Name: İn Vivo Fare Submandibuler Bezinde Vasküler Geçirgenlik Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Keşfedin fare submandibuler bezinde vasküler geçirgenlik tespiti yöntemini. İki foton lazer tarama mikroskobisi ile endotel bariyer fonksiyonunu değerlendirin ve damarsal geçirgenliği in vivo ortamda ölçün.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibeler 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 ve 81974151) ve Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (hibe 7202082) tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneysel prosedürler Pekin Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi, Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (NIH Yayın No. 85-23, gözden geçirilmiş 1996) uyulmuştur. Bu çalışmada 8-10 haftalık yaş grubundaki erkek vahşi tip (WT) fareler kullanılmıştır. Deney hayvanları, ağrılarını ve rahatsızlıklarını en aza indirmek için dikkatlice tedavi edildi.
1. Hayvan prosedürleri
<ol><li>Anestezik ve izleyicileri hazırlayın ve uygulayın.<ol><li>Çalışma boyunca steril koşulları koruyun ve otoklavlama ile aletleri sterilize edin. Fareleri iki gruba ayırın. NOT: Kontrol grubu tedavi edilmeden bırakıldı ve 1 gün boyunca tek taraflı SMG kanal ligasyonu olan diğer grup deney grubu olarak görev yaptı. Gruplama yaparken, ağırlık ve yaşın vasküler geçirgenlik üzerindeki etkisini azaltmak için benzer vücut ağırlığına ve yaşına sahip farelerin seçilmesi gerekir.</li>
		<li>Floresein izotiyosiyanat (FITC) etiketli dekstran (moleküler ağırlık: 4 kDa; FD4) ve rodamin B etiketli dekstran (moleküler ağırlık: 70 kDa; RD70) (bkz. Malzeme Tablosu) geçirgenlik testi için floresan sinyalleri arasındaki paraziti en aza indirmek için farklı uyarma/emisyon spektrumlarına sahiptir (sırasıyla FITC veya rodamin B filtresini kullanarak). NOT: FD4 ve RD70'in uyarma dalga boyları sırasıyla 488 nm ve 594 nm'dir ve seçilen emisyon dalga boyları sırasıyla 511-564 nm ve 617-669 nm'dir.</li>
		<li>İzleyicileri steril fosfat tamponlu salin (1x PBS) içinde 100 mg / mL stoklara seyreltin ve ışıktan korunan alikotları -20 ° C'de saklayın. NOT: 4 kDa gibi moleküler ağırlığa sahip Dextran, patolojik durumlar olmadan bile fare SMG'lerinde kandan hızla sızacaktır10.</li>
		<li>Fareleri anestezik hale getirmek için intraperitoneal olarak tribromoetanol enjekte edin (25 g'lık bir fare için doz yaklaşık 600 μL idi). Yerel hayvan etik komitesi tarafından önerilen analjezi sağlayın. NOT: Anestezi indüksiyonundan sonra, kuruluğu önlemek için gözlerde veteriner merhem kullanın. Hayvanlara iyi bak11. Farenin mekanik stimülasyonu tolere etmesini bekleyin, örneğin motor tepkisi olmadan ayak parmağı sıkışması.</li>
		<li>Farklı moleküler ağırlıklara (FD4 ve RD70) sahip iki parasellüler geçirgenlik izleyicisinin bir karışımını açısal damara (0.5 mg / g vücut ağırlığı) enjekte edin. Her fareye 100 μL'lik bir izleyici çözeltisi karışımı enjekte edin, her boyanın 50 μL'si 1:1 oranında karıştırılır.<ol><li>Anesteziden sonra, göz küresinin bir tarafının hafifçe çıkıntı yapmasını sağlamak için farenin başını ve boynunu yavaşça tutun. Gözün köşesi boyunca floresan izleyiciler içeren bir insülin şırıngası yerleştirin (şırıngaya herhangi bir hava sokmamaya dikkat edin) göze dik açıyla yerleştirin. NOT: Açısal damar doğru yerleştirilirse, boya çözeltisi damar içine kolayca enjekte edilecek ve enjeksiyon sırasında direnç olmayacaktır. Ek olarak, farelerde kuyruk damarı enjeksiyonu da intravenöz izleyici molekülleri için bir aday olabilir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek SMG yalıtımını gerçekleştirin. NOT: Ameliyat için doku makası ve ayırma nikelleri dahil olmak üzere steril aletler kullanın.<ol><li>Stereoskopik mikroskop altında çevredeki kan damarlarına ve sinirlere zarar vermemek için tek taraflı bir bezi dikkatlice ayırın.<ol><li>Parasellüler geçirgenlik izleyicilerinin enjeksiyonundan sonra, fareleri hızlı bir şekilde kartonun üzerine koyun ve uzuvları ve kafaları bantlanmış olarak sırtüstü pozisyona yerleştirin. Farenin kıllarını çıkarmak için boyun derisine epilasyon kremi uygulayın. Ameliyattan önce cildi dezenfekte etmek için% 75 etanol kullanın.</li>
