C. elegans · İmmünofloresan ve DAPI Boyama için Gonad Diseksiyonu ve Dondurucu Çatlak

Diseksiyon ve immünofloresan için bu yöntem birçok C.elegans laboratuvarı tarafından kullanılmaktadır. Bir antikor veya etiketli füzyon proteininin mevcut olduğu herhangi bir proteini tespit etmek için benimsenebilir. Bu diseksiyonu doğru yapmak için biraz pratik gerektirse de, bu protokol esnek ve sorun giderme için basittir.

Bizim için DAPI boyama her zaman işe yarar ve genellikle her antikor için işe yarayan bir durum bulabiliriz. Bu teknik için en büyük zorluk diseksiyon adımıdır. İyi germline ekstrüzyonları elde etmek için hızlı ama kendinden emin bir şekilde çalışmalısınız.

Uygulama anahtardır. Başlamak için, diseksiyon mikroskobunun sahnesine bir tutma slaytı yerleştirin ve kapak kaymasını tutma slaytının üzerine yerleştirin. Ardından, diseksiyon çözeltisinin dört mikrolitresini kapak kapağının ortasına pipetleyin ve görünümü serbest bırakmak için tutma kızağını sahnenin bir tarafına hareket ettirin.

Bir NGM plakasından diseksiyon çözeltisi damlasına 10 ila 20 hermafrodit seçin. Slayt başına yaklaşık 10 tane seçmek en iyisidir, ancak beş dakika içinde diseke edilemeyecek kadar fazla değildir. Hayvanları disseke etmek için, X şekli yapmak için iğnelerin noktalarını çaprazlayın ve bir yetişkini kapak kaymasının yüzeyine sabitlemek için X'in tabanını kullanın.

Daha sonra, X şeklini farenksin hemen arkasına, genç bir yetişkinin vücut uzunluğunun yaklaşık beşte birini veya başın berrak kısmının hemen altına yerleştirin. Daha sonra, hayvanın kafasını tek bir makas hareketiyle kesin, bağırsakların bir veya her iki yarısı ile birlikte vücut boşluğundan tamamen serbest bırakın. Numuneyi formaldehit ile sabitlemek için, pipetin dört mikrolitresini kapak kayması üzerinde, hayvanlarla damlaya çok yakın bir yerde, pipetin doğrudan diseksiyon damlasına girmesini ve disseke edilmiş karkasların yerini değiştirmesini önleyin.

Kapak kapağını tek parmağınızı kullanarak tutma kaydırağına sabitleyin. Öte yandan, damlaları karıştırmak için kapak kaymasını birkaç kez hafifçe kaydırın. Pozitif yüklü bir sürgüyü ön tarafı aşağı doğru tutarak, numune damlasına hafifçe dokunarak slaytın ortasındaki kapak kaymasını almak için kullanın ve damlanın yüzey gerilimi kapak kaymasını alacaktır.

Slaytı tezgaha yerleştirin ve oda sıcaklığında tam olarak beş dakika sabitleyin. Bu süre zarfında, slaytı bir kalemle etiketleyin. Kızağın etiketli kenarını cımbızla tutarken sıvı azot kullanarak numuneyi dondurmak için yavaşça sıvı azot içine indirin.

Slaytı, kapağın kayması tarafı yukarı bakacak şekilde kabın yan tarafına yaslanacak şekilde serbest bırakın ve slaytlar 10 saniye içinde dondurulur. Donmak için kuru buz kullanıyorsanız, donu alüminyum bloğun yüzeyinden bir tıraş bıçağı ile kazıdıktan sonra, sürgünün etiketli kenarını sıkıca tutun ve temizlenmiş yüzeye yerleştirin, blokla tam teması sağlamak için aşağı doğru bir miktar basınç uygulayın. Donma, kapak kaymasının altındaki numune buza döndüğünde 10 saniye içinde gerçekleşir.

Kızağın etiketli kısa kenarını sıkıca kavrayarak donmuş sürgüyü çıkarın ve uzun bir kenarı tezgaha yaslayın. Öte yandan, bir tıraş bıçağını sıkıca tutun ve tıraş bıçağının kenarını kaydırarak kapağı numuneden uzaklaştırın ve uzaklaştırın. Slaytı hemen% 95 etanol içeren bir Coplin kavanozuna yerleştirin ve slaytları en az beş dakika etanol içinde bırakın.

Ardından, slaytları PBST'de oda sıcaklığında her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve her yıkama için taze PBST kullanın. Germline çekirdeklerinin floresan görüntüleme sonuçları, DAPI'nin DNA'ya güçlü bir şekilde bağlandığını göstermiştir. İmmünofloresan boyama, çift iplikçikli kırılmalar için bir belirteç olan RAD-51'i hedef alan antikor, DAPI tarafından işaretlenmiş kromozomlarda birlikte lokalize olan miotik çekirdekler içinde ayrık odaklar olarak mevcut olduğunda etkiliydi.

Kle-2 heterozigot mutantları, hafif düzensiz DAPI boyaması ve daha yüksek sayıda RAD-51 odağına yansıyan çift iplikçik kırılma sayısındaki artışla gösterildiği gibi, kromozom yapısında küçük kusurlara sahiptir. Hem diseksiyon hem de donma çatlak adımları zor olabilir, bu nedenle hızlı ve sorunsuz çalışmak önemlidir. Tüm protokolü denemeden önce bu adımları uygulamanızı öneririz.

Örneğin, 200 mikrolitre gibi daha büyük bir sıvı hacminde diseksiyon yapabilir ve bir kapak fişinde önerilen dört mikrolitre hacmine kademeli olarak çalışabilirsiniz. Bu teknik, konfokal veya yapılandırılmış bir aydınlatma mikroskobunda yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılabilir veya proteinlerin belirli dizilere göre nasıl lokalize olduğunu görselleştirmek için DNA veya RNA-FISH, floresan in situ hibridizasyon ile kombinasyon halinde kullanılabilir.