Name: Bozulmamış Zebra Balığı Embriyolarında Normal ve Anormal Sitozin Metilasyonunun Hızlı ve Verimli Mekansal Zamansal İzlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Keşfedin, sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli mekansal zamansal izlenmesi için Danio rerio embriyolarında epigenetik değişiklikleri tespit eden maliyet etkin bir yöntem. Bu protokol, çevresel uyaranlara karşı 5-Metilsitozin düzeylerini analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırma desteği, SAB'a UCR Lisansüstü Bölüm Bursu, SAB'a NRSA T32 Eğitim Programı Bursu (T32ES018827) ve DCV'ye Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi (R01ES027576) ve USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü Hatch Projesi (1009609) tarafından sağlanmıştır.

Yetişkin yetiştiriciler, Riverside'daki Kaliforniya Üniversitesi'nde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) onaylı bir hayvan kullanım protokolüne (#20180063) uygun olarak ele alındı ve tedavi edildi.
1. Zebra balığı embriyo toplama ve kimyasal maruziyet
<ol><li>Cinsel olarak olgun ve üreme açısından uygun yetişkin erkek ve dişi zebra balığı içeren tanklara tank içi üreme tuzakları ekleyin. 6 L tank başına en az 12 saat önce, tanklar içinde yumurtaların yaklaşık döllenme ve yumurtlama zamanı olan ~ 9: 00'da toplamadan en az 12 saat önce en az üç tuzak ekleyin.</li>
	<li>Toplama sabahı taze bir maruz kalma çözeltisi hazırlayın. Maruz kalma çözeltisi, 5 mL'lik bir pipet kullanılarak ve 60 mm'lik cam Petri kabına 5,0 mL partikülsüz sistem suyu eklenerek hazırlanır.</li>
	<li>Ardından, cam tabaktaki sistem suyuna 10 μL araç (dimetil sülfoksit veya DMSO) veya kimyasal stok çözeltisi aktarmak için 10 μL'lik bir cam mikrokapiler pipet kullanın.</li>
	<li>Stok çözeltisinin dağılmasını sağlamak için cam Petri kabını döndürün. Cam Petri kabına 5,0 mL daha sistem suyu ekleyin. Pozlama çözeltisini homojenize etmek için cam Petri kabını döndürün.</li>
	<li>Tedavi başına dört replikasyon elde etmek için her tedavi grubu için dördlü replikalarda tekrarlayın.</li>
	<li>Maruz kalma çözeltileri hazırlandıktan sonra, buharlaşmayı en aza indirmek için cam tabakları cam kapaklarla kapatın.</li>
	<li>Üreme tuzaklarını her tanktan çıkarırken, tanklardan çıkarmadan önce her tuzak içindeki suyun tanka boşalmasına dikkatlice izin verin. Tuzakların sağ tarafta kaldığından emin olun.</li>
	<li>Üreme tuzaklarını laboratuvar lavabosuna aktarın ve ters ozmoz (RO) suyuyla doldurulmuş bir fışkırtma şişesi kullanarak, daha önce% 10 ağartıcıya batırılmış ve suyla durulanmış bir balık ağına durulayın. Tüm döküntüler temizlenene ve sadece temiz embriyolar kalana kadar embriyoları durulayın.</li>
	<li>RO su dolu bir fışkırtma şişesi kullanarak embriyoları balık ağından 100 mm'lik plastik bir Petri kabına aktarın. Döllenme sonrası 0.75 saatte (hpf) 50 canlı embriyoyu rastgele sıralayın ve fazla RO suyunu çıkarın.</li>
	<li>Bir mikrospatula kullanarak, sıralanmış embriyoları tedavi çözeltisine yerleştirin. Tüm embriyolar sabah 9:45'ten önce araç veya tedavi solüsyonu içinde olmalıdır. Embriyoların tedavi çözeltisi içinde eşit şekilde kaplandığından emin olmak için cam tabakları döndürün.</li>
	<li>Her bir tedavi grubu için dört replika tabak (N = replika başına 50) ayarlandıktan sonra, cam kapağı maruz kalma kaplarının üzerine yerleştirin ve tüm bulaşıkları 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf veya 10 hpf olana kadar 28 ° C'de ayarlanmış sıcaklık kontrollü bir inkübatöre aktarın.</li>
	<li>Maruziyetin sonlandırılmasından en az 4 saat önce taze% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın.<ol><li>Ocakları 115 ° C'ye kadar açın, 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 20 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) (2 mL 10x PBS + 18 mL RO suyu) yapın ve 800 mg paraformaldehit ağırlığını boşaltın.</li>
