SARS-CoV-2 Reseptör Bağlama Etki Alanını Gösteren Dış Membran Veziküllerine Dayalı Bir "Tak ve Görüntüle" Nanopartikül Aşı Platformu

Nanobilim, antijenleri yüzeyinde gösterdikten sonra antijene özgü bağışıklık tepkisini etkili bir şekilde artırabilir Bu aşı platformundaki ana avantaj, plak ve gösterimden çıkmayı başarabilir. Başka bir deyişle, platform antijenlerin çeşitliliğini görüntüleyebilir Bu yöntem, motoru nano boyutlu taşıyıcılara göstermek için diğer biyolojik nanopartiküllere de uygulanabilir. Sitolisin A casus kateter transformasyonunu gerçekleştirmek için, 50 mikrolitre BL 21 yetkin suşuna beş mikrolitre plazma çözeltisi ekleyerek başlayın.

Yavaşça üfleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde soğumaya bırakın. Çözeltiyi 90 saniye boyunca su banyosuna 42 santigrat derecede yerleştirin ve ardından karıştırılmış çözeltiyi hemen üç dakika boyunca buz üzerine koyun. Bakteriyel süspansiyona 500 mikrolitre luria bertani besiyeri ekleyin ve kültürü karıştırdıktan sonra bir saat boyunca 37 santigrat derecede dakikada 220 rotasyonda karıştırın.

Daha sonra, ampisilin ve kültür içeren tüm dönüşüm luria bertani agar plakasını 37 santigrat derecede bir gecede plakalayın. OMV casus yakalayıcı üretimi için, tek bir koloninin plakadan 20 mililitre luria bertani ortamına ve kültürüne 37 santigrat derecede dakikada 220 rotasyonda gece boyunca izole edilmesiyle başlayın. Bakteriyel çözeltiyi iki litrelik bir ortama ve logaritmik büyüme aşamasına ulaşana kadar beş saat boyunca 37 santigrat derecede dakikada 220 rotasyonda kültüre inkübe edin.

Bakteriyel çözeltinin son konsantrasyonunu 0.5 milimolar yapmak için izopropil beta D-IPTG ekleyin ve daha sonra 25 santigrat derecede dakikada 220 rotasyonda gece boyunca kültürleyin. Ardından, OMV casus avcısı saflaştırması gerçekleştirin. Bakteriyel çözeltiyi kaynaştıran centri ile başlayın.

Süpernatantı 0,22 mikrometrelik bir membran filtreyle filtreleyin, ardından içi boş bir fiber sütun kullanarak konsantre edin. Konsantreyi 0,22 mikrometrelik bir membran filtreden süzün, ardından ultra centri sigorta kullanarak iki saat boyunca dört santigrat derecede 150.000 kez G'de kaynaştırın ve süpernatantı bir pipetle atın. Yağışı PBS ile tekrar askıya alın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

RBD casus transfeksiyonunu gerçekleştirmek için, uygun bir ökaryotik ekspresyon sistemi seçerek başlayın ve hücreleri iyileşmeden sonra 37 santigrat derecede dakikada 130 rotasyonda bir gecede kültürleyin. Otomatik hücre sayacına 20 mikrolitre HEK 293F hücre çözeltisi ekleyin. Hücre sayısını kaydedin, konsantrasyonu mililitre başına altı hücreye bir kez 10 olarak ayarlayın.

Ve sonra hücreleri dört saat boyunca 37 santigrat derecede dakikada 130 rotasyonda kültürleyin. RBD casus etiketi plazmidini 0.22 mikrometrelik bir membran filtreden filtreleyin ve son hacim 10 mililitre olana kadar hücre kültürü ortamına 300 mikrogram plazmid ekleyin. 10 saniye çalkalayın.

PEI'yi su banyosunda 65 santigrat dereceye ısıtın. 0.7 mililitre PEI'yi 9.3 mililitre hücre kültürü ortamı ile karıştırın ve 10 saniye boyunca aralıklı olarak çalkalayın. PEI çözeltisine plazmid çözeltisi ekleyin.

Karışımı aralıklı olarak 10 saniye çalkalayın ve 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Karışımı 280 mililitre hücre kültürü ortamına ekleyin ve beş gün boyunca 37 santigrat derecede dakikada 130 rotasyonda kültürleyin. Ardından, RBD casus etiketi saflaştırma işlemini gerçekleştirin.

Hücreleri 20 dakika boyunca 25 santigrat derecede 6.000 kez G'de kaynaştırarak merkezle başlayın ve süpernatanı toplamak için bir pipet kullanın. Kolonu iki mililitre nikel NTA agarozu ile doldurun ve PBS ile üç kez yıkayın. 20 milimolar'ın son konsantrasyonunu yapmak için hücre süpernatantına imidazol ekleyin ve hücre süpernatantını yükleyin.

Yıkama için 20 milimolar imidazol içeren üç sütun PBS hacmi ekleyin ve yıkama fraksiyonunu toplayın. Düşük ila yüksek konsantrasyonlarda imidazol içeren üç sütun PBS hacmi ile gradyan elütu, her konsantrasyon için iki kez elüter. BCA yöntemiyle protein konsantrasyonunu belirlemek için, standart BSA protein çözeltisini mililitre başına iki ila 0.0625 miligram arasında seri olarak seyreltin, saflaştırılmış OMV casus yakalayıcısını ve RBD casus etiketini 10 kez seyreltin.

Daha sonra BCA çalışma çözeltileri A ve B'yi 50'ye bir oranında karıştırın. Seyreltilmiş protein çözeltisi ekleyin ve BCA çalışma çözeltisi ile karıştırın. 30 dakika boyunca 37 derecede inkübe edin.

Her bir kuyucuğun 562 nanometresinde absorbansı ölçün ve standart eğriden protein konsantrasyonunu hesaplayın. OMV casus yakalayıcı ve RBD casus etiketinin biyokonjugasyonunu gerçekleştirmek için, OMV casus yakalayıcı ve RBD casus etiketi ve PBS'yi 40 ila bir oranında karıştırın. Karışımı gece boyunca dört santigrat derecede dakikada 15 dönüşte karıştırmak için dikey olarak döndürün.

OMV casus avcısı saflaştırmasına benzer bir prosedür kullanarak PBS çözeltisini kullanarak OMV RBD'nin saflaştırılmasını gerçekleştirin. Plazma tasarım şeması, casusluk geninin esnek bağlayıcı aracılığıyla cly A genine bağlandığını, casus ise saflaştırma ve doğrulama için bir hys etiketi geni ile RBD geninin beş ana terminaline bağlandığını göstermektedir. Ultrasantrifüjlemeden sonra, reaksiyona girmemiş RBD casusluğunun neredeyse tamamı süpernatant içinde kaldı.

İkinci ultrasantrifüjleme, ilk kez daha önemli bir avantaj sağlamadı. OMV casus yakalayıcısının z ortalama hidrodinamik çapı 133 nanometre iken, OMV-RBD için 152.6 nanometre idi. Bu farklılıklar, RBD'nin yoğun görüntülemeden sonra OMV partikül boyutunu arttırmasından kaynaklanıyor olabilir.

TEM sonuçları, DLS sonuçlarından elde edilen partikül boyutu dağılımı ile tutarlıdır. Karışımın harmanlanması için rotasyon çok önemlidir. Reaksiyonun verimliliği dönmeden çok daha düşük olabilir.