Name: İnfluenza A Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Proteinleri Parçalayan Kaspasların ve Motiflerinin Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Keşfedin, İnfluenza A virüsü enfeksiyonunda kaspazların parçaladığı proteinleri ve motifleri belirlemek için moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak. Bu yöntem, viral patogenez ve antiviral stratejiler için kritik bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazar, Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Kaynakları (NIAID), Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi, Maurice ve Phyllis Paykel Vakfı (Yeni Zelanda), HS ve J.C. Anderson Trust (Dunedin) ve Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü ve Biyomedikal Bilimler Okulu'nu (Otago Üniversitesi) kabul ediyor.

IAV ve memeli hücreleriyle çalışmak için Otago Üniversitesi Kurumsal Biyolojik Güvenlik Komitesi'nden düzenleyici onaylar alındı. Bu çalışmada Madin-Darby Köpek Böbreği (MDCK) veya insan akciğer alveoler epitel A549 hücreleri ve IAV H1N1 alt tipleri kullanılmıştır. IAV, başka bir yerde açıklandığı gibi tavuk yumurtasında yetiştirildi17. Memeli hücreleriyle çalışmak için steril ve aseptik koşullar kullanıldı ve IAV alt tipleriyle çalışmak için bir Biyogüvenlik Seviye 2 (veya Fiziksel Muhafaza 2) tesisi ve Sınıf II biyogüvenlik kabini kullanıldı.
1. IAV ile enfekte olmuş hücrelerdeki proteinlerin kaspazlar tarafından bölünmesinin veya parçalanmasının değerlendirilmesi
<ol><li>12 delikli bir hücre kültürü plakasında kuyu başına 3 x 105 MDCK veya A549 hücrelerini tohumlayın. NOT: MDCK hücreleri kullanıyorsanız, ilgili proteine karşı antikorun köpek türlerini tanıdığından emin olun.</li>
	<li>Kuyucukları çiftler halinde tohumlayın, yani enfekte edilmemiş sahte numune için bir kontrol çifti - bir kuyu ve enfekte edilmiş-sahte numune için bir kuyu - ve enfekte edilmemiş inhibitör A numunesi için bir test çifti - bir kuyu ve enfekte inhibitör A numunesi için bir tane. Her ek inhibitör ile çift sayısını artırın (bkz. referans 7,8).</li>
	<li>Hücreleri gece boyunca% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, hücreleri IAV (bir H1N1 alt tipi veya başka bir alt tip) ile enfekte edin.<ol><li>Bunun için, virüs stokunu 400 μL serumsuz minimum esansiyel ortamda (MEM) seyrelterek virüs inokulunu, 0.5-3.0 plak oluşturan birim (pfu) / hücre 7,11 (MOI'yi hesaplarken hücre sayısının iki katına çıkmasının bir faktörü) çokluğunda (MOI) seyrelterek hazırlayın. NOT: MDCK hücrelerini enfekte etmek için, virüs inokulumunu, 1 μg / mL'lik son konsantrasyonda tosil fenilalanil klorometil keton (TPCK)-tripsin ile destekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Eski kültür ortamını hücrelerden çıkarın (adım 1.3) ve hücreleri 1 mL / serumsuz MEM 2x kuyucuğu ile yıkayın.</li>
	<li>Hücrelere 400 μL virüs inokulumu (adım 1.4.1) ekleyin ve% 5'lik bir CO2 atmosferi altında 35 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Bu arada, bir kaspaz inhibitörü (örneğin, Z-DEVD-FMK), bir lizozom İnhibitörü (örneğin, NH4Cl) veya bir proteazom inhibitörü (örneğin, MG132) (bakınız Malzeme Tablosu) serumsuz MEM7'de sırasıyla 40 μM, 20 mM veya 10 μM'lik bir son konsantrasyonda seyreltin (bkz. Son iki inhibitör bir kontrol görevi görür. İnhibitörlerden birini serumsuz ortamda alay olarak yeniden oluşturmak için kullanılan çözücünün eşit hacmini (su dışındaysa) seyreltin.</li>
	<li>Virüs inokulumunu çıkarın ve hücreleri adım 1.5'te (1x) olduğu gibi yıkayın.</li>