		<li>Kimyasal bir duman davlumbazının içinde, 1x PBS çözeltisini 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine aktarın, 800 mg paraformaldehit ekleyin ve ardından 2 μL 10 N NaOH ekleyin. Şişenin içine bir termometre yerleştirin, şişeyi sıcak plakaya yerleştirin ve karıştırırken sıcaklığı izleyin.</li>
		<li>Sıcaklık 62-65 ° C'ye ulaştığında% 4 PFA'yı sıcak plakadan çıkarın ve oda sıcaklığına (RT) soğumasını bekleyin. %4 PFA'yı 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Maruziyet süresi sona erdiğinde, embriyoları inkübatörden çıkarın ve tüm canlı embriyoları 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 1 mL pipet kullanarak artık maruz kalma solüsyonunu aspire edin. Herhangi bir embriyoyu aspire etmeyin.</li>
	<li>1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 500 μL soğutulmuş% 4 PFA ekleyin ve embriyoları birkaç kez ters çevirerek% 4 PFA'da karıştırın. Embriyoların bir gecede% 4 PFA'da sabitlenmesine izin verin. NOT: Embriyoların PFA'da 12 saatten daha uzun süre kalmasına izin verilmesi önerilmez.</li>
</ol>2. Embriyoların dekoryonasyonu
<ol><li>Ertesi gün,% 4 PFA'yı aspire edin, embriyoları 1x PBS'de yeniden askıya alın ve 30 saniye boyunca hafifçe yukarı ve aşağı pipet yapın. Gerekirse, protokolü bu adımda durdurun ve embriyoları 4 ° C'de 48 saate kadar 1x PBS'de saklayın.</li>
	<li>Plastik bir transfer pipeti kullanarak, sabit embriyoları RO su dolu bir cam kaba dikkatlice aktarın ve 30 saniye boyunca yavaşça döndürün. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Tüm embriyoları manuel olarak dekoriyonize etmek için standart bir stereomikroskop kullanarak 5.0x büyütme altında şırınga iğneleri kullanın. Koryonu delmek için iğne ucunu kullanarak bunu yapın ve yumurta sarısı ve hücre kütlesinden yavaşça soyun4.</li>
	<li>Embriyolar dekoriyonize edildikten sonra, 25 adede kadar bozulmamış embriyoyu bir immünokimya (IHC) sepetine aktarmak için bir cam mikrokapiler pipet kullanın ve IHC sepetini 96 delikli bir plakaya yerleştirin. RO suyunu her kuyudan aspire etmek için 1 mL'lik bir pipet kullanın.</li>
</ol>3. 5-mC-spesifik antikor kullanan immünohistokimya
<ol><li>Embriyoları kuyucuk başına 500 μL bloke edici tamponda (1x PBST +% 2 koyun serumu + 2 mg / mL sığır serum albümini) yeniden askıya alın ve plakayı ışıktan korumak için parafilm ve alüminyum folyo ile sarın. Yörüngesel çalkalayıcıda (100 rpm) 4 saat boyunca 4 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Parafilm sargısını ve alüminyumu çıkarın ve bloke edici tamponu her bir kuyucuktan aspire etmek için 1 mL'lik bir pipet kullanın. Bloke edici tampondaki monoklonal fare anti-5-mC antikorunun 1:100 seyreltilmesinin 500 μL'si ile değiştirin. Arka plan gürültüsünü hesaba katmak için bloke edici tamponla inkübe edilecek araç kontrol embriyolarının bir alt kümesi hariç tüm embriyoları birincil antikorlarla inkübe edin. Bu adımda embriyoların bütünlüğünü bozmamaya veya embriyoları aspire etmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Plakayı parafilm ve alüminyum folyoya yeniden sarın ve plakanın bir orbital çalkalayıcı (100 rpm) üzerinde gece boyunca 4 ° C'de inkübe olmasına izin verin.</li>
	<li>Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini her bir kuyucuktan çıkarın ve 1x PBS +% 0.1 Ara-20 (1x PBST) ile değiştirin. Her bir kuyuyu, yörüngesel bir çalkalayıcıda (100 rpm) yıkama başına 15 dakika boyunca 1x PBST ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Tamponu bloke etmek için 1x PBST'yi keçi anti-fare IgG antikorunun 1:500 seyreltilmesiyle değiştirin ve tüm embriyoları ikincil antikor ile inkübe edin. Plakanın bir orbital çalkalayıcıda (100 rpm) gece boyunca 4 ° C'de inkübe edilmesine izin verin.</li>
	<li>Ertesi gün, ikincil antikoru çıkarın ve artık çözeltiyi orbital çalkalayıcıda (100 rpm) yıkama başına 15 dakika boyunca 1x PBST ile üç kez yıkayın. NOT: IHC sepetleri 1x PBS ile doldurulmuş temiz kuyucuklarda saklanırsa, protokol burada 48 saate kadar durdurulabilir.</li>
