Name: SARS-CoV-2 Reseptör Bağlama Etki Alanını Gösteren Dış Membran Veziküllerine Dayalı Bir Tak ve Görüntüle Nanopartikül Aşı Platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Öğrenin dış membran veziküllerini biyomühendislik ve aşı geliştirme için nasıl kullanılır. Bu yöntem çoklu antijen sunumuyla bağışıklık yanıtını güçlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı'nın Anahtar Programı tarafından desteklenmiştir (Hayır. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Projesi (No. 31670936, 82041045).

1. Plazmid yapımı
<ol><li>Daha önce yayınlanan bir rapor20'yi takiben plazmid pThioHisA ClyA-SC'yi oluşturmak için BamH I ve Sal I bölgeleri arasındaki ampisilin dirençli bir pThioHisA-ClyA plazmidine DNA kodlama SpyCatcher dizisini (Ek Dosya 1) yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Sentezlenmiş SpyTag-RBD-Histag füzyon genini (Ek Dosya 1), daha önce yayınlanmış bir rapor19'u takiben plazmid pcDNA3.1 RBD-ST'yi oluşturmak için BamH I ve EcoR I siteleri arasında bir pcDNA3.1 plazmidine (bakınız Malzeme Tablosu) bağlayın.</li>
</ol>2. OMV-SC hazırlığı
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek ClyA-SC dönüşümünü gerçekleştirin.<ol><li>50 μL BL21 yetkin gerinimine 5 μL pThioHisA ClyA-SC plazmid çözeltisi (50 ng / μL) ekleyin, hafifçe üfleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde soğumaya bırakın.</li>
		<li>90 s'lik çözeltiyi 42 ° C'deki su banyosuna yerleştirin ve ardından karıştırılmış çözeltiyi hemen 3 dakika boyunca buz üzerine koyun.</li>
		<li>Bakteriyel süspansiyona 500 μL LB ortamı ekleyin ve karıştırdıktan sonra 1 saat boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de kültür ekleyin.</li>
		<li>Ampisilin (100 μg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ve kültür içeren bir LB agar plakasına dönüşümü 37 ° C'de gece boyunca plakalayın. NOT: Sonraki deneylerde, ampisilin ortamda aynı konsantrasyonda tutuldu. Aksi takdirde, bu bakterilerde plazmid kaybına neden olabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>OMV-SC üretimi için aşağıdaki adımları uygulayın.<ol><li>Tek bir koloniyi, plakadan (adım 2.1.4.) 20 mL LB (ampisilin dirençli) ortama ve kültürden gece boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de izole edin.</li>
		<li>Bakteriyel çözeltiyi (adım 2.2.1'den itibaren.) 2 L ortama, 220 rpm'de kültüre, logaritmik büyüme aşamasına kadar 5 saat boyunca 37 ° C'ye (OD600nm, 0.6 ila 0.8 arasındadır) aşılayın.</li>
		<li>Bakteriyel çözeltinin 600 nm'sindeki OD 0.6-0.8'e ulaştığında, bakteriyel çözeltinin son konsantrasyonunu 0.5 mM yapmak için izopropil beta-D-tiyogalaktopiranosid (IPTG, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve daha sonra 25 ° C'de 220 rpm'de gece boyunca kültürleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>OMV-SC saflaştırma işlemini gerçekleştirin.<ol><li>Bakteriyel çözeltiyi 30 dakika boyunca 4 °C'de 7.000 x g'de santrifüj edin.</li>
		<li>Süpernatantı 0,22 μm membran filtre ile filtreleyin, ardından 100 kD ultrafiltrasyon membranı veya içi boş fiber kolon kullanarak konsantre edin (bkz.</li>
		<li>Konsantreyi 0,22 μm'lik bir membran filtreden süzün, ardından ultrasantrifüj kullanarak 2 saat boyunca 4 °C'de 150.000 x g'de santrifüj yapın (bkz.</li>
		<li>Yağışı PBS ile yeniden askıya alın ve -80 ° C'de saklayın. Çözelti -80 ° C'de uzun süreli stabiliteyi koruyabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. RBD-ST hazırlığı
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek RBD-ST transfeksiyonu gerçekleştirin.<ol><li>Uygun bir ökaryotik ekspresyon sistemi (örneğin, HEK293F) seçin ve iyileşmeden sonra hücreleri 37 ° C'de 130 rpm'de gece boyunca kültürleyin.</li>
		<li>Otomatik hücre sayacına 20 μL HEK293F hücre çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), hücre sayısını kaydedin, konsantrasyonu 1 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın ve ardından hücreleri 4 saat boyunca 37 ° C'de 130 rpm'de kültürleyin.</li>
		<li>RBD-ST plazmidini 0,22 μm membran filtreden filtreleyin ve son hacim 10 mL olana kadar hücre kültürü ortamına 300 μg plazmid ekleyin (bkz. 10 s sallayın.</li>
