>4. Mikroenjeksiyonlar için slayt kurulumu
<ol><li>Çift taraflı bant kullanarak, iki cam mikroskop slaytını birbirine yapıştırın, yumurtaların hizalanmasını desteklemek ve enjeksiyonlar sırasında yuvarlanmalarını önlemek için yaklaşık 0,5 cm'lik bir boşluk bırakın (Şekil 3A).</li>
	<li>Slaytlar arasındaki boşluktaki çift taraflı bant üzerine bir parça şeffaf film pansuman uygulayın (bkz. Film pansuman boşluğuyla mükemmel bir şekilde hizaladığınızdan emin olun.</li>
</ol>5. Embriyo mikroenjeksiyonları
<ol><li>Tek saçlı bir boya fırçası kullanarak slayt kurulumunda (yukarıda) bir seferde 8-10 yumurtayı hizalayın. NOT: Kızak kenarına dik olarak daha uzun eksenle hizalanmış yumurtaların (Şekil 3B), uzunlamasına ekseni kenara paralel olarak hizalanmış yumurtalara göre enjekte edilmesi daha kolaydır (Şekil 3C). Dik yöndeki yumurtalar (Şekil 3B) enjeksiyona daha iyi dayanabilir ve bu da daha yüksek hayatta kalma ile sonuçlanabilir.</li>
	<li>Slaytı hizalanmış yumurtalarla bileşik mikroskop sahnesine yerleştirin. Depolandıkları %1 NaCl çözeltisini çıkarmak için bir parça tüy bırakmayan mendil kullanın.</li>
	<li>Doldurulmuş enjeksiyon iğnesini bir mikromanipülatöre bağlı bir mikroenjektöre takın (bkz.</li>
	<li>İğneyi, mikroenjektör üzerinde yüksek basınç ayarı kullanarak yumurta yüzeyine nazikçe sürtünerek açın (>5.000 hPa).</li>
	<li>İğne açıldıktan sonra, iğnenin açılmasına bağlı olarak mikroenjektörün basıncını (1.000-2.500 hPa) azaltın. NOT: Küçük bir açıklık nispeten daha yüksek basınç gerektirirken, daha büyük bir açıklık daha düşük bir basınç gerektirecektir. Bu, enjekte edilen yapının hacmini kontrol etmek içindir. İğne açıklığının boyutuna bağlı olarak, enjeksiyon hacmi 1-5 pL arasında değişecektir.</li>
	<li>Slayttaki tüm yumurtaları mümkün olduğunca çabuk 10°-15° açıyla enjekte edin ve slaytı nemli kağıtla kaplı bir Petri kabında hemen yüksek nem koşullarına getirin. Yumurtalar enjekte edilir edilmez kurumaya başlarlar. NOT: Bir seferde az sayıda yumurta enjekte etmek, enjeksiyon başarısını ve hayatta kalma olasılığını arttırır. İğneler embriyo reflü tarafından tıkanır. Uç hala keskinse, tıkanmış iğneleri temizlemek için, iğneyi slaytın kenarına eklenen% 1'lik küçük bir NaCl damlacığına hareket ettirin. Kılcal hareket, küçük tıkanıklığı yerinden çıkaracaktır. İğne zaten kör ise, değiştirin.</li>
</ol>6. Embriyoların enjeksiyon sonrası bakımı
<ol><li>Enjekte edilen embriyoları içeren slaytı, nemli filtre kağıdı ile kaplı büyük bir Petri kabına yerleştirin. NOT: Yumurtaları en az 5-6 saat rahatsız etmemek çok önemlidir. Bu, enjeksiyon yarasının düzgün bir şekilde kapatılmasını sağlar. Enjeksiyon yarası çalkalandığında açılabilir ve sitoplazma sızmaya başlayabilir ve yumurta mortalitesine neden olabilir.</li>
	<li>5-6 saat sonra, enjekte edilen embriyolar eklenmiş şeffaf film pansumanına küçük bir damla DI suyu ekleyin. Bir boya fırçası kullanarak, yumurtaları yavaşça yerinden oynatın. Yumurtaları küçük bir Petri kabına (10 cm) aktarın ve DI suyuna batırın. NOT: Film pansumanı, enjeksiyonlardan sonra yumurtaların kolayca çıkarılmasını sağlar. Film sosuna bir su damlası eklendiği anda, yumurtalar su ile birlikte hareket etmeye başlayacaktır.</li>
	<li>Yumurtaları suya batırın ve Petri kabını 27 ° C ve% >90 RH'de bir inkübatörde 6 litrelik plastik bir kutuya yerleştirin.</li>
	<li>Yumurtaları düzenli olarak, ilk birkaç gün boyunca günlük olarak ve daha sonra larvalar yumurtadan çıkmaya başlayana kadar her 3-4 günde bir kontrol edin. NOT: Mikroenjeksiyonlar sırasında çok sayıda yumurta hasar görürse, bir hafta sonra DI suyunun nazikçe boşaltılması, ölü yumurtalarda mantar büyümesini önleyecektir.</li>
	<li>Larvalar enjekte edilen embriyolardan yumurtadan çıkmaya başladığında (mevcut laboratuvar kurulumu için enjeksiyondan 21-25 gün sonra), günlük olarak kontrol edin ve yumurtadan çıkmış larvaları üstte bir ekran bulunan cam şişelere aktarın. Larvalar su altında yumurtadan çıkabilir ve ~ 1-2 hafta hayatta kalabilir.</li>
	<li>Yumurtalara görünür bir fenotiple sonuçlanabilecek bir yapı enjekte edilirse larvaları4 kez tarayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).</li>
	<li>Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).</li>
	<li>Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).</li>
	<li>Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).</li>
	<li>Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).</li>
	<li>Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).</li>
	<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
	<li>Criscione, F., O&#39;Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).</li>
	<li>Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).</li>
	<li>Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).</li>
	<li>Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).</li>
	<li>Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).</li>
	<li>Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene&#39;s organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).</li>
	<li>Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).</li>
	<li>Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gen&#233;&#39;s) organ in ixodid ticks. Tissue &#38; Cell. 21 (1), 113-122 (1989).</li>
	<li>Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental &#38; Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).</li>
	<li>Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu, erken kene embriyolarını başarılı bir şekilde enjekte etmek için geliştirilen ilk protokoldür. Diğer köklü böcek modellerinde embriyo enjeksiyonu ile karşılaştırılabilir olan ~% 4 -% 8'lik bir hayatta kalma oranı elde edilmiştir5.
Bu ilk protokol olduğundan, bu protokolün bireysel kene türlerine göre daha da rafine edileceği ve uzmanlaşacağı tahmin edilmektedir. Özellikle, enjeksiyon zamanlaması, embriyogeneze, özellikle de selülizasyonun zamanlamasına bağlı olarak ...