	<li>Her bir kuyucuktan 1x PBST'yi aspire etmek için 1 mL'lik bir pipet kullanın ve IHC sepetini RO suyuyla dolu bir cam Petri kabına yerleştirin. Standart bir stereomikroskop altında, bozulmamış embriyoları rastgele 96 kuyucuklu bir plakaya ayırın ve kuyu başına bir embriyo elde edin.</li>
	<li>1 mL'lik bir pipet kullanarak, tüm RO suyunu ayrı ayrı kuyulardan çıkarın ve 200 μL 1x PBS ile değiştirin. Plakayı 1 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
</ol>4. 96 kuyucuklu plakalar içindeki embriyoların otomatik görüntülenmesi
<ol><li>Yüksek içerikli bir tarama sistemi (Malzeme Tablosu) kullanarak embriyoları iletilen ışık ve FITC altında 2x objektifle görüntüleyin. NOT: Her embriyonun floresan görüntüsü, yukarıda belirtilen büyütme ve bir FITC filtresi19 kullanılarak otomatik olarak yakalanmıştır.<ol><li>Fotoğraf makinesinin netlemesinin plakanın altında olduğundan ve alt kalınlıkla dengelendiğinden emin olmak için Otomatik Netleme'yi seçin.</li>
		<li>Pozlama süresi 100 ms olan bir FITC dalga boyu seçin ve Otomatik Netlemeyi Z-ofsetli lazere ayarlayın. Plaka alımına başlamadan önce birkaç kuyuda uygun görüntü alımını gözlemleyin ve onaylayın. NOT: Cihaz, embriyo içeren tüm seçilmiş kuyulardan görüntüleri otomatik olarak alır. 96 kuyulu bir plaka, görüntü toplama ve veri depolama için yaklaşık 30 dakika gerektiriyordu. Edinme süresi boyunca, görüntüleme sistemindeki iç sıcaklık RT'de tutuldu.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntü alımını takiben, yüksek içerikli tarama sistemini ve özel bir otomatik görüntü analizi prosedürünü kullanarak veri analizi gerçekleştirin. Toplam alan ve entegre floresan yoğunluğu için analiz edilecek 96 delikli plakadaki her embriyoyu seçin. NOT: Analiz, analizden veri noktalarının bindirmelerini içeren görüntüler sağlamayı içeriyordu.</li>
	<li>Ardından, veri noktalarını tablolaştırın ve Ölçüm'ün altına gidip Veri Günlüğünü Aç'ı seçerek bunları bir elektronik tabloya aktararak bunları yüksek içerikli tarama sisteminden dışa aktarın. Plaka toplama ve veri analizi bölümleri Şekil 1'de gösterilmiştir.</li>
</ol>5. Veri analizi
<ol><li>Dışa aktarılan elektronik tabloyu, dağıtıcı (dplyr) paketinin her bir kuyu için verileri sıralamak, toplamak ve kuyu numarasına göre filtrelemek için kullanıldığı bir bilgisayar programına yükleyin. Writexl paketi daha sonra toplanan verileri bir e-tabloya dışa aktarmak için kullanılır. 5mC program kodu Ek Dosya 1'de gösterilmiştir.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li>
<li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078(2022).</li>
<li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179(2021).</li>
<li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699(2019).</li>
<li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li>
<li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands%2C+cytosine+methylation%2C+and+the+metabolome+in+driving+tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li>
<li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li>
<li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li>
<li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li>
<li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation-mediated+epigenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li>
<li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li>
<li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li>
<li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li>
<li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li>
<li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li>
<li>Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li>
<li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek bilinen hiçbir rakip finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan etmektedir.