	<li>Serumsuz MEM'i, 1 mL / kuyucuk, sahte veya bir inhibitör ile takviye edilmiş hücrelere ekleyin ve hücreleri adım 1.6'da olduğu gibi inkübe edin. Bu zaman noktası 0 saatlik enfeksiyon olarak kabul edilir.</li>
	<li>24 saat sonra, hücreleri 1 mL'lik bir şırınga pistonu (kauçuk taraf) ile kazıyarak toplayın ve 1,5 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın.</li>
	<li>Tüpü oda sıcaklığında 1-2 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın. Bir pipet kullanarak süpernatantı toplayın. NOT: Bu süpernatant, salınan virüs soyunun titresini ölçmek için bir plak testi8 için atılabilir, kullanılabilir.</li>
	<li>Hücre peletini 250 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile adım 1.11'de olduğu gibi yeniden santrifüjleme ile yıkayın.</li>
	<li>80-100 μL hücre lizis tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl,% 0.5 sodyum dodesil sülfat (SDS),% 0.5 sodyum deoksikolat,% 1 Triton X-100 ve 1x proteaz inhibitörü kokteyli, Malzeme Tablosuna bakınız) ve vorteks ekleyerek süpernatantı çıkarın ve hücreleri lize edin.</li>
	<li>Tamamen lize etmek ve toplam hücre lizatını hazırlamak için tüpü 98 ° C'de 10 dakika ısıtın. Ertesi gün 1.15-1.17 adımlarını gerçekleştirmek için lizatları 4 ° C'de saklayın, ancak en iyi sonuç için bu adımları aynı gün içinde tamamlayın.</li>
	<li>Bir BCA tahlil kiti kullanarak her numunedeki protein miktarını tahmin edin (bkz.</li>
	<li>Enfekte olmamış ve enfekte olmuş numunelerden eşit miktarda proteini, standart SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)11 ve moleküler ağırlık belirteçleri 11 ile çözün.</li>
	<li>Proteini bir nitroselüloz veya poliviniliden diflorür (PVDF) membranına aktarın (bkz. NOT: PVDF membran bazı batı leke görüntüleyicilerinde yüksek bir arka plan verebilir; uyumluluğu kontrol edin.</li>
	<li>Başka bir yerde açıklanan yöntemi kullanarak ilgilenilen proteini tespit etmek için batı lekelemesi yapın11.</li>
	<li>Alay ile tedavi edilmiş ve inhibitör ile muamele edilmiş enfekte numune şeritlerindeki protein seviyelerini karşılaştırın. NOT: Protein seviyesi, kaspaz inhibitörü ile tedavi edilen enfekte numune şeridinde iyileşmişse, protein kaspazlar tarafından parçalanır veya parçalanır. Aksi takdirde, lizozom veya proteazom tarafından parçalanır.</li>
	<li>Her şeritteki bant yoğunluğunu aynı deneyin en az üç kopyasından ölçerek ve karşılık gelen yükleme kontrol bandı ile normalleştirerek protein geri kazanımını ölçün.</li>
	<li>Batı lekelerini görüntülemek ve protein geri kazanımını ölçmek için herhangi bir çağdaş görüntüleyiciyi ve ilgili yazılımı kullanın (bkz.</li>
</ol>2. RNA girişimi ile IAV ile enfekte olmuş hücrelerde kaspaz aracılı bölünmenin veya proteinlerin parçalanmasının doğrulanması
<ol><li>Köpek veya insan kaspaz 3, kaspaz 6 ve kaspaz 7'yi (cellat kaspazları1) ve hedeflemeyen bir kontrol siRNA'sını (bkz.</li>
	<li>Her bir siRNA'yı MDCK veya A549 hücrelerine ters transfeksiyon 8,11 ile iletin.</li>
	<li>Bunun için, 100 nM kontrol siRNA veya kaspaz siRNA veya önerilen hacimde transfeksiyon reaktifini ( bakınız Malzeme Tablosu) ayrı tüplerde 100 μL uygun ortamda (OptiMEM gibi, Malzeme Tablosuna bakınız) seyreltin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Her seyreltmeyi çift olarak hazırlayın. NOT: Bu kopya, RT-qPCR veya batı lekelenmesi (kaspazlara karşı antikorlar varsa) ile kaspaz ekspresyonunun nakavtını analiz etmek için bir kopya ve batı lekeleme ile ilgili proteinin geri kazanımını değerlendirmek için bir başka kopya içerir.</li>