Keneler, çeşitli viral, bakteriyel, protozoan patojenleri ve nematodları 1,2 iletebilen tıbbi ve veterinerlik açısından önemli vektörlerdir. Doğu Amerika Birleşik Devletleri'nde, siyah bacaklı kene, Ixodes scapularis, Lyme hastalığı (LD) patojeni olan spiroket Borrelia burgdorferi'nin önemli bir vektörüdür. Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl 400.000'den fazla LD vakası bildirilmektedir ve bu da onu ABD'deki en iyi vektör kaynaklı bulaşıcı hastalık haline getirmektedir1. B. burgdorferi'ye ek olarak, dört bakteri (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi ve Ehrlichia muris eauclarensis), bir protozoan parazit (Babesia microti) ve bir virüs (Powassan virüsü) dahil olmak üzere altı mikroorganizma daha I. skapularisis tarafından bulaşır, bu da bu kene türünü önemli bir halk sağlığı sorunu haline getirir3 . Kene kaynaklı hastalıklar son yıllarda daha yaygın hale gelirken, keneler üzerine yapılan araştırmalar, kenelerin benzersiz biyolojisi ve genetik ve fonksiyonel genomik araçların uygulanmasıyla ilgili zorluklar nedeniyle sivrisinekler gibi diğer eklembacaklı vektörlerin gerisinde kalmıştır 4,5.
Gen düzenleme teknikleri, özellikle CRISPR / Cas9, artık fonksiyonel genomik çalışmaları model olmayan organizmalarda uygulanabilir hale getirmiştir. Bir organizmada kalıtsal mutasyonlar oluşturmak için, embriyo enjeksiyonu, germ çizgisi 6,7,8,9'u değiştirmek için yapılar sunmak için tercih edilen yöntem olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, yakın zamana kadar4, kene yumurtalarının embriyoyu öldürmeden enjekte edilmesinin çok zor veya hatta imkansız olduğu düşünülüyordu10,11. Yumurtalar üzerinde kalın bir balmumu tabakası, sert koryon ve yüksek oval içi basınç, kenelerde embriyo enjeksiyonunu engelleyen ana engellerden bazılarıydı. Yetişkin, kanla beslenen I. skapularis, 3-4 hafta boyunca 12 yumurtaya kadar (yaklaşık100 yumurta / gün) 2.000 yumurtadan oluşan tek bir kavrama biriktirir. Yumurtalar tek tek serilir ve her yumurta, glandüler Gené'nin organının çıkıntıları veya "boynuzları" tarafından salgılanan balmumu ile kaplanır13,14,15 annenin. Bu balmumu yumurtaları kurumaya karşı korur ve antimikrobiyal bileşikler içerir15. Kene yumurtalarını başarılı bir şekilde enjekte etmek için, balmumu tabakasını çıkarmak, koryonu yumuşatmak ve enjeksiyonun yumurtaya geri dönüşümsüz olarak zarar vermemesi için oval içi basıncı azaltmak için yumurtaları kurutmak önemlidir. Başarılı germline transformasyonu için embriyo enjeksiyonlarının kritik önemini anlayarak, bir CRISPR / Cas9 yapısı sunmak ve kararlı germline mutasyonları üretmek için kullanılabilecek I. scapularis için bir protokol geliştirilmiştir4. I. scapularis araştırmasına katkısına ek olarak, bu protokol diğer kene türleri için de optimize edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Alüminyum silikat kılcal damarlar, filamentli</td><td>Sutter aletleri</td><td>AF100-64-10</td><td>Embriyo enjeksiyonu</td></tr><tr><td>Benzalkonyum klorür %50 suda, 25 g</td><td>TCI-America</td><td>B0414</td><td>Embriyo tedavisi, 25 g yaklaşık 25 mL'dir</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>Enjeksiyon sonrası bakım</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Thomas Scientific</td><td>300-101</td><td>Genin organı manipülasyon</td></tr><tr><td>Lab Mendilleri</td><td>Genesee Scientific</td><td>88-115</td><td></td></tr><tr><td>Mikro yükleyici uçları</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Çekilen iğnelerin yüklenmesi</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Sutter aletleri</td><td>ROE-200</td><td>Embriyo enjeksiyonu</td></tr><tr><td>Mikroskobik slaytlar - düz, zemin kenarları</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-100</td><td>Embriyo hizalaması, zemin kenarları tercih edilir, eğimli kenarlar olabilir yumurtaları görünümden gizleyin</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>S23020-500.0</td><td>Embriyo tedavisi</td></tr><tr><td>İğne Çektirme</td><td>Sutter Aletleri</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kalıcı Çift taraflı bant</td><td>Scotch</td><td>34-8716-3417-5</td><td>Embriyo hizalama</td></tr><tr><td>Petri plakaları</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td>Enjeksiyon sonrası bakım</td></tr><tr><td>Tegaderm / Şeffaf film giydirme</td><td>3M Sağlık</td><td>1628</td><td>Embriyo hizalama</td></tr><tr><td>Tungsten iğneleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10130-10</td><td>Genin organ manipülasyonu</td></tr><tr><td>Tungsten Tel</td><td>Amazon</td><td>B08DNT7ZK3</td><td>Genin organ manipülasyonu</td></tr><tr><td>XenoWorks Dijital Mikroenjektör</td><td>Sutter aletleri</td><td>MPC-200</td><td>Embriyo enjeksiyonu</td></tr></tbody></table>

