Hücre Dışı Vezikül Alt Kümelerinin Analizi için Çok Katlı Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme Çipi Üzerinde Multimodal Analitik Platform
March 17th, 2023
Bu makale, hücre dışı vezikül alt kümelerinin karakterizasyonu için artan verime sahip yeni nesil multiparametrik analitik platformlar önermektedir. Yöntem, bir mikroarray biyoçipinde sıkışmış veziküler hedefleri nitelemek için Raman spektroskopisi ile birleştiğinde, atomik kuvvet mikroskobu ile metrolojik ve morfomekanik analizlerle çoklanmış biyosensing yöntemlerinin bir kombinasyonuna dayanmaktadır.
EV'lerin karmaşık doğası, ilgilenilen alt popülasyonu tanımayı zorlaştırır ve bu protokol onları fenotipleri, boyut profilleri ve nanomekanik özellikleri ile tespit edebilir. Bu teknik kombinasyonu, EV'leri durum ortamından ve kan plazmasından gerçek zamanlı olarak tespit etmemizi sağlayan etiketsiz bir yöntemdir. Bu teknik, patolojinin biyogöstergeleri olarak kullanılmak üzere veya ayrıca ilaç dağıtımı için nanopartikül olarak kullanılmak üzere ilgilenilen nanopartiküllerin derin alt kümesini karakterize etmeyi sağlar.
Çok hassas bir yöntem olduğundan, ilgilendiğiniz numuneyi enjekte etmeden önce biyoçip preparatına dikkat etmeniz zorunludur. Talaşları kapladıktan ve işlevselleştirdikten sonra, biyoçipi oda sıcaklığında karanlıkta en az 30 dakika boyunca 200 milimolar etil dimetilaminopropil karbodiimid / N-hidroksissüksinamid ve litre başına 50 milimolar N-hidroksisüksinamid karışımında inkübe edin. Gözcüyü kullanarak, 300 nanolitre ligand çözeltisi ekleyin ve biyoçipi 30 dakika boyunca sonik bir banyo altında inkübe edin.
Biyoçipi üstten ultra saf suyla yıkayın. Biyoçip ve prizma arasında düzgün bir ince tabaka oluşturmak için prizma ile aynı kırılma indisine sahip bir damla yağ damlacığı ekleyin ve biyoçip ile aynı kırılma indisine sahip bir prizmaya yavaşça yerleştirin. Yüzey plazmon rezonans görüntülemesi için, biyoçipi SPRi sistemine monte edin.
Yazılımın sol tarafındaki açılır menüye gidin ve Çalışma dizinine tıklayın. Farklı noktaların görünür olduğu görüntüyü bulun ve bu görüntüyü seçmek için tıklatın. Ardından ligand ailelerinin adını yazın ve Finish türü tanımına tıklayın.
Siyah çizgiyi imleçle optimum çalışma açısına sürükleyin. Aynayı çalışma açısına taşı'ya tıklayın ve bir çalışma açısı seçin. Şimdi Kinetics'e tıklayın.
Yazılım kullanıcıdan negatif kontrolü tanımlamasını istediğinden, bu noktada Negatif kontrol yok'u seçin. Sıçan serum albüminini dört dakika boyunca dakikada 50 mikrolitrede enjekte edin. Yüzeyde hala mevcut ve reaktif olan karboksilik grupları devre dışı bırakmak için 10 dakika boyunca dakikada 20 mikrolitrede etanolamin enjekte edin.
Daha sonra, biyoçipi dört dakika boyunca dakikada 50 mikrolitrede 40 milimolar OG enjekte ederek yıkayın. Hücre dışı vezikülleri, biyofonksiyonel çip üzerinde belirli bir konsantrasyonda enjekte ederken, aynı anda farklı noktalardaki veziküllerin etkileşiminin kinetiği takip edin. Ayrıca yansıtıcılığın değerini ve etkileşim seviyesini de belirleyin.
Stabilize edildikten sonra, AFM görüntülemeyi yapmadan önce hücre dışı vezikülleri bulundukları yere sabitlemek için çip üzerine glutaraldehit enjekte edin. Cam slayttaki maskenin üstündeki biyoçipi hizalayın. Konsolları taranması gereken doğru noktaya yerleştirmek için AFM'nin üstündeki CCD kamerayı kullanın.
AFM alımını temas modunda üç ila beş büyük alandan küçük alanlara doğru başlatın. Ardından, önce yükseklik kanalını seçerek AFM görüntülerini JPK veri işleme yazılımıyla işleyin. Düzleştirilmiş tarama çizgileri elde etmek için her çizgiden çıkarılacak bir polinom uyumu seçin.
Yüzeydeki pürüzlülüğü ortadan kaldırmak için altın taneleri üzerindeki yükseklik eşiğini seçin. Tahıl ekstraksiyon modülü, 8.5 nanometrelik bir yükseklik eşiği kullanarak taneleri işaretler. Albümin pasivasyonundan sonra çoklanmış biyoçipler analiz edildi.
Varsayılan değeri olmayan çip. Lekelerin füzyonu, zayıf aşılama veya kabarcıklar veya kirleticiler nedeniyle bazı kusurları olan çip. Ve hücre dışı veziküllerin altın üzerindeki adsorpsiyonunu incelemek için mikrodizileri olmayan çıplak bir altın çip gösterilmiştir.
