Name: Yetişkin Afrika Turkuaz Killifishin Beyin Dokusundan Çekirdeklerin Nazik İzolasyonu, Yaşlanma Araştırmaları için Doğal Kısa Ömürlü Bir Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Öğrenin, Afrika turkuaz killifish beyninden yüksek kaliteli çekirdek izolasyonu için nazik bir yöntem. Bu protokol, tek hücreli RNA dizileme ve ATAC-seq gibi uygulamalarla beyin yaşlanmasını araştırmayı kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bazı paneller BioRender.com ile oluşturuldu. Laboratuvarımızdaki bu çalışma, B.T.'ye NIA T32 AG052374 Doktora Sonrası Eğitim Bursu, Simons Yaşlanma Beyinde Plastisite için Simons İşbirliği'nin bir parçası olarak Simons Vakfı'ndan bir hibe, Navigage Vakfı'ndan bir pilot hibe ve B.A.B.'ye Hanson-Thorell Ailesi ödülü ile desteklenmiştir.

<ol><li>Yankner, B. A., Lu, T., Loerch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The aging brain.</a> Annual Review of Pathology. 3 (1), 41-66 (2008).</li>
<li>Hu, C. K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+turquoise+killifish%3A+A+research+organism+to+study+vertebrate+aging+and+diapause%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause.</a> Aging Cell. 17 (3), 12757(2018).</li>
<li>McKay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+feeding+system+for+the+African+killifish+reveals+effects+of+dietary+restriction+on+lifespan+and+allows+scalable+assessment+of+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An automated feeding system for the African killifish reveals effects of dietary restriction on lifespan and allows scalable assessment of associative learning.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Valenzano, D. R., Terzibasi, E., Cattaneo, A., Domenici, L., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+affects+longevity+and+age-related+locomotor+and+cognitive+decay+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Temperature affects longevity and age-related locomotor and cognitive decay in the short-lived fish Nothobranchius furzeri.</a> Aging Cell. 5 (3), 275-278 (2006).</li>
<li>Vanhunsel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+killifish+visual+system+as+an+in+vivo+model+to+study+brain+aging+and+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Aging+and+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The killifish visual system as an in vivo model to study brain aging and rejuvenation.</a> NPJ Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 22(2021).</li>
<li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).</li>
<li>Ziffra, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+epigenomics+reveals+mechanisms+of+human+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell epigenomics reveals mechanisms of human cortical development.</a> Nature. 598 (7879), 205-213 (2021).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Kalish, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA+sequencing+of+mouse+auditory+cortex+reveals+critical+period+triggers+and+brakes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA sequencing of mouse auditory cortex reveals critical period triggers and brakes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11744-11752 (2020).</li>
<li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).</li>
<li>Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+surgically+resected+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100844(2021).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+fresh+frozen+brain+tumors+for+single-nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> Journal of Visualized Experiments. (162), e61542(2020).</li>
<li>Saunders, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diversity+and+specializations+among+the+cells+of+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular diversity and specializations among the cells of the adult mouse brain.</a> Cell. 174 (4), 1015-1030 (2018).</li>
<li>Genomics, X. Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing & Tissues for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k">https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k</a> (2021).</li>
<li>Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+tissue+nuclei+extraction+%28for+10xV3+snSEQ%29+V.2%5BTitle%5D)+AND+%22protocols.io%22%5BJournal%5D)">Frozen tissue nuclei extraction (for 10xV3 snSEQ) V.2.</a> protocols.io. , (2020).</li>
<li>Nuclei Isolation from Adult Mouse Brain Tissue for Single Cell RNA Sequencing. 10xGenomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing</a> (2022).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>What are the best practices for working with nuclei samples for 3' single-cell gene expression. 10xGenomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression-">https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression-</a> (2022).</li>
<li>Rocks, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+chromatin+accessibility+analysis+in+the+mouse+and+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific chromatin accessibility analysis in the mouse and human brain.</a> Epigenetics. 17 (2), 202-219 (2022).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada sunulan protokol, killifish beyinlerinden yüksek kaliteli çekirdekleri yeniden üretmek için kullanılabilir. Bu protokolün killifish beyni için özel olarak tasarlanması gerekiyordu, çünkü killifish beyinlerine uygulanan tipik memeli tabanlı beyin çekirdeği izolasyon protokolleri sürekli olarak elimizde düşük çekirdek kalitesine neden oldu. Bunun, killifish beyninin memeli meslektaşlarına kıyasla daha düşük göreceli miyelin içeriğinden kaynaklandığından şüpheleniyoruz, bu da memeli beyin hücresi lizisi için gerekli olan sert koşullara yanıt olarak lize olacak ve kümelenecektir. Bu protokol, omurgalı beyin yaşlanmasının maliyet ve zaman etkin bir modelinde tek hücre düzeyinde beyin yaşlanmasının araştırılmasını kolaylaştırdığı için yaşlanma ve killifish alanlarında bir ilerlemedir. 