siyah ayaklı kene gen düzenleme için embriyo enjeksiyon tekniği, ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Keneler çeşitli viral, bakteriyel ve protozoan patojenleri iletebilir ve bu nedenle tıbbi ve veterinerlik açısından önemli vektörler olarak kabul edilir. Kene kaynaklı hastalıkların artan yüküne rağmen, keneler üzerindeki araştırmalar, fonksiyonel çalışmalar için genetik dönüşüm araçlarının kenelerin benzersiz biyolojisine uygulanmasındaki zorluklar nedeniyle böcek hastalığı vektörlerinin gerisinde kalmıştır. Genetik müdahaleler sivrisinek kaynaklı hastalıkları azaltmak için dikkat çekmektedir. Bununla birlikte, bu tür müdahalelerin gelişimi, embriyoların enjekte edilmesiyle stabil germline transformasyonu gerektirir. Böyle bir embriyo enjeksiyon tekniği, keneler de dahil olmak üzere şeliseratlar için eksiktir. Kene embriyoları üzerinde harici kalın balmumu tabakası, sert koryon ve yüksek oval içi basınç gibi çeşitli faktörler, daha önce kenelerde embriyo enjeksiyon protokolü gelişimini engelleyen bazı engellerdir. Mevcut çalışma bu engellerin üstesinden gelmiştir ve siyah bacaklı kene için bir embriyo enjeksiyon tekniği olan Ixodes skapularis burada anlatılmaktadır. Bu teknik, kararlı germ hattı dönüşümleri için CRISPR/Cas9 gibi bileşenler sunmak için kullanılabilir.