Bu protokol sırasında, kritik olan birkaç adım vardır. İlk olarak, embriyoları dekoryonize ederken, gelişmekte olan embriyonun bu kısımları çok kırılgan ve delinmesi kolay olduğundan, iğneyi embriyo / yumurta sarısı kesesi / hücre kütlesinin dokusundan uzağa yönlendirmek önemlidir. İkincisi, etiketli embriyoları bireysel kuyucuklara aktarırken, plastik bir pipete yapışacakları için embriyoları transfer etmek için bir cam pipet kullanın. Üçüncüsü, tam montajlı IHC yaparken, plakanın ışıktan korunduğundan emin olun. Son ol...

Enzimatik modifikasyonlar, sitozinin aktif metilasyonunu ve demetilasyonunu 5-metilsitozin (5-mC) içine ve ardından 5-mC'nin 5-hidroksimetilsitozin, 5-formilsitozin ve 5-karboksilsitozin 1,2'ye oksidasyonunu yönlendirir. Tris (1,3-dikloro-2-propil) fosfat (TDCIPP), Amerika Birleşik Devletleri'nde yaygın olarak kullanılan ve daha önce döllenme sonrası 0.75 saat sonra (hpf) erken gastrulasyona (6 hpf) kadar erken embriyonik maruziyeti takiben sitozin metilasyonunun yörüngesini değiştirdiği daha önce kanıtlanmış bir alev geciktiricidir 3,4,5,6,7,8 . Omurgalılarda, 5-mC ve modifiye edilmiş türevleri, erken embriyonik gelişimi düzenlemek için kritik öneme sahiptir9. Bir embriyonun döllenmesi, ebeveyn DNA'sının demetilasyonunu tetikler, bunu maternal mRNA bozunması, zigotik genom aktivasyonu ve zigotik genomun remetilasyonuizler 9. Sitozin metilasyonunu kullanan biyolojik olarak ilgili süreçler arasında histon modifikasyonu, transkripsiyonel makinelerin işe alınması, RNA metilasyonu, epigenetik yeniden programlama ve kromatin yapısının belirlenmesi10,11 sayılabilir. Sitozin metilasyonu, omurgalı türleri arasında da korunmaktadır ve anormal sitozin metilasyonunun bir organizmanın gelişiminin yörüngesini nasıl etkileyebileceğini anlamanın ve araştırmanın önemini vurgulamaktadır11. Ayrıca, in utero gelişim maternal maruziyete duyarlıdır ve acil fenotipik sonuçlar, yetişkin hastalık duyarlılığı üzerinde uzun vadeli etkiler ve kalıtsal epigenetik işaretlerin nesiller arası etkileri gibi olumsuz sonuçlara neden olma potansiyeline sahiptir12,13,14.
Sitozin-guanin çiftlerinin veya CpG adalarının uzun uzantıları, genom15,16,17 boyunca sitozin metilasyonunun dinamiklerini karakterize etmeyi amaçlayan araştırmacıların birincil odakları olmuştur. Tüm genom bisülfit dizilimi, azaltılmış temsili bisülfit dizilimi ve bisülfit amplikon dizilimi gibi bisülfit bazlı stratejiler, baz çifti çözünürlüğünde sitozin metilasyonunu sorgulamak için altın standardı temsil eder. Bununla birlikte, dizilemeye dayalı yaklaşımlar maliyet engelleyicidir ve bu nedenle, gelişimsel aşamalarda sitozin metilasyonunu, kimyasal başına çoklu konsantrasyonları izleme ve tedavi başına embriyoları çoğaltma yeteneğini engeller. Ek olarak, dizileme tabanlı yaklaşımlar, gelişmekte olan bir embriyo içindeki potansiyel olarak etkilenen hücre tiplerini ve alanlarını anlamak için kritik olan mekansal lokalizasyon hakkında bilgi sağlamaz. Benzer şekilde, metilasyona bağımlı kısıtlama analizi, 5-mC enzime bağlı immünotahliller (ELISA'lar) ve 5-metil-2'-deoksisitidin (5-mC) sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) gibi küresel DNA metilasyon testleri, hücre veya doku homojenatlarına dayanır ve bu nedenle, bozulmamış örnekler12,18 içinde sitozin metilasyonunun uzay ve zaman üzerindeki lokalizasyonunu ve büyüklüğünü izleme yeteneğini engeller.
Otomatik in vivo görüntüleme, genetik manipülasyonlar, hızlı ex utero gelişim süresi ve embriyogenez sırasında hayvancılığın kolaylığı nedeniyle, zebra balığı embriyoları, erken embriyonik gelişim sırasında olumsuz sonuçlara katkıda bulunan ksenobiyotik aracılı yolları ortaya çıkarmak için fizyolojik olarak bozulmamış modeller olarak yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir. Bu nedenle, 5-mC'ye özgü ticari olarak temin edilebilen antikorları kullanarak, aşağıdaki protokol, istatistiksel analizden önce programlama dilini kullanarak bütün-monte immünohistokimyadan (IHC), otomatik yüksek içerikli görüntülemeden ve verimli veri işlemeden yararlanarak bireysel, bozulmamış zebra balığı embriyolarında sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli bir şekilde mekansal zamansal izlenmesi için uygun maliyetli bir stratejiyi açıklamaktadır.