Bu protokol taze veya dondurulmuş numuneler için sağlamdır, ancak taze veya dondurulmuş doku kullanırken aşağı akış uygulamaları dikkate alınmalıdır. Dondurulmuş doku, numuneler toplanırken aylarca toplanıp saklanabildiği için genellikle uygundur. Bu tür numuneler snRNA-seq gibi uygulamalar için güvenle kullanılabilir. Bununla birlikte, numunelerin dondurulması nükleer yapıyı ve dolayısıyla ATAC-seq21 ile kromatin manzarasını doğru bir şekilde ölçme yeteneğini bozabilir. Bu nedenle, toplu ATAC-seq veya snATAC-seq gibi aşağı akış uygulamaları için, donmuş beyinler yerine taze disseke edilmiş beyinlerin kullanılması önerilir. Ek olarak, beyin homojenizasyonundan sonraki tüm adımlar paralel olarak gerçekleştirilebildiğinden, bu protokol makul bir zaman diliminde birden fazla numunenin çalıştırılmasına uygundur, böylece buz üzerinde uzun süreli inkübasyonun neden olduğu RNA bozulmasını sınırlar.
Ayrıca, çekirdek ekstraksiyonu yapıldıktan sonra tamponların taze (saatler içinde) hazırlanması zorunludur. BSA'nın yanı sıra deterjanların da protokole başlamadan hemen önce tamponlara eklenmesi gerektiğini bulduk. Sadece tuz (PBS, NaCl, vb.) içeren tamponlar konsantre olarak yapılabilir, filtre sterilize edilebilir (0,22 μm) ve oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir. BSA stok çözeltileri, çekirdek ekstraksiyonundan sonraki günler içinde (bir tozdan hazırlanmışsa) 4 ° C'de hazırlanabilir, sterilize edilebilir ve saklanabilir, ancak protokolü üstlenmeden hemen önce bu protokolde kullanılan tamponlara her zaman eklenmelidir. Ancak BSA çözümlerinin protokol gününde hazırlanmasını öneririz. Üçüncü bir taraftan önceden hazırlanmış BSA çözeltileri kullanılıyorsa, taze, açılmamış şişelerin kullanılması tavsiye edilir. Taze BSA kullanımı genellikle çekirdek hazırlıklarında daha düşük enkaz içeriğine yol açar.
Taze veya dondurulmuş numuneler girdi olarak kullanılsa da, çekirdek izolasyonunu takiben çekirdek kalitesini değerlendirmek önemlidir. Bu protokol aşırı lizi önlemek için özel olarak tasarlanmış olsa da, çekirdek kalitesi kaybının en yaygın nedeni budur. Aşırı lizis, lizis tamponunda çok fazla zaman harcanmasından, standart bir delikli pipet ucuyla aşırı pipetleme gibi çekirdeklerin aşırı kaba işlenmesinden veya çekirdek izolasyonu ile aşağı akış uygulamaları arasında (>1 saat) aşırı miktarda zaman harcanmasından kaynaklanabilir. Aşırı lize edilmiş çekirdekler genellikle DNA'yı sızdıran ve kümelenmeye neden olan hasarlı nükleer çevrelere sahip olacaktır (Şekil 2B). Bu, artan sayıda multiplete yol açacak ve aşağı akış uygulamalarına, özellikle snRNA-seq'e müdahale edecek arka plan nükleik asitlerine katkıda bulunacaktır. Her iki nitelik de çekirdek izolasyonunu takiben mikroskopi ile değerlendirilebilir. Aşırı nükleer kümelenme gözlenirse, aşırı lizis olasılığını azaltmak için lizis adımı inkübasyonunu kısaltmaya çalışmanızı öneririz. Çekirdek singlet'larını arttırmak için alternatif bir yöntem olarak, floresan destekli hücre sıralama (FACS), bu protokolün aşağı akış yönündeki tekletleri zenginleştirmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, donmuş dokudan zaten kırılgan çekirdeklerle çalışırken, ayıklama sırasında meydana gelen kesme stresinin nükleer kopmanın artmasına ve dolayısıyla ortam RNA / DNA'sının artmasına neden olabileceğini not ediyoruz. Ek olarak, birden fazla numuneyi işlerken çekirdekler için bir FACS verim sıralaması çalıştırmak için gereken sürenin, diğer numuneler sıralanırken tüm çekirdek numunelerinin saatlerce buz üzerinde kalmasını gerektireceğini not ediyoruz. Bu nedenle, FACS yaklaşımına paralel olarak birden fazla numuneyi işlerken artan bekleme süreleri, genel olarak azalmış çekirdek kalitesine yol açabilir ve RNA bozulma riskini artırabilir. Bu nedenle, eğer FACS azaltılmış çift oran için isteniyorsa, verim sıralamasından sonra enkaz içeriğinin tekrar kontrol edilmesini ve potansiyel bir uyarı olarak tek hücreli RNA-seq uygulamaları için olası düşük RNA kalitesinin dikkate alınmasını öneririz. 
Çekirdek sayılarının ve singlet oranının doğru bir tahmini, neredeyse tüm aşağı akış "omik" uygulamaları için gereklidir ve son derece önemlidir. Çekirdekleri boyutlarına göre kolayca geçit ve sayma yeteneği nedeniyle, akış sitometrisi, değerlendirdiğimiz çekirdekleri saymanın en doğru yöntemidir. Alternatif olarak, Invitrogen'in Kontes 2 FL Otomatik Hücre Sayacı veya DeNovix CellDrop Otomatik Hücre Sayacı gibi hücre sayaçlarını kullanarak çekirdekleri ölçebilir. Not etmek gerekirse, Invitrogen'in Kontes 2 FL Otomatik Hücre Sayacı ve çok daha az ölçüde DeNovix, enkazı çekirdek olarak sayarak çekirdek sayılarını abartma eğilimindedir, bu da manuel boyut geçidinin gerekli olabileceği anlamına gelir. Ayrıca, akış sitometresi, çekirdeğin saflığını kolayca değerlendirmesini sağlar. Tekli çekirdeklerin multiplet çekirdeklere karşı göreceli oranını, mikroskopi ile zor olan nicel bir şekilde ayırt edebilir. Bu, snRNA-seq ve snATAC-seq için hayati öneme sahiptir, çünkü bu protokoller, aşağı akış analizlerinin dışında tutulması gereken çoklu numune fazlalığından muzdarip olacaktır. Çokluklara ek olarak, "enkaz" ın (parçalanmış çekirdekler, hücresel enkaz) göreceli oranı, akış sitometrisi ile ölçülebilir ve nispeten düşük olmalıdır, çünkü bu malzeme genellikle bir arka plan sinyaline katkıda bulunabilecek ve tek çekirdek "omik" verilerini bozabilecek kirletici nükleik asitler içerir. 
Daha önce tarif edilen çekirdek izolasyon protokollerinde olduğu gibi, orijinal dokudaki hücre tiplerinin oranları, çekirdek hazırlığı19'da sadık bir şekilde özetlenmeyebilir ve bu nedenle dikkatle yorumlanmalıdır. Tüm teleostlar gibi, Afrika turkuaz killifish, çekirdek hazırlığında da temsil edilmesi beklenen çekirdekli eritrositlere sahiptir. Bu çekirdekler, snRNA-seq ve snATAC-seq veri kümelerinde, hemoglobin genlerinin daha yüksek ekspresyonu/erişilebilirliği ile tanımlanabilir ve istenirse hesaplamalı olarak dışlanabilir.