Bu makalede I. scapularis için başarılı bir embriyo enjeksiyon protokolü anlatılmaktadır. Yumurtlayan dişiler, kısmen mumlanmış yumurtaların kurumasını önlemek için yüksek nemde tutuldu. Balmumu tabakası, gravid dişinin Gen'in organını (balmumu bezi) ablatarak kene embriyolarını enjekte etmek için çıkarıldı (Şekil 1A-E). Daha kısa boyunlu alüminosilikat cam iğneler kullandık (Şekil 2). Bu şekil, bölü yumurta enjeksiyonl...

Mevcut protokol, kene embriyolarının enjekte edilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Embriyo enjeksiyonu, transgenik çizgiler oluşturmak için genetik manipülasyon için tercih edilen tekniktir.

Siyah Ayaklı Kene Gen Düzenleme için Embriyo Enjeksiyon Tekniği, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Bu, bir Chelicerata türü için ilk embriyo enjeksiyon protokolüdür. Kene embriyolarını enjekte etme yeteneği, özellikle kene gen fonksiyonu ve kene patojen etkileşimleri ile ilgili çalışmalar olmak üzere birçok araştırma hattını açacaktır. Bu teknik, kene genlerinin fonksiyonel çalışmaları üzerinde gelecekteki çalışmalara izin verir ve gen tahrik sistemlerini kullanarak kene popülasyonu kontrolü için bir temel sağlar.Bu yöntem, keneler ve moleküler düzeyde barındırdıkları patojenler arasındaki etkileşimin anlaşılmasını kolaylaştıracaktır. Bu, Lyme hastalığı ve diğer patojenler için aşıların geliştirilmesinde kullanılabilecek proteinleri tanımlamamızı sağlayacaktır. Kene patojen etkileşimleri ve beslenme sırasında kene yoluyla konakçılara patojen iletimi gibi çeşitli araştırma alanları bu çalışmadan fayda sağlayacaktır.Kenelerin konakçının bağışıklık tepkisinden nasıl kaçtıkları ve DNA onarım mekanizmalarındaki farklılıklar gibi daha temel sorular da şimdi anlaşılabilir. Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce kene biyolojisinin anlaşılması gereken birkaç yönü vardır. Embriyonun yüksek iç basıncı, bir iğne ile dokunulduğunda patlamaya neden olur.Embriyoları enjeksiyon için hazırlamak çok önemlidir. Başlamak için, enjeksiyonlardan bir hafta önce yumurtlamanın başlatılması için dişileri dört santigrat dereceden 27 santigrat derece inkübatöre aktarın. Dişiler yumurtlamaya başladığında üç ila dört gün sonra, dişileri Gene'in organ ablasyonuna hazırlarken ince uçlu bir boya fırçası kullanarak yumurtaları çıkarın.Bezi boşaltmak için, gravid keneyi mikroskop altında bir cam slayt üzerinde, ağız kısımlarının hem ventral hem de dorsal taraflarda görülebilecek şekilde düzenleyin. Daha sonra dorsal taraftaki ağız kısımlarının arkasındaki alanı dikkatlice delin ve forseps kullanarak ventral tarafa baskı uygulayın. Tüy bırakmayan bir mendilin kenarını yerleştirin ve delinme bölgesinden çıkan sıvı balmumunu çıkarın.Alternatif olarak, bezi diseksiyonla boşaltmak yerine, kene ağzı kısımlarının etrafında doku yapıştırıcısı gibi yapıştırıcılar kullanılabilir. Dişiler tekrar yumurta bırakmaya başladığında, taze birikmiş yumurtaları toplamak ve bunları 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirmek için ince bir boya fırçası kullanın. Sıfır ila 18 saatlik yumurta içeren tüpe yaklaşık 200 mikrolitre% 5 benzalkonyum klorür suyu ekleyin.Yumurtaların tüpün dibine yerleşmesini önlemek için yumurtaları boya fırçasıyla beş dakika boyunca yavaşça döndürün ve süpernatantı bir mikro pipet kullanarak çıkarın ve yumurtaları tüpün içinde geride bırakın. Yumurta içeren tüpe yaklaşık 200 mikrolitre damıtılmış su ekleyin. Bir boya fırçası ile girdap yapın ve bir mikro pipet kullanarak suyu mikro santrifüj tüpünden çıkarın.Damıtılmış suyla yıkadıktan sonra, yaklaşık 200 mikrolitre% 5 sodyum klorür ekleyin ve beş dakika boyunca bir boya fırçasıyla hafifçe döndürün. Ardından, çözeltiyi beş dakika sonra tüpten çıkarın ve yumurtaları iki kez damıtılmış suyla yıkayın. Daha sonra, yumurta içeren mikro santrifüj tüpüne yaklaşık 100 mikrolitre% 1 sodyum klorür çözeltisi ekleyin.