Mevcut bilgilere göre, bu yöntem bozulmamış zebra balığı embriyolarında 5-mC'yi izleyen ilk yöntemdir. Yöntem, hücre kütlesi içindeki DNA metilasyonunun tespit edilmesini sağlar ve ayrıca maternal-zigotik geçiş sırasında yumurta sarısı lokalize maternal mRNA'ların sitozin metilasyonunu tespit etme yeteneğine sahiptir. Genel olarak, bu yöntem, epigenetik yeniden programlama sırasında sitozin metilasyonunu in situ olarak bozma potansiyeline sahip kimyasalların hızlı bir şekilde tanımlanması için yararlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>540225</td><td></td></tr><tr><td>10-&mikro; L cam mikrokılcal pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>211762B</td><td></td></tr><tr><td>100 mm plastik Petri kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>08757100D</td><td></td></tr><tr><td>10x fosfat tamponlu tuzlu su&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>1 mL pipet&</td><td>Fisher Scientific</td><td>13690032</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB501250</td><td></td></tr><tr><td>5 mL pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13690033</td><td></td></tr><tr><td>60 mm kapaklı cam petri kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>08747A</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>720089</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 konjuge keçi anti-fare IgG antikor&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP67110</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2311</td><td></td></tr><tr><td>Ocak Gözü ve nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1110016SH</td><td></td></tr><tr><td>Tank içi üreme tuzakları</td><td>Sucul Habitatlar</td><td>N/A</td><td>Bu ürün, Aquatic Habitats'ın Pentair tarafından satın alınmasının ardından artık mevcut değildir. Araştırmacılar, birden fazla satıcıdan temin edilebilen standart sistem dışı yetiştirme tanklarını kullanabilirler.</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS Geniş Alan Yüksek İçerikli Tarama Sistemi</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>N/A</td><td>İletilen ışık ve FITC filtresi ile donatılmış herhangi bir yüksek içerikli tarama sistemi uygun olacaktır.</td></tr><tr><td>İmmünokimya (IHC) sepeti</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Konik kısmı çıkarılmış ve alt kısmı ağ ile donatılmış, 24 veya 48 oyuklu plakalar için boyutlandırılmış mikrosantrifüj tüpleri kullanılarak şirket içinde üretilmiştir.</td></tr><tr><td>MetaXpress 6.0.3.1658&nbsp;</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>N/A</td><td>Toplam alanı ve entegre floresan yoğunluğunu ölçebilen herhangi bir yazılım uygun olacaktır.</td></tr><tr><td>Microspatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>2140115</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal fare anti-5-mC antikoru</td><td>Millipore Sigma</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50998290</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1337412</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>18612139</td><td></td></tr><tr><td>Plastik transfer pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>1368050</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio</td><td>N/A</td><td>RStudio açık kaynaklı bir yazılımdır ve https://www.rstudio.com adresinden indirilebilir.</td></tr><tr><td>Koyun serumu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3772-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>10450103</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü inkübatör&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR505755L</td><td></td></tr><tr><td>Ara-20&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

