Siyah Ayaklı Kene Gen Düzenleme için Embriyo Enjeksiyon Tekniği, Ixodes scapularis

Bu, bir Chelicerata türü için ilk embriyo enjeksiyon protokolüdür. Kene embriyolarını enjekte etme yeteneği, özellikle kene gen fonksiyonu ve kene patojen etkileşimleri ile ilgili çalışmalar olmak üzere birçok araştırma hattını açacaktır. Bu teknik, kene genlerinin fonksiyonel çalışmaları üzerinde gelecekteki çalışmalara izin verir ve gen tahrik sistemlerini kullanarak kene popülasyonu kontrolü için bir temel sağlar.

Bu yöntem, keneler ve moleküler düzeyde barındırdıkları patojenler arasındaki etkileşimin anlaşılmasını kolaylaştıracaktır. Bu, Lyme hastalığı ve diğer patojenler için aşıların geliştirilmesinde kullanılabilecek proteinleri tanımlamamızı sağlayacaktır. Kene patojen etkileşimleri ve beslenme sırasında kene yoluyla konakçılara patojen iletimi gibi çeşitli araştırma alanları bu çalışmadan fayda sağlayacaktır.

Kenelerin konakçının bağışıklık tepkisinden nasıl kaçtıkları ve DNA onarım mekanizmalarındaki farklılıklar gibi daha temel sorular da şimdi anlaşılabilir. Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce kene biyolojisinin anlaşılması gereken birkaç yönü vardır. Embriyonun yüksek iç basıncı, bir iğne ile dokunulduğunda patlamaya neden olur.

Embriyoları enjeksiyon için hazırlamak çok önemlidir. Başlamak için, enjeksiyonlardan bir hafta önce yumurtlamanın başlatılması için dişileri dört santigrat dereceden 27 santigrat derece inkübatöre aktarın. Dişiler yumurtlamaya başladığında üç ila dört gün sonra, dişileri Gene'in organ ablasyonuna hazırlarken ince uçlu bir boya fırçası kullanarak yumurtaları çıkarın.

Bezi boşaltmak için, gravid keneyi mikroskop altında bir cam slayt üzerinde, ağız kısımlarının hem ventral hem de dorsal taraflarda görülebilecek şekilde düzenleyin. Daha sonra dorsal taraftaki ağız kısımlarının arkasındaki alanı dikkatlice delin ve forseps kullanarak ventral tarafa baskı uygulayın. Tüy bırakmayan bir mendilin kenarını yerleştirin ve delinme bölgesinden çıkan sıvı balmumunu çıkarın.

Alternatif olarak, bezi diseksiyonla boşaltmak yerine, kene ağzı kısımlarının etrafında doku yapıştırıcısı gibi yapıştırıcılar kullanılabilir. Dişiler tekrar yumurta bırakmaya başladığında, taze birikmiş yumurtaları toplamak ve bunları 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirmek için ince bir boya fırçası kullanın. Sıfır ila 18 saatlik yumurta içeren tüpe yaklaşık 200 mikrolitre% 5 benzalkonyum klorür suyu ekleyin.

Yumurtaların tüpün dibine yerleşmesini önlemek için yumurtaları boya fırçasıyla beş dakika boyunca yavaşça döndürün ve süpernatantı bir mikro pipet kullanarak çıkarın ve yumurtaları tüpün içinde geride bırakın. Yumurta içeren tüpe yaklaşık 200 mikrolitre damıtılmış su ekleyin. Bir boya fırçası ile girdap yapın ve bir mikro pipet kullanarak suyu mikro santrifüj tüpünden çıkarın.

Damıtılmış suyla yıkadıktan sonra, yaklaşık 200 mikrolitre% 5 sodyum klorür ekleyin ve beş dakika boyunca bir boya fırçasıyla hafifçe döndürün. Ardından, çözeltiyi beş dakika sonra tüpten çıkarın ve yumurtaları iki kez damıtılmış suyla yıkayın. Daha sonra, yumurta içeren mikro santrifüj tüpüne yaklaşık 100 mikrolitre% 1 sodyum klorür çözeltisi ekleyin.

İlk olarak, iki cam mikroskop slaytını birbirine yapıştırın, çift taraflı bir bant kullanarak yumurtaların hizalanmasını desteklemek için yaklaşık 0,5 santimetrelik bir boşluk bırakın ve slaytlar arasındaki boşlukta çift taraflı bant üzerine bir parça şeffaf film pansumanı uygulayın. Ardından, bir boya fırçası kullanarak slayt kurulumunda bir seferde sekiz ila 10 yumurta hizalayın. Daha sonra slaytı hizalanmış yumurtalarla bileşik mikroskop aşamasına yerleştirin ve% 1'lik sodyum klorür çözeltisini, depolandıkları tüy bırakmayan bir mendil parçası kullanarak çıkarın.

Doldurulmuş enjeksiyon iğnesini mikro manipülatöre bağlı bir mikro enjektöre takın. Daha sonra, mikro enjektör üzerinde yüksek basınç ayarı kullanarak iğneyi yumurta yüzeyine hafifçe sürtünerek açın. İğne açıldıktan sonra, iğnenin açılmasına bağlı olarak mikro enjektörün basıncını azaltın.

Ardından, slayttaki tüm yumurtaları mümkün olduğunca çabuk 10 ila 15 derecelik bir açıyla enjekte edin, ayak pedalına hızlı bir şekilde basın ve slaytı nemli bir kağıt havlu ile bir Petri kabında hemen yüksek nem koşullarına getirin. Enjekte edilen embriyoları içeren slaytı nemli filtre kağıdı ile kaplı büyük bir Petri kabına yerleştirdikten beş ila altı saat sonra, enjekte edilen embriyolar eklenmiş şeffaf film pansumanına küçük bir damla damıtılmış su ekleyin. Ardından, bir boya fırçası kullanarak yumurtaları yavaşça yerinden oynatın.

Daha sonra, yumurtaları küçük bir Petri kabına aktarın ve damıtılmış suya batırın. Yumurtaları suya batırılmış halde tutun, Petri kabını% 90'dan fazla bağıl nemde 27 santigrat derecede bir inkübatörde altı litrelik plastik bir kutuya yerleştirin. Larva, enjeksiyondan 21 ila 25 gün sonra enjekte edilen embriyolardan yumurtadan çıkmaya başladığında, günlük olarak kontrol edin ve yumurtadan çıkan larvaları üstte bir ekran bulunan cam şişelere aktarın.

Sonuçlar, yumurtaların 12 ila 18 saatlik embriyogenezin başlarında enjekte edilmesinin ve yumurtanın daha uzun ekseninin slaytın kenarına dik olarak hizalanmasının, enjekte edilen yumurtaların daha yüksek bir hayatta kalma oranına neden olduğunu göstermiştir. Enjekte edilen tüm yumurtaların% 8.5'ine kadar hayatta kaldı ve larva yumurtadan çıktı. Bu prosedüre başlamadan önce, 2.4. adımları, balmumunun ana keneden çıkarılmasını ve 3.1 ila 3.4 arasındaki adımları, embriyonun koryonunun benzalkonyum klorür ile yumuşatılmasını ve embriyonun başarılı embriyo enjeksiyonunu sağlamak için sodyum klorür çözeltileri ile kurutulmasını hatırlamak önemlidir.

Bu yöntem öncelikle kene gen düzenlemesi için geliştirilmiştir ve bu, kene gen fonksiyonunu anlamamıza yardımcı olacak nakavtlar ve vuruşlar yapmamıza izin verecektir. Bu teknik, kene araştırmalarına uygulanacak diğer birçok organizma için mevcut gen düzenleme araçlarının kullanılmasına izin verecektir. Ve bu kene moleküler biyoloji araştırmalarını hızlandıracaktır.