Omurgalı beyin yaşlanmasının mekanizmalarını anlamak, Alzheimer ve demans 1 gibi yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıkların ele alınmasında kritik önemesahiptir. Afrika turkuaz killifish (Nothobranchus furzeri), esaret altında yetiştirilebilecek en kısa ömürlü omurgalıdır ve kısa ömrü ve yaşa bağlı bilişsel bozukluğu nedeniyle, mükemmel bir beyin yaşlanma modelidir 2,3,4,5. Son zamanlarda, tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-seq) ve dizileme ile transpozaz erişimli kromatin için tek çekirdek testi (snATAC-seq) gibi tek hücreli "omik" teknolojilerinin ortaya çıkması, araştırmacıların yaşlanan beyni benzeri görülmemiş bir çözünürlükte sorgulamalarına izin vermiştir 6,7,8. Bu yöntemler çekirdek izolasyonuna dayanır, çünkü nöronlar gibi beyin hücrelerinin iyileşmesi genellikle 6,7,8,9,10'u izole etmek için çok zordur. Bununla birlikte, yayınlanan çekirdek izolasyon protokollerinin çoğu, memeli model organizmalar11,12,13,14,15 için optimize edilmiştir. Bu nedenle, şu anda yaşlanma araştırması2 alanında gelecek vaat eden yeni bir model organizma olarak killifish'teki beyin çekirdeklerini izole etmek için karşılanmamış bir ihtiyaç olduğundan, bu protokolün amacı, yüksek kaliteli çekirdekleri donmuş beyin killifish dokusundan izole etmek için bir yöntem oluşturmaktır.
Burada, yüksek kaliteli çekirdekleri killifish beyinlerinden izole etmek için yaygın olarak bulunan malzemeleri kullanan akıcı ve sağlam bir iş akışı oluşturulmuştur. Bu protokol, Afrika turkuaz killifish'in düşük miyelin içerikli beyinlerine, donmuş dokunun kırılganlığına ve dizileme ile ilgili uygulamalar için ortam enkaz içeriğini azaltma ihtiyacına uyum sağlamak için fare beyinleri için 10x Genomik protokolünden değiştirildi16. Gerçekten de, memeli beyin dokusu17,18 için daha önce optimize edilmiş protokoller, dondurulmuş killifish beyinlerinde kullanıldığında düşük çekirdek kalitesine (yani aşırı liziz) ve / veya yüksek enkaz içeriğine yol açarak, mikroakışkanlar kullanan tek çekirdekli RNA-seq önerilerine göre snRNA-seq ile kullanım için uygun değildir (Ek Şekil 1).
Çekirdek izolasyonuna ek olarak, mikroskopi ve akış sitometrisi ile çekirdek kalitesinin ve veriminin nasıl değerlendirileceğini gösteriyoruz. Bu makalede, hem en iyi hem de en uygun olmayan sonuçlara örnekler sağlanmakta ve sorun giderme anlatılmaktadır. Bu protokol, dondurulmuş killifish beyinleri için tasarlanmış ve optimize edilmiştir, ancak taze disseke edilmiş killifish örneklerinde büyük değişiklikler yapılmadan da kullanılabilir. Bu yöntem kullanılarak izole edilen Killifish beyin çekirdekleri, aşağı akış uygulaması olarak tek çekirdekli RNA-seq'te (snRNA-seq) kullanım için optimize edilmiştir, ancak snATAC-seq ve bulk ATAC-seq'te kullanım için de uygun olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>% 0.4 Tripan Mavisi çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Bioland</td><td>PBS01-03</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konik Santrifüj Tüpü</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Doku Öğütücü</td><td>Kimble</td><td>885300-0002</td><td>Dounce Homojenizatör</td></tr><tr><td>5 mL Polistiren Yuvarlak Tabanlı Boru</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>5M Sodyum Klorür, Moleküler Biyoloji Sınıfı</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Durulama Solüsyonu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Bu, 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA'ya (akış sitometrisi için kullanılır) karşılık gelir</td></tr>. <tr><td>Kalıntı Temizleme Çözeltisi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-398</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBInd Tüpü</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Echo Revolve mikroskobu (60x objektif ile takılı)</td><td>Echo</td><td>NA</td><td>Katalog numarası yok; Çekirdekleri görsel olarak incelemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Falcon Yuvarlak Tabanlı Polistiren Tüpler, 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>FACS tüp</td></tr><tr><td>FLOWMI Hücre Süzgeçleri, 40 &mu; M</td><td>SP Bel-Art</td><td>136800040</td><td>Protokolde uç filtreler olarak anılır</td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258146-500 mL</td><td>TRIS pH'ını 8.0'dan 7.4'e düşürmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Leica EZ4 diseksiyon kapsamı</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>Katalog numarası</td></tr><tr><td>yok MACS BSA stok çözümü</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130091376</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 &; M)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analiz Cihazı 10 Akış Sitometresi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>NA</td><td>Katalog numarası yok</td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür, Hekzahidrat, Moleküler Biyoloji Sınıfı (Toz)</td><td>Millipore</td><td>442611</td><td></td></tr><tr><td>Megafüj 16R Santrifüj</td><td>ThermoScientific</td><td>75003629</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Kapaklı Cam</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Micro Slides Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Yedek Roche</td><td></td><td>(Roche) 11332473001/ Katalog: 983739 P Kodu: -102368106 (Sigma Aldrich)</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Yüzey Aktif-Amper Deterjan</td><td>Çözeltisi ThermoFisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen HyPure Moleküler Biyoloji Sınıfı Su</td><td>HyClone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>NxGen RNase İnhibitör (50.000 U)</td><td>Lucigen</td><td>30281-2</td><td></td></tr><tr><td>Propidyum İyodür çözeltisi</td><td>MBL</td><td>FP00010020</td><td></td></tr><tr><td>PureBlu DAPI Nükleer Boyama Boyası</td><td>Biorad</td><td>1351303</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT Pipet Uçları (Ultra düşük tutma, filtrelenmiş) 10 & mikro; L, 20 ve mikro; L, 200 ve mikro; L ve 1000 &mikro; L boyutları</td><td>ABD Bilimsel</td> <td># 1181-3810; # 1180-1810; # 1180-8810; # 1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>Trikain-S (MS 222)</td> <td>Syndel</td><td>Tricaine10G</td><td>Syndel, farmasötik sınıf Tricaine için FDA onaylı bir sağlayıcıdır</td></tr><tr><td>TRIS, 1 M, pH 8.0</td><td>VWR</td><td>E199-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Geniş Geçişli Pipet Uçları</td><td>Axygen</td><td>T-1005-WB-C</td><td></td></tr></tbody></table>