		<li>PEI'yi (1 mg/mL, bakınız Malzeme Tablosu) su banyosunda 65 °C'ye ısıtın, 0,7 mL PEI'yi 9,3 mL hücre kültürü ortamı ile karıştırın ve 10 sn boyunca aralıklı olarak çalkalayın. NOT: Solüsyonu kuvvetlice sallamayın. Aksi takdirde, ortaya çıkan kabarcıklar transfeksiyon verimliliğini etkileyebilir.</li>
		<li>PEI çözeltisine plazmid çözeltisi ekleyin, karışımı 10 s boyunca aralıklı olarak çalkalayın ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Karışımı 280 mL hücre kültürü ortamına ve 5 gün boyunca 37 ° C'de 130 rpm'de kültüre ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>RBD-ST saflaştırma işlemini gerçekleştirin.<ol><li>Hücreleri 20 dakika boyunca 25 ° C'de 6.000 x g'da santrifüj edin ve süpernatanı toplamak için bir pipet kullanın.</li>
		<li>Sütunu 2 mL Ni-NTA agaroz ile doldurun ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3x PBS ile 3 kat yıkayın.</li>
		<li>20 mM'lik son konsantrasyonu yapmak için hücre süpernatanına imidazol ekleyin (bkz.</li>
		<li>Yıkama için 20 mM imidazol içeren 3 sütun hacmi (CV) PBS ekleyin ve yıkama fraksiyonunu toplayın.</li>
		<li>Düşük ila yüksek konsantrasyonlarda (örneğin, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M) imidazol içeren 3 CV PBS ile gradyan elütü; Her konsantrasyon için 2x elüt.</li>
		<li>Farklı konsantrasyon gradyanlarındaki RBD-ST'yi tanımlamak için SDS-PAGE21'i kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. OMV-RBD biyokonjugasyon ve saflaştırma
<ol><li>BCA yöntemi ile protein konsantrasyonunu belirleyin (bakınız Malzeme Tablosu).<ol><li>Standart BSA protein çözeltisini 2 mg/mL'den 0,0625 mg/mL'ye kadar seri olarak seyreltin, saflaştırılmış OMV-SC ve RBD-ST 10x'i seyreltin, ardından BCA çalışma çözeltileri A ve B'yi (tahlil kitinde sağlanan) 50:1 (v/v) oranında karıştırın.</li>
		<li>Seyreltilmiş protein çözeltisi (25 μL / kuyu) ekleyin ve BCA çalışma çözeltisi (200 μL / kuyu) ile karıştırın; 30 dakika boyunca 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Her bir kuyucuğun 562 nm'sinde absorbansı (OD) ölçün ve standart eğri22'den protein konsantrasyonunu hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek OMV-SC ve RBD-ST'nin biyokonjugasyonunu gerçekleştirin.<ol><li>PBS'de OMV-SC ve RBD-ST'yi 40:1 (w/w) oranında karıştırın.</li>
		<li>Karışımı gece boyunca 4 ° C'de 15 rpm'de karıştırmak için dikey olarak döndürün. NOT: Farklı antijenler farklı oranlarda reaksiyona girebilir. Antijenin özelliklerine bağlı olarak farklı reaksiyon oranları denenebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Reaksiyon verimliliğini doğrulayın.<ol><li>10 μL OMV-SC, RBD-ST ve reaksiyon ürününü hazırlayın (adım 4.2.). 2,5 μL 5x yükleme tamponu ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve numuneleri 100 °C'de 5 dakika ısıtın. Numuneleri jele (10 μL/kuyu) yükleyin. 20 dakika boyunca 60 V'ta elektroforez yapın ve durumu 1 saat boyunca 120 V olarak değiştirin.</li>
		<li>Proteini jelden PVDF batı lekeleme membranlarına (bakınız Malzeme Tablosu) 70 dakika boyunca 100 V'ta aktarın.</li>
		<li>Membranı %5 yağsız süt / TBST tozuna koyun ve 1 saat çalkalayın. Ardından, çalkalama ile yıkama başına 5 dakika boyunca TBST ile 3x yıkayın.</li>
		<li>Membranı% 0.1 His-Tag antikoru / TBST'ye koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1 saat çalkalayın, ardından sallama ile yıkama başına 5 dakika boyunca TBST ile 3x yıkayın.</li>
		<li>Membranı% 0,02 anti-fare IgG1 antikoru (HRP ) / TBST'ye koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 40 dakika çalkalayın, ardından sallama ile yıkama başına 5 dakika boyunca TBST ile 3x yıkayın.</li>
		<li>Gelişmiş kemilüminesans çözeltisi ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve membranı açığa çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>OMV-RBD'nin saflaştırılmasını gerçekleştirin.<ol><li>1 mL reaksiyona giren OMV-RBD çözeltisini 10 mL'ye kadar seyreltin ve seyreltmeyi 2 saat boyunca 4 °C'de 150.000 x g'de santrifüj edin.</li>
		<li>Süpernatantı atmak için bir pipet kullanın ve kalıntıyı 10 mL PBS ile askıya alın. Süspansiyonu 2 saat boyunca 4 °C'de 150.000 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süpernatantı atın ve kalıntıyı 1 mL PBS ile askıya alın. NOT: Antijenin çözünürlüğü çok daha düşükse, aynı ayırma etkisi boyut dışlama kromatografisi19 ile elde edilebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Karakterizasyon