	<li>Her siRNA çözeltisinin 100 μL'sini 100 μL transfeksiyon reaktif çözeltisi (adım 2.3) ile karıştırın ve siRNA-transfeksiyon reaktif kompleksini oluşturmak için oda sıcaklığında 20-45 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Bu arada, tam büyüme ortamının 800 μL'sine 1 x 105 MDCK veya A549 hücrelerini bölün ve ekleyin, 200 μL siRNA-transfeksiyon reaktif kompleksi ile karıştırın (adım 2.5) ve süspansiyonun 1 mL'sini 12 kuyucuklu bir kültür plakasının bir kuyucuğuna ekleyin. Bu seyreltme, kontrol siRNA veya kaspaz siRNA'nın son konsantrasyonunu 10 nM'ye getirir.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C'de% 5'lik bir CO 2 atmosferi altında72 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri adım 1.10'da olduğu gibi bir replikasyondan toplayın ve standart yöntemler ve protokoller8,11 kullanarak, sırasıyla RT-qPCR veya batı lekelenmesi ile kaspaz 3, kaspaz 6 ve kaspaz 7 ekspresyonunun nakavtını doğrulamak veya onaylamak için bunları işleyin.</li>
	<li>Diğerindeki hücreleri enfekte etmek, adım 1.4-1.9'da (inhibitörler olmadan) açıklandığı gibi IAV ile çoğalır.</li>
	<li>24 saat sonra, batı lekelemesi ile hücreleri hasat edin, işleyin ve analiz edin ve 1.10-1.20 adımlarında açıklandığı gibi protein geri kazanımını ölçün ve ölçün.</li>
</ol>3. Polipeptitteki kaspaz bölünme bölgelerini bulmak için bölgeye yönelik mutagenez
<ol><li>İlgilenilen gen kodlayıcı proteini bir memeli ekspresyonu plazmidi11'e klonlayın veya bir araştırma laboratuvarından veya ticari kaynaktan elde edin (bkz. NOT: Gen, ektopik olarak eksprese edilen polipeptiti batı lekelenmesi sırasında endojen olarak eksprese edilenden ayırt etmek için bir epitop etiketi ile veya GFP füzyonu olarak klonlanırsa tercih edilir.</li>
	<li>Kaspaz substrat veritabanları4 veya protein hizalama araçlarını kullanarak, polipeptit üzerindeki konsensüs kaspaz bölünme motiflerini, XXXD ve DXXD'yi bulun. Hemen hemen tüm kaspaz bölünme motifleri bölünme bölgesinde aspartik aside sahiptir (P1)3,4.</li>
	<li>Varsayılan P1 aspartik asidi glutamik aside veya polar olmayan bir amino aside (alanin, valin) bölgeye yönelik mutagenez ile mutasyona uğratın ve ardından standart yöntemler ve protokolleri kullanarak DNA dizilimi11 yapın.</li>
	<li>Vahşi tip (WT) ve mutant plazmid DNA'sını ters transfeksiyon11 ile MDCK veya A549 hücrelerine iletin.<ol><li>Bunun için, 2 μg plazmid DNA'sını veya transfeksiyon reaktifinin önerilen hacmini, uygun bir ortamın 100 μL'sinde (bkz. adım 2.3 ve Malzeme Tablosu) ayrı tüplerde seyreltin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Her plazmid DNA çözeltisinin 100 μL'sini transfeksiyon reaktif çözeltisinin 100 μL'si ile karıştırın ve DNA-transfeksiyon reaktif kompleksini oluşturmak için oda sıcaklığında 20-45 dakika inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bu arada, tam büyüme ortamının 800 μL'sine 3 x 105 MDCK veya A549 hücrelerini bölün ve ekleyin, 200 μL DNA transfeksiyon reaktif kompleksi ile karıştırın ve 1 mL süspansiyonu 12 delikli bir kültür plakasının bir kuyucuğuna ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri% 5'lik bir CO 2 atmosferi altında 37 ° C'deinkübe edin.</li>
	<li>48 saat sonra, hücreleri adım 1.4-1.9'da açıklandığı gibi IAV ile enfekte edin (inhibitörleri eklemeden).</li>
	<li>24 saat sonra, hücreleri batı lekelenmesiyle toplayın, işleyin ve analiz edin (varsa, bir epitop etiketine veya GFP'ye karşı antikoru kullanarak). Ardından, 1.10-1.20 adımlarında açıklandığı gibi protein geri kazanımını ölçün ve ölçün.</li>
</ol>