yetişkin afrika turkuaz killifish'in beyin dokusundan Çekirdeklerin nazik İzolasyonu, yaşlanma araştırmaları için doğal kısa Ömürlü bir model

Gentle Isolation of Nuclei from the Brain Tissue of Adult African Turquoise Killifish, a Naturally Short-Lived Model for Aging Research

Omurgalı sistemlerinde tek hücreli çözünürlükte beyin yaşlanmasını incelemek, maliyet, zaman ve teknik kısıtlamalar nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Burada, doğal olarak kısa ömürlü omurgalı Afrika turkuaz killifish Nothobranchius furzeri'nin beyinlerinden tek çekirdekli RNA dizileme (snRNA-seq) kütüphaneleri oluşturmak için bir protokol gösteriyoruz. Afrika turkuaz killifish, 4-6 aylık bir ömre sahiptir ve uygun maliyetli bir şekilde barındırılabilir, böylece omurgalı beyin yaşlanmasını incelemek için maliyet ve zaman engellerini azaltır. Bununla birlikte, genç ve yaşlı balıkların beyninden aşağı akış tek hücreli deneyler için yeterli kalitede çekirdekleri izole etmek için özel protokollere ihtiyaç vardır. Burada, yüksek kaliteli tek çekirdekli omik kütüphanelerin oluşturulmasında kritik bir adım olan yetişkin Afrika turkuaz killifish'in beyninden yüksek kaliteli çekirdeklerin izolasyonu için ampirik olarak optimize edilmiş bir protokol gösteriyoruz. Ayrıca, kirletici arka plan RNA'sını azaltma adımlarının, hücre tiplerini açıkça ayırt etmek için önemli olduğunu gösteriyoruz. Özetle, bu protokol geleneksel olmayan omurgalı model organizmalarda beyin yaşlanmasını incelemenin fizibilitesini göstermektedir.