İlk olarak, iki cam mikroskop slaytını birbirine yapıştırın, çift taraflı bir bant kullanarak yumurtaların hizalanmasını desteklemek için yaklaşık 0,5 santimetrelik bir boşluk bırakın ve slaytlar arasındaki boşlukta çift taraflı bant üzerine bir parça şeffaf film pansumanı uygulayın. Ardından, bir boya fırçası kullanarak slayt kurulumunda bir seferde sekiz ila 10 yumurta hizalayın. Daha sonra slaytı hizalanmış yumurtalarla bileşik mikroskop aşamasına yerleştirin ve% 1'lik sodyum klorür çözeltisini, depolandıkları tüy bırakmayan bir mendil parçası kullanarak çıkarın.Doldurulmuş enjeksiyon iğnesini mikro manipülatöre bağlı bir mikro enjektöre takın. Daha sonra, mikro enjektör üzerinde yüksek basınç ayarı kullanarak iğneyi yumurta yüzeyine hafifçe sürtünerek açın. İğne açıldıktan sonra, iğnenin açılmasına bağlı olarak mikro enjektörün basıncını azaltın.Ardından, slayttaki tüm yumurtaları mümkün olduğunca çabuk 10 ila 15 derecelik bir açıyla enjekte edin, ayak pedalına hızlı bir şekilde basın ve slaytı nemli bir kağıt havlu ile bir Petri kabında hemen yüksek nem koşullarına getirin. Enjekte edilen embriyoları içeren slaytı nemli filtre kağıdı ile kaplı büyük bir Petri kabına yerleştirdikten beş ila altı saat sonra, enjekte edilen embriyolar eklenmiş şeffaf film pansumanına küçük bir damla damıtılmış su ekleyin. Ardından, bir boya fırçası kullanarak yumurtaları yavaşça yerinden oynatın.Daha sonra, yumurtaları küçük bir Petri kabına aktarın ve damıtılmış suya batırın. Yumurtaları suya batırılmış halde tutun, Petri kabını% 90'dan fazla bağıl nemde 27 santigrat derecede bir inkübatörde altı litrelik plastik bir kutuya yerleştirin. Larva, enjeksiyondan 21 ila 25 gün sonra enjekte edilen embriyolardan yumurtadan çıkmaya başladığında, günlük olarak kontrol edin ve yumurtadan çıkan larvaları üstte bir ekran bulunan cam şişelere aktarın.Sonuçlar, yumurtaların 12 ila 18 saatlik embriyogenezin başlarında enjekte edilmesinin ve yumurtanın daha uzun ekseninin slaytın kenarına dik olarak hizalanmasının, enjekte edilen yumurtaların daha yüksek bir hayatta kalma oranına neden olduğunu göstermiştir. Enjekte edilen tüm yumurtaların% 8.5'ine kadar hayatta kaldı ve larva yumurtadan çıktı. Bu prosedüre başlamadan önce, 2.4. adımları, balmumunun ana keneden çıkarılmasını ve 3.1 ila 3.4 arasındaki adımları, embriyonun koryonunun benzalkonyum klorür ile yumuşatılmasını ve embriyonun başarılı embriyo enjeksiyonunu sağlamak için sodyum klorür çözeltileri ile kurutulmasını hatırlamak önemlidir.Bu yöntem öncelikle kene gen düzenlemesi için geliştirilmiştir ve bu, kene gen fonksiyonunu anlamamıza yardımcı olacak nakavtlar ve vuruşlar yapmamıza izin verecektir. Bu teknik, kene araştırmalarına uygulanacak diğer birçok organizma için mevcut gen düzenleme araçlarının kullanılmasına izin verecektir. Ve bu kene moleküler biyoloji araştırmalarını hızlandıracaktır.

embryo-injection-technique-for-gene-editing-black-legged-tick-ixodes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, Nijole Jasinskiene Dang humması için vektörler transgenik Aedes aegypti sivrisinek, üretmek için kullanılan yöntem gösteriyor. Doğru, mikroenjeksiyon iğneler hazırlanması embriyolar dessicating ve mikroenjeksiyon teknikleri gösterilmektedir.