bozulmamış zebra balığı embriyolarında normal ve anormal sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli mekansal zamansal İzlenmesi

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Sitozin metilasyonu, omurgalı türleri arasında oldukça korunmuştur ve epigenetik programlama ve kromatin durumunun önemli bir itici gücü olarak, erken embriyonik gelişimde kritik bir rol oynar. Enzimatik modifikasyonlar, aktif metilasyonunu ve sitozinin 5-metilsitozine (5-mC) demetilasyonunu ve ardından 5-mC'nin 5-hidroksimetilsitozin, 5-formilsitozin ve 5-karboksilyosin içine oksidasyonunu yönlendirir. Epigenetik yeniden programlama, in utero gelişim sırasında kritik bir dönemdir ve annenin kimyasallara maruz kalması, yavrulardaki epigenomu yeniden programlama potansiyeline sahiptir. Bu potansiyel olarak acil fenotipik sonuçlar, yetişkin hastalık duyarlılığı üzerinde uzun vadeli etkiler ve kalıtsal epigenetik işaretlerin nesiller arası etkileri gibi olumsuz sonuçlara neden olabilir. Bisülfit bazlı dizileme, araştırmacıların baz çifti çözünürlüğünde sitozin metilasyonunu sorgulamasına izin vermesine rağmen, dizileme tabanlı yaklaşımlar maliyet engelleyicidir ve bu nedenle, gelişimsel aşamalar boyunca sitozin metilasyonunu izleme yeteneğini, kimyasal başına çoklu konsantrasyonları ve tedavi başına embriyoları çoğaltma yeteneğini engeller. Otomatik in vivo görüntüleme, genetik manipülasyonlar, hızlı ex utero gelişim süresi ve embriyogenez sırasında yetiştiriciliğin kolaylığı nedeniyle, zebra balığı embriyoları, erken embriyonik gelişim sırasında olumsuz sonuçlara katkıda bulunan ksenobiyotik aracılı yolakları ortaya çıkarmak için fizyolojik olarak bozulmamış bir model olarak kullanılmaya devam etmektedir. Bu nedenle, ticari olarak temin edilebilen 5-mC'ye özgü antikorları kullanarak, istatistiksel analizden önce programlama dilini kullanarak bütüne monte immünohistokimya, otomatik yüksek içerikli görüntüleme ve verimli veri işlemeden yararlanarak bireysel, bozulmamış zebra balığı embriyolarında sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli mekansal zamansal izlenmesi için uygun maliyetli bir strateji açıklıyoruz. Mevcut bilgilere göre, bu yöntem, erken gelişim sırasında zebra balığı embriyolarında 5-mC seviyelerini yerinde olarak başarılı bir şekilde tespit eden ve ölçen ilk yöntemdir. Yöntem, hücre kütlesi içindeki DNA metilasyonunun tespit edilmesini sağlar ve ayrıca maternal-zigotik geçiş sırasında yumurta sarısı lokalize maternal mRNA'ların sitozin metilasyonunu tespit etme yeteneğine sahiptir. Genel olarak, bu yöntem, epigenetik yeniden programlama sırasında sitozin metilasyonunu in situ olarak bozma potansiyeline sahip kimyasalların hızlı bir şekilde tanımlanması için yararlı olacaktır.