<ol><li>Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANoptosis+in+microbial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PANoptosis in microbial infection.</a> Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).</li>
<li>Zheng, M., Kanneganti, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+ZBP1-NLRP3+inflammasome+and+its+implications+in+pyroptosis%2C+apoptosis%2C+and+necroptosis+%28PANoptosis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis).</a> Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).</li>
<li>Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+hijacking+of+host+caspases%3A+An+emerging+category+of+pathogen-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).</li>
<li>Julien, O., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+and+their+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspases and their substrates.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).</li>
<li>Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benefits+and+perils+of+necroptosis+in+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection.</a> Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).</li>
<li>Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus-induced+apoptosis+and+virus+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation.</a> Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).</li>
<li>Chen, D. Y., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+degradation+of+host+cortactin+that+promotes+influenza+A+virus+infection+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells.</a> Virology. 497, 146-156 (2016).</li>
<li>Galvin, H. D., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus-induced+host+caspase+and+viral+PA-X+antagonize+the+antiviral+host+factor%2C+histone+deacetylase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).</li>
<li>Husain, M., Harrod, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus-induced+caspase-3+cleaves+the+histone+deacetylase+6+in+infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells.</a> FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).</li>
<li>Husain, M., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+6+inhibits+influenza+A+virus+release+by+downregulating+the+trafficking+of+viral+components+to+the+plasma+membrane+via+its+substrate%2C+acetylated+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).</li>
<li>Chen, D. Y., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+cleavage+of+human+cortactin+during+influenza+A+virus+infection+occurs+in+its+actin-binding+domains+and+is+associated+with+released+virus+titres%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres.</a> Viruses. 12 (1), 87(2020).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+pathogenicity+is+determined+by+caspase+cleavage+motifs+located+in+the+viral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Genetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins.</a> Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+caspase+cleavage+motifs+of+NP+and+M2+proteins+attenuate+virulence+of+a+highly+pathogenic+avian+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus.</a> Virology. 394 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-dependent+N-terminal+cleavage+of+influenza+virus+nucleocapsid+protein+in+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).</li>
<li>Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+cleavage+of+murine+norovirus+NS1%2F2+potentiates+apoptosis+and+is+required+for+persistent+infection+of+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells.</a> PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940(2019).</li>
<li>Richard, A., Tulasne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleavage+of+viral+proteins%2C+another+way+for+viruses+to+make+the+best+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis.</a> Cell Death & Disease. 3 (3), 277(2012).</li>
<li>Brauer, R., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+propagation+in+embryonated+chicken+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52421(2015).</li>
<li>Lüthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CASBAH%3A+A+searchable+database+of+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The CASBAH: A searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).</li>
<li>Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleavage+sites+in+the+human+proteome%3A+CaspDB%2C+a+database+of+predicted+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates.</a> PLoS One. 9 (10), 110539(2014).</li>
<li>Igarashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CutDB%3A+A+proteolytic+event+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research.+35+%28Database+issue%29%22%5BJournal%5D)">CutDB: A proteolytic event database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).</li>
<li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DegraBase%3A+A+database+of+proteolysis+in+healthy+and+apoptotic+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).</li>
<li>Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+The+peptidase+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MEROPS: The peptidase database.</a> Nucleic Acids Research. 32, Database issue 160-164 (2004).</li>
<li>Lange, P. F., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopFIND%2C+a+knowledgebase+linking+protein+termini+with+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function.</a> Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).</li>
<li>Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+TopFIND+3.0+with+TopFINDer+and+PathFINDer%3A+Database+and+analysis+tools+for+the+association+of+protein+termini+to+pre-+and+post-translational+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events.</a> Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).</li>
</ol>