<ol><li>Dinamik ışık saçılımı (DLS) gerçekleştirin.<ol><li>Numuneleri 100 μg/mL konsantrasyonda seyreltin ve numune hücresine 1 mL numune ekleyin.</li>
		<li>"Ölçüm tipi" için "Boyut"u, "Numune malzemesi" için "Protein"i, "Dispersan" için "Su"yu, "Sıcaklık" için "25 °C"yi seçin ve ardından numuneleri yükleyip otomatik olarak ölçün23'ü seçin.</li>
	</ol></li>
	<li>İletim elektron mikroskobu (TEM) kullanarak görüntüleri yakalayın.<ol><li>Numuneleri 100 μg/mL'ye kadar seyreltin. 200 mesh bakır ızgara alın, üzerine 20 μL numune ekleyin ve 10 dakika boyunca emilmesini sağlayın.</li>
		<li>Çözeltiyi fitillemek için filtre kağıdı kullanın, destek filmine 20 μL% 3 uranil asetat ekleyin ve 30 saniye boyunca lekeleyin.</li>
		<li>Uranil asetat fitilini çekin ve filmi oda sıcaklığında 1 saat boyunca doğal olarak kurutun.</li>
		<li>Numuneleri TEM sistemine yükleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve 80 kV'ta görüntü yakalayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li>
<li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433(2020).</li>
<li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li>
<li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles%3A+From+discovery+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li>
<li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li>
<li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683(2019).</li>
<li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li>
<li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines%3A+A+new+toolkit+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314(2019).</li>
<li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li>
<li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li>
<li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li>
<li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li>
<li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+Structure%2C+Biology%2C+and+Structure-Based+Therapeutics+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269(2020).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+%28ZF2001%29+against+COVID-19+in+adults%3A+Two+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+phase+1+and+2+trials%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li>
<li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD%2C+RBD%2C+and+S2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li>
<li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403(2021).</li>
<li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739(2021).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+%28RBD%29+and+heptad+repeat+%28HR%29+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li>
<li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimer-PAGE%3A+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341(2017).</li>
<li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001(2021).</li>
<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli%3A+Design%2C+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458(2016).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li>
<li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li>
<li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li>
<li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li>
<li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li>
<li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890(2020).</li>
<li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li>
<li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066(2021).</li>
<li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776(2016).</li>
<li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090(2021).</li>
<li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923(2021).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bir "Tak ve Görüntüle" nanopartikül aşı platformu oluşturmak için, SC-kaynaşmış ClyA, protein ekspresyonu24'teki avantajları nedeniyle rekombinant protein üretimi için en yaygın kullanılan modellerden biri olan BL21 (DE3) suşlarında ifade edildi, böylece bakteri çoğalması işlemi sırasında OMV'lerin yüzeyinde yeterli SC fragmanı gösterilecekti. Aynı zamanda, antijenler ve OMV'ler arasındaki kimyasal eşleşme için ST-kaynaşmış bir hedef antijen hazırlandı. Bu deneysel şemanın avantajları ve gelecekte...