Transgenik Sivrisinekler Edinme A. aegypti Embriyolar Mikroenjeksiyon

Bu videoda, embriyo mikroenjeksiyon tekniği ile Anopheles gambiae sivrisineğinin embriyosuna gen sürücü yapısının verilmesini gösteriyoruz. Bu prosedür, homolog rekombinasyon yoluyla iletilen DNA yapısının, dönüştürülmüş sivrisinek popülasyonu oluşturmak için germ hattı hücrelerine entegrasyonuna izin verir.

Sivrisinek Embriyo Mikroenjeksiyonu: Germ Hattı Mutasyonları Oluşturmak için Anopheles Gambiae'nin Embriyo Sarısına Ekzojen DNA Verme Tekniği

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) dünya çapında bir tarım zararlısıdır. Biyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılması, medfly popülasyonlarını kontrol etmenin ve böylece ekonomik etkiyi azaltmanın anahtarıdır. Embriyo mikroenjeksiyonu, bu türde hem germ hattı transformasyonuna hem de ters genetik çalışmalara olanak sağlayan temel bir araçtır.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Sağlıklı laboratuarda yetiştirilen kenelerin üretimi, kene biyolojisi ve kene patojen etkileşimleri üzerine çalışmalar için gereklidir. Burada, fare için düşük maliyetli ve stresli olgunlaşmamış kene beslemesi için basit bir protokolü gösteriyoruz.

yetiştirme<em&gt; Geyik kenesi,</em&gt; Siyah Ayaklı Tik Tak: Fare üzerinde Olgunlaşmamış Evreleri Besleme

Mikroenjeksiyon Nasonia vitripennis embriyo kalıtsal genom değişiklikler oluşturmak için temel bir yöntemdir. Burada açıklanan mikroenjeksiyon ve büyük ölçüde bu organizma gelecekteki genom manipülasyon kolaylaştıracaktır Nasonia vitripennis embriyo nakli için detaylı bir işlemdir.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

Burada kriket yumurtaları enjekte etmek için bir protokol salıyoruz, kriketteki birçok deneyde temel bir yöntem olarak hizmet veren bir teknik, RNA paraziti ve genomik manipülasyon dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere.

Enjekte Gryllus bimaculatus Yumurta

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Genom düzenlemeden sonra mutant suşları oluşturmak ve sürdürmek için yumurtaların yetiştirilmesi, mikroenjeksiyonu ve ateş aşındırıcı Thermobia domestica'nın verimli çiftleşmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Firebrat Thermobia domestica'da Genom Düzenleme için Yumurta Mikroenjeksiyon ve Verimli Çiftleşme

Böcek ösosyalliğinin birçok özelliği, koloni içi iletişime ve işbölümüne dayanır. Karınca embriyolarındaki anahtar düzenleyici genlerin mikroenjeksiyon ve CRISPR aracılı mutagenez yoluyla genetik manipülasyonu, ösosyal böceklerde özgecil davranışın doğası hakkında fikir verir.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

Bu makalenin genel amacı, tavuk embriyolarına eksojen materyallerin hücre içi enjeksiyonunda nasıl gerçekleştirileceğini tanımlamaktır. Bu yaklaşım, tavuk embriyolarının gelişimsel biyolojisini incelemek için çok yararlıdır.

Burada: Ovo Tavuk Embriyolarında İntravasküler Enjeksiyon

Keşfedin, Ixodes scapularis embriyo enjeksiyon protokolü ile kene gen düzenleme tekniklerini. Bu yöntem, kene gen fonksiyonları ve patojen etkileşimlerini moleküler düzeyde anlamak için temel oluşturur.

Siyah Ayaklı Kene Gen Düzenleme için Embriyo Enjeksiyon Tekniği, Ixodes scapularis

Daha fazla video keşfet