			<li>Daha sonra, bir stereomikroskop altında, SMG'lerin her iki tarafını da ortaya çıkarmak için boynun epidermisini genel doku makası ile kesin (bu deneyde sağ bez tedavi edildi). Daha sonra, kapsülü bez yüzeyinden nazikçe ayırmak için künt bir doku ayırma nikeli kullanın (bkz.</li>
			<li>Kapsülü, glandüler yapıya zarar vermeden bez yüzeyinden ayırın. Ek olarak, tüm fare kısıtlama ve bez ayırma işleminin 10 dakika içinde tamamlandığından emin olun.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. İki foton mikroskobu kurulumu
<ol><li>Özelleştirilmiş tutucuyu negatif basınç cihazına bağlayın ve negatif basınç etkisinin önceden uygun şekilde elde edilip edilmediğini kontrol edin. NOT: Tutucu, ortasında düz bir yuvarlak cam parçası bulunan minyatür bir büyüteç şeklindedir (çap: 4,32 mm, Şekil 1). Negatif basınç cihazı, tutucunun bir drenaj şişesine bağlı bir lastik tüpe bağlanacağı ve şişenin negatif basınç kontrolörüne kısa bir lastik tüp ile bağlanacağı şekilde şirket içinde tasarlanmıştır. Bu şekilde, negatif basınç kontrolörü, dokunun tutucuya emilmesini sağlamak için basıncı ayarlayabilir.<ol><li>Tutucunun bir tarafını negatif basınç cihazına bağlayın. Negatif basınç cihazının sağlam ve uygun olup olmadığını test etmek için, tutucuyu baş aşağı çevirin, bir damla su ekleyin ve negatif basınç değerini 20 birime ayarlayın. Su tamamen ve hızlı bir şekilde emilirse, negatif basınç cihazı tutucu ile başarıyla monte edilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Farenin açıkta kalan SMG'sini özelleştirilmiş tutucuya yavaşça yerleştirin ve solunum ve diğer koşulların neden olduğu hareket artefaktlarını azaltmak için negatif basınçlı emme ile dokuyu fare gövdesinden mümkün olduğunca uzağa emer.</li>
	<li>Beze tutturulmuş destek malzemesini 25x/NA 1.0 suya daldırma hedefi (NIR için özel) altında görüntüleyin. NOT: Bu deneyde dik iki fotonlu mikroskop kullanın (bkz. Kan damarları, izleyici enjeksiyonundan sonra belirgin floresan ile hemen görülebilmelidir.</li>
</ol>3. Damar görüntüleme ve geçirgenlik tespiti
<ol><li>Bezin görüşü seçildikten kısa bir süre sonra görüntülemeye başlayın. NOT: Tipik olarak, deneysel tasarıma bağlı olarak genellikle 20 s veya daha uzun 45-50 görüntüden oluşan zaman serileri yakalanır.</li>
	<li>Üç boyutlu (3B) bir yapı oluşturmak için bezin yüzeyinden dokuya 70-140 μm'ye kadar 2 μm aralıklarla basılmış Z ekseni boyunca sıralı görüntüler elde edin.</li>
	<li>SMG'de vasküler geçirgenliği ölçmek için damarların hızlandırılmış görüntülemesini elde edin. NOT: Mikroskop yazılımını çalıştırdıktan sonra program menüsünün koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın (bkz.<ol><li>Explorer iletişim kutusunda, Yeni Klasör Ekle'ye tıklayın ve dosya adını değiştirin.</li>
		<li>Edinme sütununa geri dönün. XY'de, biçim 512 x 512 ve hız 400 Hz'dir. Çift yönlü X'i açın.</li>
		<li>Yakınlaştırma için Yakınlaştırma faktörünü 0,75 ve 1,5 olarak ayarlayın.</li>
		<li>Hızlandırılmış görüntüleme elde etmek için, Edinme Modu altında xyt'yi seçin. Deneysel ihtiyaca göre Süreyi 20 sn, 30 dakika veya daha uzun olarak ayarlayın.</li>
		<li>3B yapıyı yapmak için Edinme Modu'nu xyz olarak ayarlayın. Z-Step boyutu gerçek duruma göre ayarlanabilir.</li>
		<li>Koşulları ayarladıktan sonra, fotoğraf oluşturan çerçevedeki iki kanalın ve üst üste binen kanalların vasküler görüntülemesini gözlemlemek ve ilgi alanlarını seçmek için Canlı üzerine tıklayın.</li>
		<li>Görüntülemeye başlamak için Başlat'a tıklayın. NOT: Anestezi altındayken görüntüleme işlemi sırasında fare gözetimsiz bırakılmamalıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Veri analizi
<ol><li>Damar geçirgenliğini değerlendirmek için, FD4 ve RD70'in dış ve iç damarlar arasındaki floresan yoğunluk oranını hesaplamak ve bunları ekstra ve intravasküler yoğunluk4 olarak belirtmek için Image J yazılımını kullanın. NOT: Dekstransın taşınımını izleyerek vasküler geçirgenliğin değişmesi, endotel bariyer fonksiyonundaki değişimi yansıtır. Ayrıca, damar değişikliklerinin çapını ve sayısını hesaplayarak vasküler morfolojiyi ve yoğunluğu gözlemleyin.<ol><li>Image J yazılımını çalıştırın (bkz.</li>