Bu protokolün genel amacı, sabit ve etiketli zebra balığı embriyolarındaki floresanın toplam alanını ve göreceli yoğunluğunu değerlendirerek bir tedavinin 5-mC'nin göreceli bolluğunu etkileyip etkilemediğini belirlemektir. Protokolü tamamladıktan sonra, ilk önce tüm montajlı IHC'nin başarılı olup olmadığını belirlemek için bir floresan stereomikroskop kullanılabilir. Etiketlenmiş embriyolar bir FITC veya GFP filtresi altında gözlendiğinde, pozitif bir sonuç embriyo içinde pozitif bir FITC sinyali ile gösterilirken, negat...

Bu yazıda, bozulmamış zebra balığı embriyolarında normal ve anormal sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli spatiotemporal izlenmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Bozulmamış Zebra Balığı Embriyolarında Normal ve Anormal Sitozin Metilasyonunun Hızlı ve Verimli Mekansal Zamansal İzlenmesi

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Bu protokol, nispeten hızlı ve uygun maliyetli bir yöntemin yanı sıra otomatik bir edinme ve analiz sunar, böylece yaygın bir epigenetik biyobelirteç olan 5-Metilsitozinin düşük hassasiyetli taramasını üretir. Bu tekniğin temel avantajı, kullanıcıların modellerine ve gelişim aşamalarına göre optimize edebilecekleri deneysel bir tasarım sunma esnekliğidir. Bu teknik, kimyasal maruziyetin, gelişmekte olan bir organizma içindeki 5-Metilsitozin'in göreceli bolluğunu nasıl değiştirdiğini tespit etmek için kullanılabilir; bu, normalde sadece dizileme gibi pahalı yüksek trpA yöntemleri ile yapılabilir.Bu yöntem, çevresel uyaranlara yanıt olarak 5-Metilsitozinin epigenetik değişikliklerini anlamak için NCG yöntemlerini kullanmayı amaçlayan herhangi bir araştırma için yararlıdır. Toplama sabahı taze bir maruz kalma çözeltisi hazırlayarak başlayın. 60 milimetrelik cam Petri kabına beş mililitre partikülsüz sistem suyu ekleyin.Daha sonra 10 mikrolitre dimetil sülfoksit veya kimyasal stok çözeltisini sistem suyuna aktarmak için 10 mikrolitrelik mikro kılcal cam pipet kullanın. Stok çözeltisinin dağılmasını sağlamak için cam Petri kabını döndürün. Cam Petri kabına beş mililitre daha sistem suyu

rapid-efficient-spatiotemporal-monitoring-normal-aberrant-cytosine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Somitogenesis ritmik bir gelişimsel süreç olduğu mekansal desenler, embriyonun vücut ekseni. Daha önce, biz bu süreci götürmek döngüsel genleri gözlemlemek için floresan gazetecilere kullanmak transgenik zebra balığı hatları geliştirdik. Burada, kültür in vitro zamanla bu satırları ve görüntü onların salınımların hücreleri dağınık.

Tek Hücrelerde Zebra balığı Segmentasyon Clock Görüntüleme Dağınık Presomitic Mesoderm Hücre Kültürleri Üretimi

Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit...