Yazarın açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Virüslerin konakçı faktörleri ve yolları kendi yararlarına göre uyarladıkları tespit edilmiştir. Buna karşılık, konakçı hücreler çeşitli stratejiler kullanarak buna direnirler. Bu stratejilerden biri, konakçı hücrelerin virüs enfeksiyonlarına karşı antiviral bir strateji olarak kullandıkları PANoptozdur. Bununla birlikte, IAV gibi virüsler, PANoptoza karşı koymak ve onu kendi avantajlarına göre kullanmak için kendi stratejilerini geliştirmiştir 1,3,6<sup class="x...

İnfluenza A virüsü (IAV), Orthomyxoviridae ailesinin prototipik üyesidir ve küresel salgınlara ve öngörülemeyen pandemilere neden olduğu bilinmektedir. IAV, genellikle "grip" olarak bilinen insan solunum yolu hastalığına, influenzaya neden olur. Grip, konakçı pro- ve anti-inflamatuar doğuştan gelen immün yanıtların indüksiyonu ve insan solunum yollarında epitel hücrelerinin ölümü ile sonuçlanan akut bir hastalıktır. Her iki süreç de programlanmış hücre ölümü1 adı verilen bir fenomen tarafından yönetilir. Programlanmış hücre ölümü için sinyalizasyon, çeşitli patojen tanıma reseptörleri konakçı hücrelerde gelen virüs parçacıklarını algıladığı anda indüklenir. Bu, enfekte olmuş hücrelerin ölümünün programlanmasına ve komşu sağlıklı hücrelere, pirotoz, apoptoz ve nekroptoz adı verilen birbirine bağlı üç yolla sinyal verilmesine yol açar - son zamanlarda tek bir süreç olarak adlandırılan PANoptoz1.
PANoptoz, indüksiyondan uygulamaya kadar birçok konakçı ve viral proteinin proteolitik olarak işlenmesini içerir. Proteinlerin bu şekilde işlenmesine öncelikle kaspazlar 1,2 adı verilen bir sistein proteaz ailesi öncülük eder. 18'e kadar kaspaz (kaspaz 1'den kaspaz 18'e)3 olarak bilinir. Çoğu kaspaz pro-kaspaz olarak ifade edilir ve virüs enfeksiyonu gibi bir uyarana yanıt olarak otokataliz veya diğer kaspazlar4 ile kendi proteolitik işlemlerinden geçirilerek aktive edilir. IAV ile enfekte olmuş hücrelerin PANoptozunun bir konakçı savunma mekanizması olduğu düşünülüyordu, ancak IAV, replikasyonunu kolaylaştırmak için ondan kaçınmanın ve yararlanmanın yollarını geliştirdi 1,2,5,6. Bunlardan biri, konakçı faktörleri, doğal olarak antiviral olan veya IAV yaşam döngüsünün adımlarından birine müdahale eden kaspaz aracılı bölünme veya bozunma yoluyla antagonize etmektir. Bu amaçla, konakçı faktörler, kortaktin, HDAC4 ve HDAC6'nın IAV ile enfekte epitel hücrelerinde kaspaz aracılı bölünme veya bozulmaya uğradığı keşfedilmiştir 7,8,9. HDAC4 ve HDAC6, anti-IAV faktörleri 8,10'dur ve kortaktin, enfeksiyonun sonraki bir aşamasında, potansiyel olarak viral montaj ve tomurcuklanma sırasında IAV replikasyonuna müdahale eder 11.
Ek olarak, çeşitli kaspazlar da aktive edilir, bu da IAV enfeksiyonu 1,2 sırasında konakçı enflamatuar yanıtını aktive etmek için birden fazla proteini parçalar. Ayrıca, nükleoprotein (NP), IAV 12,13,14'ün iyon kanallı M2 proteini ve diğer virüslerin çeşitli proteinleri 3,15,16 da enfeksiyon sırasında kaspaz aracılı bölünmeye uğrar ve bu da viral patogenezi etkiler. Bu nedenle, viral patogenezin moleküler temelini anlamak için IAV ve diğer virüs enfeksiyonları sırasında konakçı ve viral proteinlerin kaspaz aracılı bölünmesini veya parçalanmasını incelemeye sürekli ihtiyaç vardır. Burada, yöntemler (1) bu tür proteinlerin kaspazlar tarafından bölünmesini veya parçalanmasını değerlendirmek, (2) bu kaspazları tanımlamak ve (3) bölünme bölgelerini bulmak için sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>A549 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td>İnsan, epitel, akciğer</td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Kaspaz 3 İnhibitörü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>264156-M</td><td>'Çözelti İçi Kaspaz-3 İnhibitörü II - Calbiochem'cOmplete</td></tr><tr><td>, Mini Proteaz İnhibitörü Kokteyli</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-NP olarak da bilinir Richard</td> Webby'den antikor <td></td><td></td><td>Hediyesi (St Jude Children' s Araştırma Hastanesi, Memphis, ABD) - MH</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>MDCK hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>Köpek, epitel, böbrek</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7449</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Temel Orta (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11095080</td><td>Gerektiği gibi L-glutamin, antibiyotik veya diğer takviyeleri ekleyin</td></tr><tr><td>MİSYON siRNA Evrensel Negatif Kontrol #1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIC001</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc görüntüleyici, Image Studio Lite yazılımı 5.2&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Odyssey Fc, Odyssey XF ile değiştirildi ve Image Studio Lite yazılımı, Empiria Studio yazılımı ile değiştirildi.</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>İnsan kortaktin-GFP füzyonunu eksprese eden Plazmid&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>50728</td><td>Kenneth Yamada'dan Addgene'ye Hediye</td></tr><tr>Kaspaza 3 <td>Sigma-Aldrich</td><td>NM_004346</td><td>siRNA ID'ye</td><td>önceden tasarlanmış küçük enterferans yapan RNA (siRNA):</td> SASI_Hs01_00139105</tr><tr><td>Kaspaz'a önceden tasarlanmış küçük enterferans yapan RNA 6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NM_001226</td><td>siRNA ID: SASI_Hs01_00019062</td></tr><tr><td>Kaspaz'a önceden tasarlanmış küçük enterferans yapan RNA 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NM_001227</td><td>siRNA ID: SASI_Hs01_00128361</td></tr><tr><td>Önceden tasarlanmış SYBR Green RT-qPCR Primer çiftleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>KSPQ12012</td><td>Primer Çifti Kimlikleri: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1</td></tr><tr><td>Protran Premium nitroselüloz membran</td><td>Cytiva (Fomerly GE Healthcare)</td><td>10600003</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-aktin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-kortaktin antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>3502</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-GFP antikoru</td><td>Takara</td><td>632592</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Önceden Boyanmış Protein Standardı</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>LC5625</td><td></td></tr><tr><td>Transfeksiyon ortamı, Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodyum Deoksikolat, Triton X-100</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsin, TPCK ile Tedavi Edilmiş</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4370285</td><td></td></tr></tbody></table>

İnfluenza a virüsü enfeksiyonu sırasında proteinleri parçalayan kaspasların ve motiflerinin belirlenmesi

Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection

Sistein proteazlarının bir ailesi olan kaspazlar, mikrobiyal enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara yanıt olarak programlanmış hücre ölümünü düzenler. Başlangıçta apoptoz ile ortaya çıktığı tanımlanan programlanmış hücre ölümünün şimdi birbirine bağlı üç yolu kapsadığı bilinmektedir: pirotoz, apoptoz ve nekroptoz, birlikte tek bir süreç olarak adlandırılan PANoptoz. Etki Bir virüs (IAV) enfeksiyonu, farklı kaspazların aktivasyonunu indükleyerek memeli hücrelerinde PANoptozu indükler, bu da çeşitli konakçıların yanı sıra viral proteinleri de parçalara ayırır ve konakçının doğuştan gelen antiviral yanıtının aktivasyonu veya antagonistik konakçı proteinlerinin bozulması gibi süreçlere yol açar. Bu bağlamda, IAV enfeksiyonuna yanıt olarak hem hayvan hem de insan epitel hücrelerinde konakçı kortaktin, histon deasetilaz 4 (HDAC4) ve histon deasetilaz 6'nın (HDAC6) kaspaz 3 aracılı bölünmesi keşfedilmiştir. Bunu göstermek için, inhibitörler, RNA girişimi ve bölgeye yönelik mutagenez kullanıldı ve daha sonra, bölünmeye karşı bölünme veya direnç ve kortaktin, HDAC4 ve HDAC6 polipeptitlerinin geri kazanımı batı lekelenmesi ile ölçüldü. Bu yöntemler, RT-qPCR ile birlikte, IAV veya diğer insan ve hayvan virüslerinin enfeksiyonu sırasında kaspaz aracılı bölünmeye maruz kalan viral proteinlerin yanı sıra konakçıyı tanımlamak için basit ama etkili bir strateji oluşturur. Mevcut protokol, bu stratejinin temsili sonuçlarını detaylandırmakta ve daha etkili hale getirmenin yolları da tartışılmaktadır.

Kaspaz 3 inhibitörü ile tedavi Konakçı kortaktin, HDAC4 ve HDAC6 polipeptitlerinin hem köpek (MDCK) hem de insan (A549, NHBE) hücrelerinde IAV enfeksiyonuna yanıt olarak bozulmaya uğradığı keşfedilmiştir 7,8,9. Yukarıdaki yaklaşımlar kullanılarak, IAV kaynaklı konak kaspazlarının, özellikle kaspaz 3'ün, 7,8,9 oranınd...

İnfluenza A virüsü (IAV) enfeksiyonu, konakçı ve viral proteinleri parçalayan kaspazları aktive eder ve bunlar da pro- ve antiviral fonksiyonlara sahiptir. İnhibitörler, RNA girişimi, bölgeye yönelik mutagenez ve batı lekelenme ve RT-qPCR teknikleri kullanılarak, konakçı kortaktin ve histon deasetilazları parçalayan enfekte memeli hücrelerinde kaspazlar tanımlandı.

İnfluenza A Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Proteinleri Parçalayan Kaspasların ve Motiflerinin Belirlenmesi

Caspases, a family of cysteine proteases, orchestrate programmed cell death in response to various stimuli, including microbial infections. Initially ...