Çok katlı bir biyoçip üzerindeki yakalama deneyi, farklı ligandlar için iyi yansıtıcılık sinyalleri ve farklı ligandlar için iyi bir sinyal-gürültü oranı gösterdi, çünkü negatif kontrolün tepkisi ihmal edilebilirdi. Hücre dışı vezikül örneğinin enjeksiyonundan sonra hücre dışı vezikül adsorpsiyonu, yüksek yansıtıcılık sinyali gösterdi, bu da bu veziküllerin altın çip üzerinde adsorbe edebileceğini ve sabit kalabildiğini düşündürdü. Hücre dışı vezikül yüklemesinden sonra, biyoçipler üzerindeki hücre dışı veziküllerin büyük ölçekli ve küçük ölçekli AFM görüntüleri üretildi.
Yüksek çözünürlüklü daha yakından görünüm, hücre dışı veziküllerin metrolojisini mümkün kılar. Bir biyoçip üzerindeki hücre dışı veziküllerin etkili çapı 30 ila 300 nanometre arasında değişmekte olup, büyük çoğunluğu 60 nanometre civarındadır. Havada ve sıvıda elde edilen sonuçlar karşılaştırılabilirdi.
Çıplak bir çip üzerinde adsorbe edilen hücre dışı veziküllerin Raman spektrumu, esas olarak hücre dışı vezikül zarlarının lipitleriyle ilişkili metilen titreşimlerine karşılık gelen zirvelerle net bir spektrum ortaya çıkardı. EV'lerinizi doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde tespit edebilmek için biyoçipinizi titizlikle hazırlamanız önemlidir. Batı lekelenmesi ve nanopartikül izleme analizi gibi geleneksel yöntemler, fenotipleri ve boyut modellerini ilişkilendirmek ve doğrulamak için kullanılabilir.
Dahası, multi-omik analizlerin EV moleküler karakterizasyonuna ve potansiyel alt küme ayrımcılığına daha da derine inmesi öngörülmektedir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, hücre dışı vezikül (EV) alt kümelerini yüksek verimle karakterize etmek için yeni bir multiparamtrik analitik platform sunmaktadır. Platform, EV'leri gerçek zamanlı olarak analiz etmek için multiplexed biyosensör yöntemlerini atomik kuvvet mikroskobu ve Raman spektroskopisi ile birleştirir ve fenotiplerine, boyut profillerine ve nanomekanik özelliklerine odaklanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre dışı vezikül karakterizasyonu
- Multiparamtrik analitik teknikler
- Biyosensör yöntemleri
Arka Plan
- EV'lerin karmaşıklığı, alt popülasyon tanımlamasını zorlaştırır.
- Patolojiler ve ilaç teslimatı için biyobelirteçler olarak EV'lerin önemi.
- Çeşitli biyolojik örneklerde hassas tespit yöntemlerine duyulan ihtiyaç.
Kullanılan Yöntemler
- Multiplexed biyosensör, atomik kuvvet mikroskobu ve Raman spektroskopisini birleştirir.
- EV'leri gerçek zamanlı olarak tespit etmek için biyofonksiyonel mikrodiziler kullanır.
- EV karakterizasyonu ile müdahaleyi en aza indirgemek için etiketsiz yaklaşım.
Ana Sonuçlar
- Teknik, boyut ve bileşime dayalı olarak EV'lerin etkili tespit edilmesini gösterir.
- Yüksek çözünürlüklü görüntüleme, 30 ila 300 nanometre arasında değişen, çoğunlukla 60 nanometre civarında EV'lerin çapını ortaya koyar.
- Raman spektrumları, lipid zar bileşimini gösterir ve yöntemin etkinliğini doğrular.
Sonuçlar
- Çalışma, kapsamlı EV karakterizasyonu için güvenilir bir yöntemin başarılı bir şekilde gösterilmesini sağlar.
- Bu çalışma, biyobelirteç araştırması ve terapötik uygulamalar için önemli sonuçlara sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicle (EV) subsets with high specificity and throughput is a critical challenge in early biomarker discovery and therapeutic platform development. The described multimodal analytical platform integrates multiplexed biosensing, atomic force microscopy, and Raman spectroscopy to deliver quantitative, label-free phenotypic and molecular profiling of EVs. This capability enhances predictive confidence in EV-based biomarker validation and supports risk-adjusted portfolio decisions in translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables deep phenotypic and nanomechanical profiling of EV subpopulations for target validation.
- Supports biological de-risking by distinguishing EV subsets based on size, composition, and molecular features.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of EVs as disease-relevant bioindicators.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed biochips for reproducible EV capture and analysis workflows.
- Delivers quantitative, real-time readouts of EV interactions and adsorption profiles.
- Standardizes assay conditions to enable reliable cross-sample and cross-ligand comparisons.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV subset characterization with translational biomarker strategies for disease monitoring.
- Provides continuity from discovery-stage EV profiling to preclinical validation of candidate biomarkers.
- Reduces mechanistic ambiguity in EV-based therapeutic and diagnostic development.
Pipeline & Workflow Integration
This multimodal platform bridges early discovery, screening, and translational research by enabling comprehensive EV subset analysis from biological fluids.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and mechanistic de-risking through multiplexed, quantitative EV profiling.
- Screening: Delivers reproducible, label-free assay outputs for EV subset discrimination and ligand specificity.
- Analytics: Integrates morphomechanical and molecular readouts to inform cross-condition comparisons and statistical analysis.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and preclinical continuity for EV-based diagnostics.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable analytical platform for diverse EV research and development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker and therapeutic candidate selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in EV analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in EV-focused portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EV-based discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed biosensing, AFM, and Raman spectroscopy for optimal platform operation.
- Demands rigorous biochip preparation and functionalization to ensure reproducibility and sensitivity.
- Needs access to advanced instrumentation and analytical infrastructure for high-resolution EV characterization.
- Benefits from cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation for different biological matrices or EV sources as supported by the platform's flexibility.