		<li>Dosya'ya tıklayın ve iki foton mikroskobu altında yakalanan kan damarı görüntülerini açmak için Aç'ı seçin.</li>
		<li>Görüntü öğesini seçin ve görüntü biçimini dönüştürmek için Tür'ü 16 bit olarak ayarlayın.</li>
		<li>Analiz Et'i seçin ve Ölçümleri Ayarla altında Alan, Ortalama, IntDen'i seçin. Onaylamak için Tamam'a tıklayın.</li>
		<li>Analiz altında, Araçlar'ı seçin, YG Yöneticisi'ni açın ve Tümünü ve Etiketleri Göster'i seçin. </li>
		<li>İntravasküler floresan yoğunluk değerini ölçün: kan damarının ana hatlarını çizmek için ana arayüzdeki kement aracına tıklayın. Yatırım getirisi Yöneticisi'nde Ekle'ye tıklayın. Birden fazla gemi seçmeye devam etmek için bu adımı izleyin. YG Yöneticisi'nin tüm nesnelerini seçin ve Ölç'e tıklayın.</li>
		<li>Toplam floresan yoğunluğu değerini ölçün: Tüm görüntüyü ana hatlarıyla belirtin, Ölç'ü tıklayın ve sonuç görüntünün toplam floresan yoğunluğu değeridir.</li>
		<li>Ekstravasküler floresan yoğunluk değerini hesaplayın. Verileri hesaplama için Excel'e kopyalayın. Ekstravasküler floresan yoğunluk oranı = (1 − intravasküler floresan yoğunluk değeri/toplam floresan yoğunluk değeri) %100 ×.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Aşağı akış uygulamaları
<ol><li>Deney sırasında, kırmızı bir hücrenin (iki foton mikroskobu altında siyah bir nokta olarak gösterilir)4 bir zaman diliminde maruz kaldığı mesafeyi ölçerek kan akış hızını hesaplayın.</li>
	<li>Kan hücrelerinin endotel hücreleri arasındaki hareketini görselleştirmek için, kan hücrelerini floresan ile etiketleyin. Ardından, floresan etiketli hücrelere fare kuyruğu damarı üzerinden FD4 veya RD70 enjekte edin. 5 dakika dolaştıktan sonra, ilgilenen hücreleri bir süre boyunca izleyin. NOT: Donör farelerin dalağından elde edilen toplam 2 x 106 CFSE (karboksifloresein süksinimidil ester, membran geçirgen floresan boya) etiketli lenfositler kuyruk damarı enjeksiyonu ile alıcılara aktarılmış ve deneysel hayvan modellerinde lenfositlerin SMG'lere infiltrasyonu araştırılmıştır4.</li>
</ol>6. Hayvan bakımı ve iyileşmesi
<ol><li>Deney boyunca hayvanlara iyi bakın. NOT: Ameliyat edilen hayvanın, deney sırasında tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade edilmediğinden emin olun.</li>
	<li>Yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın. NOT: Farelerin solunum durumunu sürekli gözlemleyin ve hayvan ısıtma yastığına koyarak sıcak tutun. Yerel hayvan etik komitesi tarafından önerildiği gibi cerrahi sonrası ağrı iyileşme konutu ve analjezi sağlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretion%2C+components%2C+and+properties+of+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The secretion, components, and properties of saliva.</a> Annual Review of Food Science and Technology. 4, 267-276 (2013).</li>
<li>Garrett, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proper+role+of+nerves+in+salivary+secretion%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">The proper role of nerves in salivary secretion: A review.</a> Journal of Dental Research. 66 (2), 387-397 (1987).</li>
<li>Berndt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+proteins+at+the+blood-brain+barrier%3A+Far+more+than+claudin-5%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tight junction proteins at the blood-brain barrier: Far more than claudin-5.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (10), 1987-2002 (2019).</li>
<li>Cong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+endothelial+barrier+function+is+linked+with+hyposecretion+and+lymphocytic+infiltration+in+salivary+glands+of+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren's syndrome.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1864 (10), 3154-3163 (2018).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+Multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li>
<li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis+of+the+apical+plasma+membrane+during+regulated+exocytosis+in+the+salivary+glands+of+live+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Homeostasis of the apical plasma membrane during regulated exocytosis in the salivary glands of live rodents.</a> Bioarchitecture. 1 (5), 225-229 (2011).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li>
<li>Balda, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissociation+of+paracellular+permeability+and+transepithelial+electrical+resistance+and+disruption+of+the+apical-basolateral+intramembrane+diffusion+barrier+by+expression+of+a+mutant+tight+junction+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein.</a> The Journal of Cell Biology. 134 (4), 1031-1049 (1996).</li>
<li>Enis, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction%2C+differentiation%2C+and+remodeling+of+blood+vessels+after+transplantation+of+Bcl-2-transduced+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction, differentiation, and remodeling of blood vessels after transplantation of Bcl-2-transduced endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (2), 425-430 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+digital+subtraction+angiography+in+canine+hindlimb+arteriography%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular%22%5BJournal%5D)">Application of digital subtraction angiography in canine hindlimb arteriography.</a> Vascular. 30 (3), 474-480 (2022).</li>
<li>Trani, M., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+in+the+control+of+vascular+permeability%3A+vascular+endothelial-cadherin+and+other+players%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">New insights in the control of vascular permeability: vascular endothelial-cadherin and other players.</a> Current Opinion in Hematology. 22 (3), 267-272 (2015).</li>
<li>Viazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability%2C+blood+pressure%2C+and+organ+damage+in+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension+Research%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension.</a> Hypertension Research. 31 (5), 873-879 (2008).</li>
<li>Scheppke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+permeability+suppression+by+topical+application+of+a+novel+VEGFR2%2FSrc+kinase+inhibitor+in+mice+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2337-2346 (2008).</li>
<li>Blanchet, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CD34+leads+to+exacerbated+autoimmune+arthritis+through+increased+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Loss of CD34 leads to exacerbated autoimmune arthritis through increased vascular permeability.</a> Journal of Immunology. 184 (3), 1292-1299 (2010).</li>
<li>Egawa, G., Ono, S., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging+of+vascular+permeability+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging of vascular permeability by two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 2223, 151-157 (2021).</li>
<li>Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+in+the+regulation+of+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).</li>
<li>Schulte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> The EMBO Journal. 30 (20), 4157-4170 (2011).</li>
<li>Uhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+experimental+approach+for+in+vivo+analyses+of+the+salivary+gland+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A novel experimental approach for in vivo analyses of the salivary gland microvasculature.</a> Frontiers in Immunology. 11, 604470(2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Endotel bariyer fonksiyonunun idamesi ve düzenlenmesi vasküler homeostaz için gereklidir. Endotel hücreleri ve bunların hücreler arası kavşakları, vasküler bütünlüğün korunmasında ve kontrol edilmesinde kritik bir rol oynamaktadır12. Kan akımının kayma kuvveti, büyüme faktörleri ve inflamatuar faktörler vasküler geçirgenlikte değişikliklere neden olabilir ve böylece hipertansiyon, diyabet ve otoimmün hastalıklar gibi sistemik hastalıkların ortaya çıkmasına ve gelişmesine katkıda bulunabilir<sup cl...

Çeşitli tükürük bezleri, öncelikle enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattı görevi gören ve sindirime yardımcı olan tükürük üretir, böylece ağız ve genel sağlıkta önemli bir rol oynar1. Kan akışı, tükürük bezi sekresyonu için çok önemlidir, çünkü sürekli olarak birincil tükürüğü oluşturan su, elektrolitler ve moleküller sağlar. Sıkı bağlantı (TJ) kompleksi tarafından düzenlenen endotel bariyer fonksiyonu, suya, çözünürlere, proteinlere ve hatta dolaşımdaki kan damarlarından tükürük bezi dokularına doğru hareket eden hücrelere oldukça geçirgen olan kılcal damarların geçirgenliğini kesin ve hassas bir şekilde sınırlar 2,3. Daha önce kolinerjik bir uyarana yanıt olarak endotel TJ'lerinin açılmasının tükürük sekresyonunu kolaylaştırdığını, oysa endotel bariyer fonksiyonunun bozulmasının Sjögren sendromunda submandibuler bezlerde (SMG'ler) hiposekresyon ve lenfositik infiltrasyon ile bağlantılı olduğunu bulmuştuk4. Bu veriler, çeşitli tükürük bezi hastalıkları ile ilgili endotel bariyer fonksiyonunun katkısına yeterince dikkat edilmesi gerektiğini göstermektedir.
İki fotonlu lazer taramalı mikroskop, bozulmamış dokudaki hücrelerin dinamiklerini in vivo olarak gözlemlemek için güçlü bir araçtır. Bu tekniğin avantajlarından biri, yakın kızılötesi ışığın (NIR), numuneler NIR tarafından uyarıldığında görünür veya ultraviyole ışıktan daha derin doku penetrasyonuna sahip olması ve uygun koşullar altında dokularda belirgin ışık hasarına neden olmamasıdır 5,6. Gerçekten de, tükürük bezleri, yüzey asinar hücrelerinin bez yüzeyinden 7,8 ila 30 μm uzaklıkta olduğu çok homojen ve yüzeysel bir dokudur. İntravital konfokal mikroskopinin, canlı fare tükürük bezlerinde ekzokrin sekresyonu ve aktin sitoiskeletini hücrealtı çözünürlükte 8'de inceleyebileceği gösterilmiştir. Bununla birlikte, iki fotonlu lazer taramalı mikroskopi, sadece geleneksel konfokal mikroskopinin avantajına sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda daha derin doku ve görüntüyü daha net bir şekilde tespit etmek için de kullanılabilir. Burada, sıklıkla parasellüler geçirgenlik izleyicileri olarak kullanılan ve farklı boyutlarda avantaja sahip olan floresan etiketli dekstrans, TJ gözenek9'un büyüklüğünü test etmek için kullanılabilir. Bu çalışmada, fare SMG'lerinde endotel bariyer fonksiyonunun yerinde değerlendirilmesi için intravital gerçek zamanlı iki foton lazer taramalı mikroskopi tekniği oluşturulmuştur. Fare SMG'lerinde in vivo vasküler geçirgenlik tespiti için her çalışma adımı mevcut protokolde açıklanmıştır. İşte fare SMG kanal ligasyon modelinde endotel bariyer fonksiyonunu tespit etme örneği.

<table><tbody><tr><td>2-foton mikroskobu (TCS-SP8 DIVE)</td><td>Leica, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC etiketli dekstran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>70 kDa rodamin B-etiketli dekstran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>Künt doku ayırma nikel</td><td>Bejinghuabo Company</td><td>NZW28</td><td></td></tr><tr><td>Tüy dökücü krem</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık steril şırınga</td><td>Zhiyu Şirketi</td><td></td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Image J yazılımı</td><td>Ulusal Sağlık</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enstitüleri İnsülin şırıngası</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>0253316</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X yazılımı</td><td>Leica Microsystems Microtubes</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C 1.5</td><td>mL</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su 1x</td><td>Servicebio</td><td>G4207-500</td><td></td></tr><tr><td>Doku makası</td><td>Bejinghuabo Şirketi</td><td>M286-05</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>JITIAN Bio</td><td>JT0781</td><td></td></tr></tbody></table>

İn vivo fare submandibuler bezinde vasküler geçirgenlik tespiti

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

Tükürük ağız ve genel sağlıkta önemli bir rol oynar. Kan damarlarının sağlam endotel bariyer fonksiyonu tükürük sekresyonunu sağlarken, endotel bariyer disfonksiyonu birçok tükürük bezi salgı bozukluğu ile ilişkilidir. Bu protokol, fare submandibuler bezlerinde (SMG) endotel sıkı kavşakların (TJ'ler) işlevini değerlendirmek için bir in vivo parasellüler geçirgenlik tespit yöntemini tanımlamaktadır. İlk olarak, farelerin açısal damarlarına farklı moleküler ağırlıklara (4 kDa, 40 kDa veya 70 kDa) sahip floresan etiketli dekstrans enjekte edildi. Daha sonra, tek taraflı SMG diseke edildi ve iki fotonlu lazer tarama mikroskobu altında özelleştirilmiş tutucuya sabitlendi ve daha sonra kan damarları, acini ve kanallar için görüntüler yakalandı. Bu yöntem kullanılarak, farklı büyüklükteki izleyicilerin kan damarlarından acini'nin bazal taraflarına ve hatta asinar epitelinin üzerinden kanallara gerçek zamanlı dinamik sızıntısı, fizyolojik veya patofizyolojik koşullar altında endotel bariyer fonksiyonunun değişimini değerlendirmek için izlendi.

Protokolü takiben, tek taraflı SMG ısmarlama bir tutucuya bağlandı ve bez, nefes almanın hareket artefaktlarına neden olmasını önlemek için fare gövdesinden mümkün olduğunca uzak tutuldu. Kan damarlarındaki kırmızı kan hücrelerinin (siyah noktalar) hızlı akışı mikroskop altında gözlendi. Bir oküler lens altında doku alanını bulduktan sonra, mikroskop yazılımını manipüle etmek için geçiş yapılmalıdır. Kontrol grubunda, her iki izleyici de fare SMG'sinin kan damarlarında mevcuttu. Özellikle, küçük moleküler ağırlığı nedeni...

Bu protokolde, submandibuler bezin (SMG) endotel bariyer fonksiyonu, iki fotonlu lazer taramalı mikroskop altında test hayvanı modellerinin açısal damarlarına in vivo olarak farklı moleküler ağırlıklı floresan izleyiciler enjekte edilerek değerlendirilmiştir.

İn Vivo Fare Submandibuler Bezinde Vasküler Geçirgenlik Tespiti

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

Bu protokol, fare submandibuler bezlerindeki sıkı endotel kavşaklarının işlevini değerlendirmek için in vivo parasellüler geçirgenlik tespit önlemini açıklamaktadır. Bununla birlikte, iki foton lazer tarama mikroskobu, sadece geleneksel konfokal mikroskopinin avantajına sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda daha derin doku ve görüntüyü daha net bir şekilde tespit etmek için de kullanılabilir. Bu deney, farklı dokuların vasküler geçirgenliğini, özellikle de hayvanların yüzey dokularını ve organlarını değerlendirmek için iyi bir yöntem ölçüsü sağlar.Geçirgenlik testi için floresan sinyalleri arasındaki paraziti en aza indirmek için floresein, izotiyosiyanat, etiketli dekstran ve farklı uyarma emisyon spektrumlarına sahip dekstran etiketli Rhodamine B gibi uygun izleyicileri seçerek başlayın. İzleri steril fosfat tamponlu salin halinde mililitre stoklar başına 100 miligram halinde seyreltin ve ışıktan korunan alikotları eksi 20 santigrat derecede saklayın. 8 ila 10 haftalık erkek vahşi tip fareyi anestezi altına aldıktan sonra, göz küresinin bir tarafının hafifçe çıkıntı yapmasını sağlamak için farenin başını ve boynunu yavaşça tutun.Gözün köşesi boyunca 100 mikrolitre floresan izleyici çözeltisi karışımı içeren bir insülin şırıngasını göze dik açıyla yerleştirin. Enjeksiyondan sonra, fareyi kartonun üzerine, uzuvları ve başı bantlanmış olarak sırtüstü pozisyonda hızlı bir şekilde yerleştirin. Submandibuler bez veya SMG izolasyonu için, stereoskopik mikroskop altında, SMG'lerin her iki tarafını da açığa çıkarmak için boynun epidermisini genel doku makası ile kesin.Daha sonra, bez dokusuna, kan damarlarına ve glandüler yapıya zarar vermeden kapsülü bez yüzeyinden nazikçe ayırmak için künt bir doku ayırma iğnesi kullanın. Özelleştirilmiş tutucuyu negatif basınç cihazına bağlayın ve negatif basınç etkisinin önceden uygun şekilde elde edilip edilmediğini kontrol edin. Açıkta kalan SMG'yi özelleştirilmiş tutucuya yavaşça yerleştirin ve solunum ve diğer koşulların neden olduğu hareket artefaktlarını azaltmak için negatif basınçlı emme yoluyla, fare gövdesinden mümkün olduğunca uzağa negatif basınçlı emme ile dokuyu emer.Bezin yeri seçildikten kısa bir süre sonra görüntülemeye başlayın. Z ekseni boyunca sıralı görüntüler elde etmek, üç boyutlu bir yapı oluşturmak için bezin yüzeyinden 70 ila 140 mikrona kadar dokuya iki mikron adım attı. Daha sonra, SMG'de vasküler geçirgenliği ölçmek için damarların hızlandırılmış görüntülemesini edinin.Explorer iletişim kutusunda, Yeni Klasör Ekle'ye tıklayın ve dosya adını değiştirin. Ardından, edinme sütununa geri dönün. XY'de, format 512 x 512'dir ve hız 400 hertz'dir.Çift yönlü X" i açın, yakınlaştırma için yakınlaştırma faktörünü 0,75 ve 1,5 olarak ayarlayın. Ardından, hızlandırılmış görüntüleme elde etmek için "Edinme Modu" altında XYT'yi seçin. Süreyi deneysel ihtiyaca göre 20 saniye, 30 dakika veya daha uzun olarak ayarlayın.Koşulları ayarladıktan sonra, fotoğraf oluşturan çerçevedeki iki kanalın ve üst üste binen kanalların vasküler görüntülemesini gözlemlemek ve ilgi alanlarını seçmek için "Canlı" ya tıklayın. Görüntülemeye başlamak için Başlat'a tıklayın. In vivo vasküler geçirgenlik testi ve farelerde kan damarlarının üç boyutlu görüntüleri.Submandibuler bezler burada gösterilmiştir. Kontrol grubunda, her iki izleyici de SMG'nin kan damarlarında mevcuttu. Küçük moleküler ağırlığı nedeniyle, FD4 kan damarlarından acini ve kanalların bazal taraflarına sızabildi, böylece acini ve kanalların şeklini açıkça tasvir etti.RD70, büyük boyutlu kan damarlarına ve mikro damarlara dağıtıldı. Kanal ligasyon grubunda, hem FD4 hem de RD70, aksinin bazal taraflarına ekstravaze edildi, bu da kanal ligasyonunun endotel bariyer fonksiyonunu bozabileceğini ve büyük moleküllere geçirgenliği artırabileceğini gösterdi. Ayrıca, yarı kantitatif FD4 ve RD70 floresan yoğunluğu sonuçları bu gözlemleri doğruladı.Üç boyutlu görüntüler, ligasyon grubundaki kan damarları etrafında FD4 ve RD70'in kontrol grubuna kıyasla çok daha belirsiz floresansını gösterdi. Dikkatli SMG izolasyonu ve uygun yerleştirme ve mikroskop, başarılı bir tespit için temel ön koşullardır. İşlemleri takiben, kırmızı kan hücrelerinin hareketi evlenerek kan akış hızı hesaplanabilir ve floresan etiketli kan hücrelerinin infiltrasyonu kovalanabilir.

in-vivo-vascular-permeability-detection-in-mouse-submandibular-gland

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

An<em&gt; In vivo</emKan Gemi Geçirgenlik Test&gt; Test

Endotelyal endotel / glycocalyx yüzey tabakası ideal intravital mikroskobu kullanılarak incelenmiştir. Intravital mikroskop teknik gibi akciğer gibi hareketli bir organ zordur. Biz eş zamanlı aydınlık ve floresan mikroskop serbestçe-hareket eden endotel yüzey tabakasının kalınlığını belirlemede nasıl kullanılabileceğini...