Potansiyel bir aşı platformu olarak, dış zar vezikülleri (OMV'ler) son yıllarda giderek daha fazla dikkat çekmektedir 1,2. Esas olarak gram-negatif bakteri3 tarafından doğal olarak salgılanan OMV'ler, genellikle 20-300 nm4 boyutunda bir lipit çift katmanından oluşan küresel nano ölçekli parçacıklardır. OMV'ler, katı immün güçlendiriciler olarak hizmet veren bakteriyel antijenler ve patojenle ilişkili moleküler paternler (PAMP'ler) dahil olmak üzere çeşitli ebeveyn bakteriyel bileşenleri içerir5. Eşsiz bileşenlerinden, doğal vezikül yapısından ve büyük genetik mühendisliği modifikasyon alanlarından yararlanan OMV'ler, bakteriyel aşılar6, adjuvanlar7, kanser immünoterapi ilaçları8, ilaç dağıtım vektörleri9 ve anti-bakteriyel yapıştırıcılar10 dahil olmak üzere birçok biyomedikal alanda kullanılmak üzere geliştirilmiştir.
2020'den bu yana dünya çapında yayılan SARS-CoV-2 salgını, küresel topluma ağır bir zarar verdi. Spike proteinindeki (S proteini) reseptör bağlayıcı alan (RBD), insan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE2) ile bağlanabilir ve bu da virüsünhücre 11,12,13'e girmesine aracılık eder. Bu nedenle, RBD aşı keşfi için birincil hedef gibi görünmektedir14,15,16. Bununla birlikte, monomerik RBD zayıf immünojeniktir ve küçük moleküler ağırlığı bağışıklık sisteminin tanımasını zorlaştırır, bu nedenle adjuvanlara sıklıkla ihtiyaç duyulur17.
RBD'nin immünojenisitesini arttırmak için çok değerli RBD'ler gösteren OMV'ler inşa edildi. RBD'yi görüntülemek için OMV kullanan mevcut çalışmalar genellikle RBD'yi bakteri18'de ifade edilmek üzere OMV ile kaynaştırır. Bununla birlikte, RBD virüs kaynaklı bir proteindir ve prokaryotik ekspresyonun aktivitesini etkilemesi muhtemeldir. Bu sorunu çözmek için, Streptococcus pyogenes'ten türetilen SpyTag (ST) / SpyCatcher (SC) sistemi, geleneksel bir tampon sisteminde OMV ve RBD ile kovalent bir izopeptit oluşturmak için kullanıldı19. SC alanı, biyomühendislik ürünü Escherichia coli tarafından bir füzyon proteini olarak Cytolysin A (ClyA) ile eksprese edildi ve ST, HEK293F hücresel ekspresyon sistemi aracılığıyla RBD ile eksprese edildi. OMV-SC ve RBD-ST gece boyunca karıştırıldı ve inkübe edildi. Ultrasantrifüjleme veya boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırmadan sonra OPV-RBD elde edildi.