Bu yöntem, influenza virüsü ile enfekte olmuş hücrelerdeki bir proteinin kaspazlar tarafından bozulmaya veya bölünmeye uğrayıp uğramadığını belirlemeye ve doğrulamaya ve kaspaz bölünme bölgelerini tanımlamaya yardımcı olacaktır. Bu yöntem sadece temel moleküler ve hücresel biyoloji laboratuvar ortamlarını ve araştırma becerilerini gerektirir ve herhangi bir özel ekipman veya yazılım eğitimi gerektirmez. Bu yöntem, diğer hayvan virüsleri veya mikropları ile enfeksiyonu ve toksinler ve kimyasallar gibi dış uyaranlara maruz kalmayı içeren benzer hedeflere ulaşmak için uyarlanabilir.Başlamak için, 12 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasında MDCK veya A549 hücrelerini tohumlayın. Hücreleri% 5'lik bir karbondioksit atmosferi altında gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, eski kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve her bir kuyucuktaki hücreleri bir mililitre serumsuz MEM ile iki kez yıkayın.Daha sonra, 400 mikrolitre influenza A virüsü inokülü ekleyerek hücreleri enfekte edin ve plakayı bir saat boyunca inkübasyon için yerleştirin. Kuluçkadan sonra, virüs inokulumunu çıkarın ve hücreleri MEM ile yıkayın. Her bir kuyucuğa bir mililitre serumsuz MEM ekleyin ve hücreleri önceki adımda gösterildiği gibi inkübe edin.24 saat sonra, hücreleri bir mililitrelik bir şırınga pistonuyla kazıyarak toplayın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü oda sıcaklığında iki dakika boyunca 12.000G'de santrifüj yapın ve süpernatanı toplayın. Hücre peletini 250 mikrolitre fosfat tamponlu salin ve santrifüj ile yıkayın.Süpernatantı çıkarın ve 100 mikrolitre hücre lizis tamponu ekleyin. Girdap ile karıştırın. Hücreleri tamamen lize etmek için tüpü 98 santigrat derecede 10 dakika ısıtın.Daha sonra, enfekte olmamış ve enfekte olmuş numunelerden eşit miktarda proteini standart SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile çözün. Elektroforezden sonra, protein jelini bir nitroselüloz veya PVDF membranına aktarın ve Batı lekelemesi yapın. Alay ile tedavi edilmiş ve inhibitör ile muamele edilmiş enfekte numune şeritlerindeki protein seviyelerini karşılaştırın.Opti-MEM gibi 100 mikrolitre uygun ortamda, 100 nanomolar kontrol veya kaspaz siRNA veya uygun hacimde transfeksiyon reaktifi seyreltin. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her siRNA çözeltisinin 100 mikrolitresini 100 mikrolitre transfeksiyon reaktif çözeltisi ile karıştırın ve oda sıcaklığında 20 ila 45 dakika inkübe edin.Tam büyüme ortamının 800 mikrolitresine 100.000 MDCK veya A549 hücresini bölün ve ekleyin. 200 mikrolitre siRNA transfeksiyon reaktif kompleksi ekleyin ve bu süspansiyonu 12 delikli bir kültür plakasına ekleyin. Hücreleri 72 saat boyunca% 5'lik bir karbondioksit atmosferi altında 37 santigrat derecede inkübe edin.Hücreleri influenza A virüsü ile enfekte edin, ancak inhibitörler olmadan. Batı lekelemesi yapın ve daha önce gösterildiği gibi protein seviyelerini karşılaştırın. Polipeptit üzerindeki XXXD ve DXXD kaspaz bölünme motiflerini bulun.P1 aspartik asidi, iki glutamik asidi veya alanini bölgeye yönelik mutagenez ile mutasyona uğratın ve DNA dizilimi ile onaylayın. Uygun bir ortamın 100 mikrolitresinde, iki mikrogram vahşi tip veya mutant plazma DNA'sını veya transfeksiyon reaktifinin önerilen hacmini seyreltin ve tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. 100 mikrolitre plazma DNA çözeltisini 100 mikrolitre transfeksiyon reaktif çözeltisi ile karıştırın ve oda sıcaklığında 20 ila 45 dakika inkübe edin.Bu arada, 800 mikrolitre tam büyüme ortamına 300.000 MDCK veya A549 hücresini bölün ve ekleyin. 200 mikrolitre DNA transfeksiyon reaktif kompleksi ekleyin ve bu süspansiyonu 12 delikli bir kültür plakasına ekleyin. Plakayı% 5'lik bir karbondioksit atmosferi altında 37 santigrat derecede inkübe edin.48 saat sonra, hücreleri inhibitörler olmadan influenza A virüsü ile enfekte edin. Batı lekelemesi yapın ve daha önce gösterildiği gibi protein seviyelerini karşılaştırın. Western blotting kullanılarak, konakçı kortaktinin influenzaya bağlı konakçı kaspazları ile bozulması değerlendirildi.İnfluenza virüsü ile enfekte olmuş hücrelerin bir kaspaz-3 inhibitörü ile tedavisi, kortaktin ve viral NP yıkımının kurtarılmasıyla sonuçlandı. Kortaktin bantlarının yoğunluğunun ölçülmesi ve karşılık gelen aktin bandı ile normalizasyonu, kaspaz-3 inhibitörü ile tedavi edilen enfekte hücrelerdeki kortaktin seviyesinin, tedavi edilmemiş enfekte hücrelere kıyasla daha yüksek olduğunu göstermiştir. Kaspaz-6 veya kaspaz-7 tükenmiş hücrelerde.Kortaktin polipeptit düzeylerinde anlamlı bir iyileşme gözlenmezken, kaspaz-3 tükenmiş hücrelerde kortaktin, influenza virüsünün neden olduğu yıkımdan kurtuldu. Polipeptit düzeylerinin nicelleştirilmesi ve karşılaştırılması, tükenmiş kaspaz-3 ekspresyonuna sahip enfekte hücrelerde kortaktin polipeptit düzeyinin normal kaspaz-3 ekspresyonuna sahip hücrelerden daha yüksek olduğunu göstermiştir. Aspartik asidin 116 pozisyonunda glutamik aside mutasyonu, kortaktin polipeptitini influenza virüsünün neden olduğu bozunmaya dirençli hale getirmiştir.Polipeptit düzeylerinin nicelleştirilmesi ve karşılaştırılması, enfekte hücrelerde mutant kortaktin polipeptit düzeyinin vahşi tip kortaktin polipeptitinden daha yüksek olduğunu göstermiştir. Polipeptitteki kaspaz bölünme bölgesini tanımlamak için onlarca mutant üretmek ve tekrarlanan Batı lekelenmesi yapmak gerekir. Saflaştırılmış kaspaz ve hedef polipeptit içeren bir in vitro biyokimyasal tahlil, ilgilenilen proteinin doğrudan gaz bazlı bir substrat olduğunu doğrulamak için geliştirilebilir.Bu protokol, virüs enfeksiyonu veya bir hastalık gibi çalışılan sistemdeki hedef proteinin önemini, bozulmasını veya bölünmesini anlamaya yardımcı olacaktır.

identifying-caspases-their-motifs-that-cleave-proteins-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Grip virüsleri konak hücre kromatin ile birlikte kendi RNA genomu çoğaltmak. Burada, enfekte olmuş hücrelerin kromatin gelen sağlam virüs ribonükleoprotein kompleksleri arındırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Viral kompleksleri Arıtılmış sırasıyla, Western blot ve protein ve RNA içerikleri astar uzantısı hem de analiz edilebilir.