Fare Pulmoner Endotelyal Yüzey Katman in vivo ölçümü olarak

Intravital mikroskopi canlı hayvanlarda çeşitli biyolojik süreçleri görüntüleme sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yazıda, canlı farelerde tükürük bezlerinde bu salgılama granüller gibi alt-hücresel yapıların, dinamiklerini görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Bu yazıda, iltihaplanmanın iki farklı deneysel modelindeki temel matris metalloproteinazların in vivo aktivitesini görselleştirmek için aktive edilebilir bir optik görüntüleme probu kullanılarak floresan görüntülemenin uygulanmasını açıklanmaktadır.

Non-invaziv<emIn vivo</em&gt; Aktive Edilebilir Floresan Görüntüleme Ajanını Kullanan İnflamatuvar MMP Aktivitesinin Flüoresan Optik Görüntülemesi

Burada bir fare beyin damar geçirgenliği tahlil mayi enjeksiyon kan - beyin bariyerini disfonksiyon hayvan modelleri için geçerlidir perfüzyon ardından floresan tarayıcıları kullanarak mevcut. Bir hemi-beyin geçirgenliği kantitatif değerlendirilmesi ve diğer izleme görselleştirme/immunostaining için kullanılır. Yordamı 5-6 h 10 fareler için alır.

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Biz cerrahi olarak ortaya çıkarmak ve fare submandibular Tükürük bezi dik intravital mikroskobu kullanılarak intravital görüntüleme için stabilize etmek için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı diğer ekzokrin bezleri için baş ve boyun bölgesinin fareler ve diğer küçük kemirgen kolayca uyarlanabilir.

Dik Intravital mikroskopi için fare Submandibular Tükürük bezi hazırlanması

Anlayış Tükürük bezi Biyoloji ve roman therapeutics gelişimi için yerel ilaç dağıtım submandibular bezleri için ilgilendirir. Biz teslim doğruluk ve deneysel tekrarlanabilirlik artırmak için tasarlanmış bir güncel ve ayrıntılı retroductal enjeksiyon Protokolü mevcut. Burada sunulan polimer nano tanecikleri teslimini uygulamasıdır.

Fare Submandibular bezi Retroductal nanopartikül enjeksiyon

Burada, fare deri içine geçirgenliği teşvik ajanların intradermal yönetimi tarafından indüklenen vasküler sızıntı ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu teknik yeteneği teşvik veya vasküler sızıntı engelleyen veya vasküler geçirgenliği düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için moleküllerin belirlemek için kullanılabilir.

Vasküler Hyperpermeability indükleyici ajanlar cilt mil tahlil ile değerlendirilmesi

Mevcut protokol, lazer taramalı konfokal ve multifoton mikroskobu ile emziren fare meme bezinin intravital görüntülenmesi için kolay bir tekniği tanımlamaktadır.

Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

İmmünofloresan görüntüleme, karmaşık, zamana bağlı biyolojik süreçleri zaman içinde tek bir anlık görüntüde gözlemleme yeteneği ile sınırlıdır. Bu çalışma, hassas kesilmiş fare submandibular bez dilimleri üzerinde yürütülen canlı görüntüleme yaklaşımını özetlemektedir. Bu yaklaşım, homeostaz ve rejenerasyon ve onarım süreçleri sırasında hücre-hücre etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine izin verir.

Tükürük bezindeki hücre-hücre etkileşimlerinin ex vivo canlı hücre görüntüleme ile sorgulanması

Bu protokolün amacı, fırın diş eti epitel bariyerinin bütünlüğünü nicel olarak değerlendirmek için standart bir yaklaşım sağlamaktır; diş eti yüzeyine farklı moleküler boyutlarda floresans etiketli dekstransları in vivo uygulanarak ve ardından tek foton mikroskopi sistemiyle ex vivo görüntüleme uygulanır.

Fusesans İzleyicilerle Fare Diş Etili Epitelyal Bariyerinin Fonksiyonel Değerlendirmesi

Keşfedin fare submandibuler bezinde vasküler geçirgenlik tespiti yöntemini. İki foton lazer tarama mikroskobisi ile endotel bariyer fonksiyonunu değerlendirin ve damarsal geçirgenliği in vivo ortamda ölçün.

İn Vivo Fare Submandibuler Bezinde Vasküler Geçirgenlik Tespiti

Daha fazla video keşfet