Burada açıklanan killifish beyin çekirdeği izolasyon protokolü, özellikle killifish için optimize edilmiştir ve Şekil 1'de özetlenmiştir. Çekirdek ekstraksiyonuna ek olarak, protokol izole edilmiş çekirdeklerin kalitesini ve miktarını değerlendirmek için farklı yöntemleri detaylandırır. Şekil 2, ışık mikroskobu ile değerlendirilen hem sağlıklı (Şekil 2A) hem de sağlıksız (Şekil 2B) çekirdek örneklerini göstermektedir. Aşağı akış analizi için uygun sağlıklı çekirdekler (Şekil 2A), sağlam membranlara sahip singlet çekirdekler olarak bulunur. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, bu protokolün (ve diğer çekirdek izolasyon protokollerinin) en yaygın arıza modu, hasarlı nükleer membranlarla karakterize edilen aşırı çekirdekli çekirdeklerin üretilmesidir. Bu genellikle çekirdeklerin kümelenmesine yol açar ve nükleik asitlerin yırtılmış çekirdeklerden sızması nedeniyle aşağı akış uygulamalarında arka plan sinyallerine katkıda bulunabilir. Aşırı kümelenme gözlenirse, sıçrama adımları sırasında daha nazik olmanızı ve / veya lizis tamponunda inkübasyon sürelerini azaltmanızı öneririz.
Bu protokol, izole edilmiş çekirdeklerin sayısını ölçmek ve bir numunedeki çoklu çekirdeğin göreceli oranını belirlemek için akış sitometrisini kullanır. Ek olarak, akış sitometrisi, kirletici kalıntıların, sıklıkla yırtılmış çekirdek fragmanlarının ve çekirdek örneğindeki aşağı akış tahlillerini zararlı bir şekilde etkileyebilecek diğer hücresel kalıntıların göreceli içeriğini değerlendirmek için kullanılabilir. Temsili akış verileri Şekil 3'te görülebilir. Yüksek kaliteli bir çekirdek izolasyon prosedürü şunları üretecektir: 1) küçük bir enkaz fraksiyonu ve 2) singlet'a karşı multiplet çekirdeklerin yüksek bir fraksiyonu (çekirdek fraksiyonunun &gt;% 80'i). Nükleik asitleri boyayan PI boyamanın kullanılması, singlet çekirdeklerinin enkaz ve multiplet çekirdeklerden ayrılmasını sağlar. Şekil 3A , enkaz tarafından kontamine olmuş bir hazırlık örneğidir, oysa Şekil 3B , yüksek kaliteli bir deneyin bir örneğidir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig01.jpg"> Şekil 1: Killifish beyin çekirdeği izolasyon iş akışı. Dondurulmuş veya taze killifish beyinlerinden çekirdek izolasyonu için deneysel iş akışı. İzole edildikten ve değerlendirildikten sonra, çekirdekler çeşitli aşağı akış "omik" analizleri için kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig02.jpg"> Şekil 2: Mikroskopi ile çekirdek kalitesinin değerlendirilmesi. Çekirdekler% 0.4 Tripan Mavisi çözeltisinde 1: 1 karıştırıldı ve 60x'te parlak alan görüntüleme ile bir Echo Revolve mikroskobunda görselleştirildi. (A) Yüksek kaliteli bir çekirdek örneği. Çekirdek bir singlet olarak bulunur ve nükleer membran sağlamdır. (B) Düşük kaliteli çekirdeklere bir örnek. Nükleer membranlar hasar görür ve çekirdekler, muhtemelen en üstteki çekirdeğin üstünden sızan yapışkan DNA'nın sızıntısı nedeniyle bir çifte kümelenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig03.jpg"> Şekil 3: Akım sitometrisi ile çekirdek nicelleştirme ve saflık değerlendirmesi. Çekirdek örnekleri PI'nin 1:100 seyreltilmesi ile boyandı ve bir akış sitometresinde çalıştırıldı. Çekirdekler, (A,B)'nin sağ üst çeyreğinde tekli ve çarpan formlarda bulunur ve en düşük olay bulutu olarak tekiller ve ardından artan sırayla çiftler, üçüzler vb. bulunur. Enkaz, en soldaki iki kadrandaki olaylarla işaretlenmiştir. (A) Enkaz kaldırma adımının atlandığı ve enkazın olayların %&gt;40'ını oluşturduğu düşük kaliteli çekirdek hazırlığına bir örnek. (B) Dahil edilen enkaz kaldırma adımıyla birlikte yüksek kaliteli çekirdek numunesi örneği. Bu örnekte, enkaz, akış sitometresi tarafından kaydedilen tüm olayların% &lt;10'unu oluşturur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Örnek türü (2 Beyin)</td>
			<td>Ortalama Verim (4 bağımsız hazırlık)</td>
		</tr><tr><td>5 Haftalık Erkek Beyinleri</td>
			<td>3,59 ± 1,76 x 105</td>
		</tr><tr><td>10 Haftalık Erkek Beyinleri</td>
			<td>6,41 ± 1,33 x 105</td>
		</tr><tr><td>15 Haftalık Erkek Beyinleri</td>
			<td>14,59 ± 2,05 x 105</td>
		</tr><tr><td>5 Haftalık Kadın Beyinleri</td>
			<td>2,54 ± 0,75 x 105</td>
		</tr><tr><td>10 Haftalık Kadın Beyinleri</td>
			<td>4,66 ± 1,29 x 105</td>
		</tr><tr><td>15 Haftalık Kadın Beyinleri</td>
			<td>7,95 ± 3,51 x 105</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Afrika turkuaz killifish'in iki beyninden cinsiyet ve yaş boyunca ortalama beklenen verim. 105 çekirdek olarak ifade edilen ortalama verimler, her kategorideki dört bağımsız çekirdek preparatı üzerindeki ortalamanın standart hatasını ±.
Ek Şekil 1: Standart protokoller ve dondurulmuş killifish beyinleri üzerindeki optimize edilmiş protokolümüz kullanılarak çekirdek izolasyon kalitesinin karşılaştırılması. (A) Mikroskopi ile çekirdek kalitesi değerlendirmesi. Çekirdekler% 0.4 Tripan Mavisi çözeltisinde 1: 1 karıştırıldı ve 60x'te parlak alan görüntüleme ile mikroskopta görselleştirildi. (B) Akım sitometrisi ile çekirdekler ve enkaz yükü nicelleştirmesi. Çekirdek örnekleri PI'nin 1:100 seyreltilmesi ile boyandı ve bir akış sitometresinde çalıştırıldı. (C) Kalite değerlendirme metriklerinin mikroskopi ve akış sitometrisi ile farklı kıyaslama protokolleri ile özeti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_FIgure_S1_v3.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 2: Enkaz kaldırma adımlarının şematik gösterimi. (A) Enkaz kaldırma katmanlama ön santrifüjleme şeması. (B) Santrifüjlemeden sonra süpernatant giderim şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_Figure_S2_JOVE_Revision.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Burada, kısa ömürlü omurgalı model Nothobranchius furzeri'nin beyinlerinden çekirdekleri izole etmek için tek çekirdekli RNA dizilimi veya dizileme ile transpozaz erişimli kromatin için tek çekirdekli tahlil (ATAC-seq) gibi aşağı akış uygulamaları için bir protokol sunuyoruz.