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

Hücre ve dokularda protein seviyeleri, çoğu zaman sıkı bir şekilde protein üretimi ve temizlenmesi dengesi ile düzenlenir. Fotoçevrim (FDAP) sonra floresans Bozunma kullanan proteinlerin temizlenme kinetiği deneysel in vivo olarak ölçülebilir.

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Mitoz her canlı organizma için kritiktir ve kusurlar genellikle kansere ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Araştırmacılar, bu görüntüleme protokolünü ve zebra balığını bir model sistem olarak kullanarak, canlı bir omurgalı organizmasında mitozu ve mitotik süreçler kusurlu olduğunda ortaya çıkan çok sayıda kusuru görselleştirebilirler.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Burada açıklanan protokoller, zebra balığı embriyolarını in vivo bir sistemde kullanarak, ilgilenilen hücre tipinde seçici olarak ifade edilen bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi (GEVI) ile birlikte uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerinin incelenmesine izin verir.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Zebra balığı son kullanılan bir vivo içinde modeli sistemi olarak DNA çoğaltma zamanlaması geliştirme sırasında çalışmaya. İşte Zebra balığı embriyo profili çoğaltma zamanlaması için kullanarak iletişim kurallarını ayrıntılı. Bu iletişim kuralı kolayca çoğaltma zamanlaması mutantlar, tek hücre türleri, hastalık modelleri ve diğer türler çalışmaya adapte edilebilir.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

Gelişmekte olan zebra balığı optik tektumunda mikroglia hücrelerinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için hızlı taramalı konfokal mikroskopiden yararlanan ve bu hücrelerin dinamiklerinin in vivo analizine olanak tanıyan bir yöntem gösteriyoruz.

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Erken zebra balığı embriyolarının bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak bozulmamış bir koryon içinde görüntülenmesi için bir örnek hazırlama stratejisi açıklanmaktadır. Embriyoların %70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında koryon içinde edindiği farklı yönelimleri analiz eder ve ışık tabakası sistemini kullanarak embriyo boyunca hücresel ölçekte çözünürlük elde etmek için görüntüleme stratejilerini detaylandırır.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

RASopatiler, RAS-MAPK yolağı hiperaktivasyonunun neden olduğu multisistemik genetik sendromlardır. Doğrulanmayı bekleyen potansiyel olarak patojenik varyantlar sürekli olarak ortaya çıkarken, zayıf klinik öncesi kanıtlar tedaviyi sınırlar. Burada, genç muhabir zebra balığında canlı FRET görüntüleme ile RASopati ile ilişkili ERK aktivasyon seviyelerini ve embriyogenez sırasındaki farmakolojik modülasyonunu test etmek ve çapraz doğrulamak için in vivo protokolümüzü açıklıyoruz.

Canlı FRET mikroskobu ve immünofloresan ile erken zebra balığı Noonan sendromu modellerinde ERK aktivite modülasyonunu değerlendirmek için etkili bir protokol

Bu çalışma, bireysel zebrafish embriyonik kalplerinde küresel DNA metilasyonunu nicelikten ölçemek için hassas bir immünoflüoresans tabanlı görüntüleme yöntemi oluşturmaktadır. Bu yaklaşım, sınırlı doku materyali zorluğunu aşar ve bisülfit dönüşümü ihtiyacını atlar.

Zebrafish Larvalarının Kalplerinde Küresel DNA Metilasyonu Tespiti

Keşfedin, sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli mekansal zamansal izlenmesi için Danio rerio embriyolarında epigenetik değişiklikleri tespit eden maliyet etkin bir yöntem. Bu protokol, çevresel uyaranlara karşı 5-Metilsitozin düzeylerini analiz eder.

Bozulmamış Zebra Balığı Embriyolarında Normal ve Anormal Sitozin Metilasyonunun Hızlı ve Verimli Mekansal Zamansal İzlenmesi

Daha fazla video keşfet