<table><tbody><tr><td>Ampisilin sodyum</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610028</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik hücre sayacı</td><td>Countstar</td><td>BioTech</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein miktar tayin kiti</td><td>cwbio</td><td>cw0014s</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Dokunmatik Görüntüleme Sistemi</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danamik Işık Saçılımı</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano S90</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez aparatı</td><td>Cavoy</td><td>Power BV</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Buffers H 10X TBST Tampon</td><td>Sangon Biotech</td><td>C520009</td><td></td></tr><tr><td>Keçi pAb fare IgG1</td><td>Abcam</td><td>ab97240</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek hızlı dondurma santrifüjü</td><td>Bioridge</td><td>H2500R</td><td></td></tr><tr><td>His-Tag fare mAb</td><td>Hücre sinyal teknolojisi</td><td>2366s</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td>A600277</tr><tr><td>İzopropil beta-D-tiyokalaktopiranosit</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600118</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His-Bind Süper Akış</td><td>Qiagen</td><td>70691</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız süt tozu</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>OPM-293 hücre kültürü ortamı</td><td>Opm biosciences</td><td>81075-001</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 RBD-ST plazmid</td><td>Wuhan gen kreatifi biyolojik teknoloji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tampon salin</td><td>ZSGB-bio</td><td>ZLI-9061</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin Doğrusal</td><td>Polibilimler</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Önceden boyanmış protein merdiveni</td><td>Thermo</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>pThioHisA ClyA-SC plazmid</td><td>Wuhan genecreat biyolojik teknoloji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF Batı Blotting Membranları</td><td>Roche</td><td></td><td></td>03010040001</tr><tr><td>Quixstand tezgah üstü sistemler (100 kD içi boş fiber kolon)</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE yükleme tamponu (5x)</td><td>Beyotime</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Supersignal west pico PLUS (gelişmiş kemilüminesans çözeltisi)</td><td>Thermo</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Süspansiyon aleti</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>Hula Mikser</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyon Elektron Mikroskobu</td><td>Hitachi</td><td>HT7800</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Oksoit</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman coulter</td><td>XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviyole spektrofotometre</td><td>Hitachi</td><td>U-3900</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610961</td><td></td></tr></tbody></table>

sars-cov-2 reseptör bağlama etki alanını gösteren dış membran veziküllerine dayalı bir "tak ve görüntüle" nanopartikül aşı platformu

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

Bakteri veya virüslerden elde edilen biyomimetik nanopartiküller, aşı araştırma ve geliştirmede büyük ilgi görmüştür. Dış zar vezikülleri (OMV'ler) esas olarak ortalama büyüme sırasında gram-negatif bakteriler tarafından salgılanır, nano boyutlu bir çap ve kendi kendine adjuvan aktivite ile aşı dağıtımı için ideal olabilir. OMV'ler proteinler, nükleik asitler ve küçük moleküller için çok yönlü bir dağıtım sistemi olarak işlev görmüştür. OMV'lerin biyolojik özelliklerinden tam olarak yararlanmak için, biyomühendislik ürünü Escherichia coli türevi OMV'ler bir taşıyıcı olarak ve SARS-CoV-2 reseptör bağlama alanı (RBD) bir "Tak ve Görüntüle" aşı platformu oluşturmak için bir antijen olarak kullanılmıştır. Streptococcus pyogenes'teki SpyCatcher (SC) ve SpyTag (ST) alanları, OMV'leri ve RBD'yi konjuge etmek için uygulandı. Sitolisin A (ClyA) geni, plazmid transfeksiyonundan sonra SC geni ile bir füzyon proteini olarak çevrildi ve OMV'lerin yüzeyinde reaktif bir bölge bıraktı. RBD-ST'yi gece boyunca geleneksel bir tampon sisteminde karıştırdıktan sonra, OMV'ler ve RBD arasında kovalent bağlanma oluştu. Böylece çok değerli gösteren bir OMV aşısı elde edildi. OMV'lerin aşı platformu, çeşitli antijenlerle değiştirilerek, çeşitli heterojenleri verimli bir şekilde görüntüleyebilir ve böylece bulaşıcı hastalık salgınlarını potansiyel olarak hızlı bir şekilde önleyebilir. Bu protokol, üretim, saflaştırma, biyokonjugasyon ve karakterizasyon dahil olmak üzere OMV aşı platformunu oluşturmak için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Bu protokolün akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokol, OMV'leri bir aşı platformu olarak kullanmaya yönelik genel bir yaklaşım olabilir; sadece antijenlerin tipine göre uygun ekspresyon sistemlerini seçmek gerekir.
Şekil 2, uygulanabilir bir plazmid tasarım şeması sağlar. SC geni, esnek bir bağlayıcı aracılığıyla ClyA genine bağlanırken, ST, saflaştırma ve doğrulama için RBD geninin 5' terminaline bir His-tag geni ile bağla...

Mevcut protokol, dış zar veziküllerinin biyomühendisliğini, üretim, saflaştırma, biyokonjugasyon ve karakterizasyon dahil olmak üzere bir "Tak ve Göster" aşı platformu olarak tanımlamaktadır.

SARS-CoV-2 Reseptör Bağlama Etki Alanını Gösteren Dış Membran Veziküllerine Dayalı Bir "Tak ve Görüntüle" Nanopartikül Aşı Platformu

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

Nanobilim, antijenleri yüzeyinde gösterdikten sonra antijene özgü bağışıklık tepkisini etkili bir şekilde artırabilir Bu aşı platformundaki ana avantaj, plak ve gösterimden çıkmayı başarabilir. Başka bir deyişle, platform antijenlerin çeşitliliğini görüntüleyebilir Bu yöntem, motoru nano boyutlu taşıyıcılara göstermek için diğer biyolojik nanopartiküllere de uygulanabilir. Sitolisin A casus kateter transformasyonunu gerçekleştirmek için, 50 mikrolitre BL 21 yetkin suşuna beş mikrolitre plazma çözeltisi ekleyerek başlayın.Yavaşça üfleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde soğumaya bırakın. Çözeltiyi 90 saniye boyunca su banyosuna 42 santigrat derecede yerleştirin ve ardından karıştırılmış çözeltiyi hemen üç dakika boyunca buz üzerine koyun. Bakteriyel süspansiyona 500 mikrolitre luria bertani besiyeri ekleyin ve kültürü karıştırdıktan sonra bir saat boyunca 37 santigrat derecede dakikada 220 rotasyonda karıştırın.Daha sonra, ampisilin ve kültür içeren tüm dönüşüm luria bertani agar plakasını 37 santigrat derecede bir gecede plakalayın. OMV casus yakalayıcı üretimi için, tek bir koloninin plakadan 20 mililitre luria bertani ortamına ve kültürüne 37 santigrat derecede dakikada 220 rotasyonda gece boyunca izole edilmesiyle başlayın. Bakteriyel çözeltiyi iki litrelik bir ortama ve logaritmik büyüme aşamasına ulaşana kadar beş saat boyunca 37 santigrat derecede dakikada 220 rotasyonda kültüre inkübe edin.Bakteriyel çözeltinin son konsantrasyonunu 0.5 milimolar yapmak için izopropil beta D-IPTG ekleyin ve daha sonra 25 santigrat derecede dakikada 220 rotasyonda gece boyunca kültürleyin. Ardından, OMV casus avcısı saflaştırması gerçekleştirin. Bakteriyel çözeltiyi kaynaştıran centri ile başlayın.Süpernatantı 0,22 mikrometrelik bir membran filtreyle filtreleyin, ardından içi boş bir fiber sütun kullanarak konsantre edin. Konsantreyi 0,22 mikrometrelik bir membran filtreden süzün, ardından ultra centri sigorta kullanarak iki saat boyunca dört santigrat derecede 150.000 kez G'de kaynaştırın ve süpernatantı bir pipetle atın. Yağışı PBS ile tekrar askıya alın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.RBD casus transfeksiyonunu gerçekleştirmek için, uygun bir ökaryotik ekspresyon sistemi seçerek başlayın ve hücreleri iyileşmeden sonra 37 santigrat derecede dakikada 130 rotasyonda