Yetişkin Afrika Turkuaz Killifish'in Beyin Dokusundan Çekirdeklerin Nazik İzolasyonu, Yaşlanma Araştırmaları için Doğal Kısa Ömürlü Bir Model

Studying brain aging at single-cell resolution in vertebrate systems remains challenging due to cost, time, and technical constraints. Here, we ...

Bu, yaşlanma araştırmaları için ortaya çıkan bir omurgalı modeli olan Afrika turkuaz killifish'in donmuş beyinlerini kullanarak tek çekirdekli dizileme deneyleri için yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için ilk optimize edilmiş protokoldür. Bu protokol, çekirdekleri çok nazikçe izole eder, bu da onu daha miyelinli beyinlere sahip diğer organizmalar için optimize edilmiş daha sert protokollerden ayırır, bu da killifish'te kullanıldığında bozulmuş çekirdeklere neden olur. Bu yöntem, beyin yaşlanmasını tek hücre düzeyinde anlamamıza yardımcı olmada etkili olacaktır.Daha yumuşak çekirdek izolasyonu gerektiren diğer dokulara iyi tercüme edilmelidir. Bu protokol kullanıcı dostudur. En zorlu görev, hızlı ve dağınık olmaktan ziyade yavaş ve kesin olmanın daha iyi olduğu enkaz kaldırma için gradyan santrifüjlemedir.Prosedürü gösterenler, bir araştırma laboratuvarı teknisyeni ve Benayoun laboratuvarından doktora sonrası bir akademisyen olan Ari Adler ve Brian Teefy olacak. Kilifish'i diseke ettikten sonra, donmuş beyin dokusunu 10 dakika boyunca buz üzerinde çözün ve beyni iki mililitrelik bir sıçrama homojenizatöründe bir mililitre buz gibi soğuk çekirdek lizis tamponunda sıçrayın. Numuneyi lize ederken, homojenizatörü buz üzerinde tutun ve kabarcık oluşturmaktan kaçının.Dokuyu el yazmasında açıklandığı gibi zıplatın ve numunenin iki dakika boyunca sıçrama homojenizatöründe buz üzerinde durmasına izin verin. Ardından, numuneyi 70 mikrometrelik bir hücre filtresinden %5 BSA ile önceden kaplanmış 15 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Yıkama tamponunu 70 mikrometrelik hücre filtresinin üzerine pipetleyerek numuneye dört mililitre çekirdek yıkama tamponu ekleyin ve tüpü beş kez hafifçe ters çevirerek karıştırın.Sallanan bir kova rotoru kullanarak, numuneyi dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 500 G'de santrifüj yapın. Süpernatantı yavaşça bir sıvı atık haznesine dökerek atın. Numuneyi dik tutun ve kalan yıkama tamponunu P1000 pipet kullanarak çıkarın.Çekirdekleri, geniş delikli P1000 pipet ucu ile bir mililitre çekirdek yıkama tamponunda derhal yeniden askıya alın. Ardından, dört mililitre çekirdek yıkama tamponu ekleyerek numuneyi beş mililitreye getirin ve daha önce gösterildiği gibi karıştırın. Santrifüjleme ile hücreyi topaklayın.Süpernatantı atın ve çekirdekleri geniş delikli pipet ucu ile bir mililitre çekirdek yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Şimdi, çekirdekleri bir akış sitometri tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonuna 300 mikrolitre döküntü giderme çözeltisi ekleyin ve karışım homojen olana kadar geniş bir delik ucu ile pipetleme yaparak iyice karıştırın.Tüpü hafif bir açıyla tutun ve bir P1000 pipet kullanarak çekirdek çözeltisinin üzerine bir mililitre çekirdek yıkama tamponunu yavaşça yerleştirin. Numuneyi 3000 G'de sallanan bir kova rotorunda dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj yapın. P1000 pipet kullanarak üstteki iki fazı tamamen atın.Alt katmanı% 5 BSA ile önceden kaplanmış 15 mililitrelik bir konik boruya aktarın. Ardından, çekirdek yıkama tamponu ile hacmi 15 mililitreye getirin ve tüpü üç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü 1000G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca sallanan bir kova rotorunda santrifüj yapın.Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve geniş delikli bir pipet ucu kullanarak peleti 150 mikrolitre çekirdek yıkama tamponunda derhal yeniden askıya alın. 300 mikrolitreye ayarlanmış standart bir delik pipet ucuna geçin. Tüm numuneyi pipetledikten sonra pipet ucunun ucuna 40 mikrometrelik bir uç filtresi takın.Numuneyi filtreden düşük DNA bağlayıcı, 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne zorla dışarı atarak numuneyi filtreleyin. Bir FACS tüpünde, filtrelenmiş çekirdek örneğinin 10 mikrolitresini, önerilen akış sitometri tamponunun 90 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Numuneleri propidium iyodür ile mililitre başına bir mikrogramlık son konsantrasyonda sabitleyin.Çalışma alanını makalede açıklandığı gibi ayarladıktan sonra, sağ alt köşedeki oynat simgesine basarak akışı başlatın. HDRT'ye karşı yan saçılma alanını kullanarak numunedeki hava kabarcıkları veya kümeleri olup olmadığını kontrol edin. Ayrıca, olayların pencerenin sınırları içinde biriktiğini doğrulamak için yan dağılım ve ileri dağılım grafiğini kontrol edin.Büyütülmüş bir görünüm için, PerCP-Vio700-A grafiğine karşı yan dağılım alanını çift tıklatın. Bir kadran kapısı seçmek için sol üst araç çubuğundaki dikey çizgili düğmeyi tıklatın. Ardından, PerCP-Vio700-A grafiğine karşı yan dağılım alanında herhangi bir yeri tıklattığınızda, grafiğin içinde kadranlar görünecektir.Çeyrek bölme çizgilerinde herhangi bir yeri tıklatın ve çeyrek yerleşimini değiştirmek için imleci kaydırın. Kadranları sol üst kadran enkaz içerecek ve sağ üst kadran çekirdek içerecek şekilde yerleştirin. Özellikler penceresini açmak için kare, gri, I simgesine tıklayın.Bölge işlevleri sekmesine gidin ve üst öğenin yanında, grafiğin tamamının seçili olduğunu belirten yeşil bir onay işareti olduğundan emin olun. İşlevler listesinin altında, yeşil bir onay işareti oluşturmak için mikrolitre başına sayıma tıklayın. Tamam'ı tıkladığınızda her kadran mikrolitre metrik başına bir sayı görüntüler.İsterseniz ham sayıları ve yüzdeleri görüntülemek için bölge işlevleri sekmesinden sayı ve yüzde toplamı'nı seçin. Sol üst araç çubuğundaki çokgen düğmesini tıklatarak bu popülasyonun etrafına çokgen bir kapı çizin. Ardından, tek bir kez tıklayın ve kapının doğrusal bir bölümünü çizmek için fareyi kaydırın.Bitirmek ve bir sonrakine başlamak için tekrar tıklayın, ardından kapıyı bitirmek için çift tıklayın. Kapının kenarlığını tıklatın ve kapıyı yeniden konumlandırmak için fareyi kaydırın. Şekli değiştirmek için kapının köşelerine tıklayın ve kapılı popülasyonun mikrolitresi başına sayımlar görünecektir.Sağlam membranlara sahip singlet çekirdekleri olarak ortaya çıkan sağlıklı çekirdekler, aşağı akış analizi için uygundur. Bununla birlikte, sağlıksız çekirdekler, çekirdeklerin kümelenmesine yol açan ve aşağı akış uygulamalarında arka plan sinyallerine katkıda bulunabilen hasarlı nükleer membranlarla karakterizedir. Çekirdekler sağ üst kadranda tekli ve çarpan formlardadır, en düşük olay bulutu olarak tekiller ve ardından artan sırayla çiftler ve üçüzler gelir.Enkaz, enkaz kaldırma adımının atlandığı düşük kaliteli bir çekirdek preparatındaki en soldaki iki kadrandaki olaylarla işaretlenir. Enkaz, olayların% 40'ından fazlasını oluşturur. Bununla birlikte, yüksek kaliteli bir deneyde, enkaz tüm olayların% 15'inden azını oluşturur.Kirletici arka plan RNA Çekirdeklerini azaltmak için enkaz kaldırma santrifüjleme adımını takiben orta tabakanın tamamen çıkarılması zorunludur Bu protokol kullanılarak izole edilen RNA çekirdekleri, tek hücreli RNA dizilimi veya tek hücre düzeyinde transkriptomik ve epigenetik bilgi elde etmek için ATAC dizilimi için kullanılabilir. Bu teknik, araştırmacıların yaşlanma araştırmaları için doğal olarak kısa ömürlü bir omurgalı model organizması olan Afrika turkuaz killifish'te tek hücre düzeyinde beyin gen düzenlemesini keşfetmelerini sağlayacaktır.

gentle-isolation-nuclei-from-brain-tissue-adult-african-turquoise

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, floresan olarak işaretlenmiş T hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) tümör hücrelerini yetişkin bir zebra balığından izole etme ve bunları tripan mavisi boya kullanarak ölçme tekniğini açıklar.