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Bu video, influenza virüsü ile stimülasyon yoluyla kemik iliği kaynaklı makrofajlarda çoklu kaspaz aktivasyonlarının değerlendirmesini göstermektedir. Makrofaj lizizi, lizatın ısıyla inaktivasyonu ve santrifüjlemeyi takiben, sonraki immünolojik analizler için hücre içi kaspazlar toplanır.

Makrofajlarda Multipl Kaspazların Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Video, virüsle enfekte olmuş hücrelerde kaspaz aracılı protein bölünmesini değerlendirmek için bir yöntem göstermektedir. Viral enfeksiyon sonrası, kaspazlar aktive olur ve çeşitli konakçı hücresel proteinleri ve viral nükleoproteinleri bozarken, spesifik kaspaz inhibitörleri, western blotlama ile onaylandığı gibi bu bozulmayı önler.

Virüsle enfekte hücrelerde viral ve konakçı proteinlerin kaspaz aracılı bölünmesinin değerlendirilmesi

Virüsün konak hücrelere girişi sırasında influenza A virüs çekirdeklerinin sökülmesi çok adımlı bir işlemdir. Viral kaplamanın erken aşamalarını analiz etmek için bir in vitro yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşımda, tanımlanmış koşullar altında kaplamayı başlatan adımları biyokimyasal olarak incelemek için hız gradyan santrifüjlemesi kullanılır.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Bu iletişim kuralı açıklar caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC); Başlatan caspases, indüklenen yakınlığı hangi onların harekete geçirmek için ilk adımdır görselleştirmek için kullanılan bir görüntüleme tabanlı yöntemi.

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

Biz peptidler viral füzyon peptidler bölünme sitenin temsil eden proteaz proteolitik aktivite hızlı bir tarama sağlayan bir fluorogenic peptid bölünme tahlil mevcut. Bu yöntem aynı zamanda bir protein sıra içinde diğer amino asit motif üzerinde proteaz aktivitesi için test etmek için kullanılabilir.

Bir Fluorogenic peptid bölünme tahlil için proteolitik aktivite ekran: coronavirus uygulamalarda spike protein etkinleştirme

Viral poliproteine gömülü homolog konak-patojen protein dizilerinin (SSHHPS) kısa uzantılarını belirlemek için genel bir protokol sayılmiyoruz. SSHHPS viral proteazlar tarafından tanınan ve çeşitli Grup IV virüsler tarafından belirli konak proteinlerin hedefli imha doğrudan.

Grup IV Viral SSHHPS In Vitro ve In Silico Yöntemleri Kullanılarak Analizi

Bu protokol, insan kan örneklerinden monosit türevi makrofajlar (MDM) elde etmek için iş akışını, enflamatuar kaspaz Bimoleküler Floresan Kompleman (BiFC) muhabirlerini hücre canlılığı ve davranışından ödün vermeden insan MDM'sine verimli bir şekilde tanıtmak için basit bir yöntemi ve canlı hücrelerde enflamatuar kaspaz aktivasyonunu ölçmek için görüntüleme tabanlı bir yaklaşımı açıklamaktadır.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

Bu protokol, piroptoz, apoptoz, nekroptoz ve PANoptoz gibi hücre ölüm yollarının başlatılmasını belirlemek için hem in vitro hem de in vivo (in fareler) enfeksiyon, steril hakaretler ve kanser modellerine yanıt olarak kaspaz aktivasyonunu (kaspaz-1, kaspaz-3, kaspaz-7, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-11) değerlendirmek için kapsamlı bir yöntemi açıklamaktadır.

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Burada rekombinant Drosophila kaspazlarını Dronc ve Drice'i ve bunların in vitro bölünme tahlillerini eksprese etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.

İn Vitro Substrat Taraması için Saflaştırılmış Rekombinant Drosophila Caspases Kullanarak Bölünme Testleri

Mevcut protokol, akış sitometrisi veya spektroflorometre kullanarak florojenik bir substrat yoluyla kaspaz aktivitesini ölçmek için iki yöntem tanımlamaktadır.

Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Keşfedin, İnfluenza A virüsü enfeksiyonunda kaspazların parçaladığı proteinleri ve motifleri belirlemek için moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak. Bu yöntem, viral patogenez ve antiviral stratejiler için kritik bilgiler sağlar.

İnfluenza A Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Proteinleri Parçalayan Kaspasların ve Motiflerinin Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet