CRISPR / Cas9 Oryantal Meyve Sineği Bactrocera dorsalis'in mutagenezi için protokoller

Oryantal meyve sineği oldukça istilacı ve uyarlanabilir bir haşere türüdür. Fonksiyonel gen araştırması için etkili yöntemler, çevre dostu haşere yönetimi stratejileri geliştirmemize yardımcı olabilir. Bu yöntem yüksek verimlilik ve düşük maliyetlidir.

Protokolümüz, oryantal meyve sineği araştırmacıları için mutant sinekler üretmek için yararlı bir rehber olarak hizmet edecektir. Başlamak için, ilgilenilen hedef genlerin yapısını tahmin edin ve Bactroceras dorsalis genomunun biyoinformatik analizi yoluyla ekzonlar ve intronlar arasındaki sınırları belirleyin. Tasarlanan sgRNA'yı üretmek için piyasada bulunan gRNA sentez kitini kullanın.

gRNA ürününü nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alın. UV görünür bir spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçün ve kullanmadan önce 80 santigrat derecede saklayın. B.dorsalis pupalarını% 55 bağıl nem, 26,5 santigrat derece ve 14:10 ışık / gün döngüsü yetiştirme koşuluyla plastik bir kafese yerleştirin.

Yetişkinler kapandığında, su ile birlikte yiyecek olarak şeker ve maya karışımı sağlayın. Çoğu yetişkin, ortaya çıktıktan 10 gün sonra cinsel olgunluğa ulaşır. Dişilerin doğurganlığını artırmak için 30 ila 50 lüks ışıklı bir ışık standı kullanın, bu nedenle embriyo toplama verimliliğini artırın.

Daha sonra, yumurtlama odasına, oda kapağından yaklaşık 1 ila 2 milimetre uzakta 200 örgülü bir gazlı bez yerleştirin. Mikroenjeksiyon kurulumu hazır olduğunda kafese yeni bir yumurtlama odası koyun. İnce bir ıslak fırça kullanarak embriyoları her 10 dakikada bir toplayın ve kendi kendine yapılan bir enjeksiyon plakasına hizalayın.

Daha fazla kurumayı önlemek için enjeksiyon sırasında embriyoları halokarbon yağına batırın. Cas9 proteinini ve karşılık gelen sgRNA'yı her birinin mikrolitresi başına 300 nanogram konsantrasyonuna karıştırarak çalışma çözeltisini hazırlayın. Daha sonra, enjekte edilen embriyoları işaretlemek için uygun bir yol olarak hizmet etmek için karışıma 1 mikrolitre fenol kırmızısı ekleyin.

SgRNA'nın bozulmasını önlemek için hazırlanan karışımı buz üzerine yerleştirin. Cam enjeksiyon iğnesini bir mikropipet çektirici kullanarak hazırlayın. Hava kabarcıkları sokmadan enjeksiyon iğnesine 3 mikrolitre karışım ekleyin.

Ardından, iğneyi bir Microgrinder kullanarak açın ve kullanım kılavuzuna göre mikromanipülatöre bağlayın. Enjektör parametrelerini Pi olarak 500 hektopaskal olarak ayarlayın. Ti'den 0,5 saniyeye ve PC'den 200 hektopaskallara.

Sıralı embriyoların bulunduğu plakayı objektif masaya yerleştirin. Ardından, mikropipet konumunu ince bir optik mikroskop altında ayarlayarak mikropipeti ve embriyoyu aynı düzleme ayarlayın. İğne ucunu embriyonun arka veya bitkisel kutbuna yerleştirin.

Ardından, karışımları embriyoya iletmek için enjektörden pedala basın. Hafif kırmızımsı rengin ortaya çıkması, karışıma fenol kırmızısının eklenmesinden kaynaklanmaktadır. Enjeksiyon plakasını enjekte edilen embriyolarla yapay bir iklim odasına yerleştirin.

36 saat sonra, taranmış larvaları ince uçlu bir fırça kullanarak larva diyetine aktarın. Larvaları daha fazla larva yumurtadan çıkmayana kadar günde üç veya dört kez toplayın. Daha sonra, olgun larvaları yavrulamak için ıslak kuma yerleştirin.

Yavru aşaması 10 gün sürer. Yavrulaşmadan sonra, eklozyon başlamadan önce pupaları plastik bir kafese taşıyın. Genomik DNA'yı taze bir puparyumdan veya bireysel yetişkinlerin tek bir orta bacağından izole ettikten ve hedef alanı büyütmek için spesifik primerleri tasarladıktan sonra, metin makalesinde açıklanan döngü koşullarını takiben polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR gerçekleştirin.

Ardından, saflaştırılmış PCR ürünlerini sıralayın. Hedef bölgeye bitişik birden fazla örtüşen tepe noktasının tespit edilmesi, başarılı mutagenezi göstermektedir. Alt klonlama için, saflaştırılmış PCR ürünlerini künt uçlu bir vektörle karıştırın ve 15 dakika boyunca 25 santigrat derecede yağlayın.

Ardından, trans-T1 hücreleri ekleyin ve 30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, 500 mikrolitre LB ortamı ekleyin ve çalkalayarak 1 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Süpernatanı santrifüj yapın ve atın.

Peleti yeniden askıya alın ve bir LB plakasına yayın. Gece boyunca inkübasyon için plakayı 37 santigrat dereceye yerleştirin. Daha sonra, mutantların genotipini doğrulamak için dizileme için bireysel bakteri kolonilerini seçin.

Bu çalışmada, seçilen genin hedef bölgesinin örneği üçüncü ekzonda yer almaktadır. Hedef bölge oldukça korunmuştur ve in vitro transkripsiyon elde edilen sentetik gRNA ve gRNA için DNA şablonu için jel elektroforezi ile tek bir bant tespit edilmiştir. Burada mikroenjeksiyonlardan sonra B.dorsalis sağkalımı ve mutagenezisi gösterilmiştir.

PCR ürünlerini sıraladıktan sonra, G0 bireylerinin% 80'i mozaik mutantlardır. Mutant taramasında, 8 baz çifti delesyonlu mutant, amino asit translasyonunun erken sonlandırılmasına neden oldu. İğneyi bir embriyonun arka bölgesine veya bitkisel kutbuna sokmak merkezi bir adımdır çünkü bu yumurtaların hayatta kalmasını doğrudan etkiler.

Bu teknoloji, B.Dorsalis'teki gen fonksiyonlarının alanlarını incelemek için bir referans sağlar Bu yöntemle istedikleri mutantları hızlı bir şekilde yakalayabilirler.