Floresan Etiketli T-ALL Hücreleri İzolasyonu: Yetişkin Zebra Balıklarından T-ALL Hücrelerini İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, beyin dokusunu mekanik olarak bozarak larva zebra balığı beyinlerinden nöronları, makrofajları ve mikrogliaları izole etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Saflaştırılmış hücre popülasyonları ayrıca genomik analiz için kullanılabilir.

Zebra Balığı Larvalarından Beyin Hücresi İzolasyonu: Zebra Balığı Beyin Dokusundan Sağlam Nöronlar, Makrofajlar ve Mikroglia Elde Etme Tekniği

Zebra balığı yetişkin nörogenezi ve rejenerasyonunun hücresel ve moleküler mekanizmalarına ışık tutmak için, zebra balığı yetişkin telensefalonunda mekanik yaralanmalara neden olan invaziv cerrahi ve ardından bıçaklanmış hemisferdeki değişikliklerin immünohistokimya veya in situ hibridizasyon ile izlenmesi için bir protokol geliştirdik.

Zebra balığı Yetişkin telencephalon stab Yara Yaralanma: Omurgalı Beyin nöron ve Rejenerasyon Soruşturma Bir Yöntem

Burada tüm beyin veya telencephalic, tectal veya yetişkin zebrabalıkları beyin beyincik bölgelerinin türetilen bir neurosphere tahlili kullanılarak yetişkin nöron incelemek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Ayrıca, zebrabalıkları neurospheres gen ifadesini işlemek için prosedürü açıklar.

Yetişkin balığı beyin türevli Neurospheres İzolasyon ve Kültürü

Bu iletişim kuralı sentezi, karakterizasyonu ve monomeric amiloid-β42 peptidler amiloid toksisite histolojik analizler ve tespiti takip bir Alzheimer hastalığı modeli kurmak için yetişkin Zebra balığı üretme için enjeksiyon açıklar toplamalardan.

Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme

Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis cryopreserve dalmış oldu. Ayrıca, beş farklı Zebra balığı suşları yönteminde tekrarlanabilirlik test edildi.

Zebra balığı Spermatogonia bütün testis iğne tarafından dondurma hızlı soğutma dalmış

Laboratuvar muhafazasını turkuaz ev ve verimli bir şekilde standart Zebra balığı özellikleri için kullanılan aynı altyapı istihdam Merkezi su filtrasyon sistemi, bireysel balık binlerce yükseltmek killifish ölçeklendirilecektir. Burada verimli killifish bakım izin standart yordamların listesini ayrıntılı.

Laboratuvar konut, turkuaz Killifish (Nothobranchius furzeri) için bir iletişim kuralı

Biz nöronlar, makrofajlar ve microglia larva Zebra balığı beyin fizyolojik ve patolojik şartlar altında gelen izole etmek için bir protokol mevcut. Yalıtım, RNA gen ifade profillerini analiz etmek için bu hücrelerden elde edilir. Bu iletişim kuralı için yüksek kaliteli RNA koleksiyonu aşağı akım analizi qPCR ve transcriptomics gibi gerçekleştirmek için izin verir.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

Burada, biz transgenik Caenorhabditis elegans hatları yeşil floresan protein ifade canlı nöronal hücrelerin belirli grupların basit yalıtım için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, belirli nöronlara odaklanan ex vivo çalışmaların çeşitli sağlar ve daha kısa vadeli kültür için hücreleri yalıtmak için kapasitesine sahiptir.

Roundworm Caenorhabditis elegans belirli neuron nüfus yalıtım

Tek çekirdek izolasyonu ayrışma ve hücre zarının deterjan bazlı permeabilizasyonuna, optimizasyona ihtiyaç duyan ve teknik eserlere yatkın adımlara dayanır. Tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-Seq) veya ATAC-seq için uygun olan çekirdekleri doğrudan tüm dokudan hızlı bir şekilde izole etmek için deterjan ve enzimsiz bir protokol gösteriyoruz.

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

Burada zebra balığı embriyonik beynini larva ve çocuk evrelerine kadar in vivo olarak görüntüleyen bir yöntem sunuyoruz. Elektrofizyolojik yaklaşımlardan uyarlanan bu mikroinvaziv prosedür, olgun nöronun hücresel ve hücre altı ayrıntılarına erişim sağlar ve beyin fonksiyonu ve ilaç müdahalesini karakterize etmek için optogenetik ve nörofarmakolojik çalışmalarla birleştirilebilir.

Kafatası ve Deri Temizleme ile Uyanık Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun In vivo Görüntülemesi

Öğrenin, Afrika turkuaz killifish beyninden yüksek kaliteli çekirdek izolasyonu için nazik bir yöntem. Bu protokol, tek hücreli RNA dizileme ve ATAC-seq gibi uygulamalarla beyin yaşlanmasını araştırmayı kolaylaştırır.

Yetişkin Afrika Turkuaz Killifishin Beyin Dokusundan Çekirdeklerin Nazik İzolasyonu, Yaşlanma Araştırmaları için Doğal Kısa Ömürlü Bir Model (Video) | JoVE Journal

Yetişkin Afrika Turkuaz Killifish'in Beyin Dokusundan Çekirdeklerin Nazik İzolasyonu, Yaşlanma Araştırmaları için Doğal Kısa Ömürlü Bir Model

Daha fazla video keşfet