bir gecede kültürleyin. Otomatik hücre sayacına 20 mikrolitre HEK 293F hücre çözeltisi ekleyin. Hücre sayısını kaydedin, konsantrasyonu mililitre başına altı hücreye bir kez 10 olarak ayarlayın.Ve sonra hücreleri dört saat boyunca 37 santigrat derecede dakikada 130 rotasyonda kültürleyin. RBD casus etiketi plazmidini 0.22 mikrometrelik bir membran filtreden filtreleyin ve son hacim 10 mililitre olana kadar hücre kültürü ortamına 300 mikrogram plazmid ekleyin. 10 saniye çalkalayın.PEI'yi su banyosunda 65 santigrat dereceye ısıtın. 0.7 mililitre PEI'yi 9.3 mililitre hücre kültürü ortamı ile karıştırın ve 10 saniye boyunca aralıklı olarak çalkalayın. PEI çözeltisine plazmid çözeltisi ekleyin.Karışımı aralıklı olarak 10 saniye çalkalayın ve 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Karışımı 280 mililitre hücre kültürü ortamına ekleyin ve beş gün boyunca 37 santigrat derecede dakikada 130 rotasyonda kültürleyin. Ardından, RBD casus etiketi saflaştırma işlemini gerçekleştirin.Hücreleri 20 dakika boyunca 25 santigrat derecede 6.000 kez G'de kaynaştırarak merkezle başlayın ve süpernatanı toplamak için bir pipet kullanın. Kolonu iki mililitre nikel NTA agarozu ile doldurun ve PBS ile üç kez yıkayın. 20 milimolar'ın son konsantrasyonunu yapmak için hücre süpernatantına imidazol ekleyin ve hücre süpernatantını yükleyin.Yıkama için 20 milimolar imidazol içeren üç sütun PBS hacmi ekleyin ve yıkama fraksiyonunu toplayın. Düşük ila yüksek konsantrasyonlarda imidazol içeren üç sütun PBS hacmi ile gradyan elütu, her konsantrasyon için iki kez elüter. BCA yöntemiyle protein konsantrasyonunu belirlemek için, standart BSA protein çözeltisini mililitre başına iki ila 0.0625 miligram arasında seri olarak seyreltin, saflaştırılmış OMV casus yakalayıcısını ve RBD casus etiketini 10 kez seyreltin.Daha sonra BCA çalışma çözeltileri A ve B'yi 50'ye bir oranında karıştırın. Seyreltilmiş protein çözeltisi ekleyin ve BCA çalışma çözeltisi ile karıştırın. 30 dakika boyunca 37 derecede inkübe edin.Her bir kuyucuğun 562 nanometresinde absorbansı ölçün ve standart eğriden protein konsantrasyonunu hesaplayın. OMV casus yakalayıcı ve RBD casus etiketinin biyokonjugasyonunu gerçekleştirmek için, OMV casus yakalayıcı ve RBD casus etiketi ve PBS'yi 40 ila bir oranında karıştırın. Karışımı gece boyunca dört santigrat derecede dakikada 15 dönüşte karıştırmak için dikey olarak döndürün.OMV casus avcısı saflaştırmasına benzer bir prosedür kullanarak PBS çözeltisini kullanarak OMV RBD'nin saflaştırılmasını gerçekleştirin. Plazma tasarım şeması, casusluk geninin esnek bağlayıcı aracılığıyla cly A genine bağlandığını, casus ise saflaştırma ve doğrulama için bir hys etiketi geni ile RBD geninin beş ana terminaline bağlandığını göstermektedir. Ultrasantrifüjlemeden sonra, reaksiyona girmemiş RBD casusluğunun neredeyse tamamı süpernatant içinde kaldı.İkinci ultrasantrifüjleme, ilk kez daha önemli bir avantaj sağlamadı. OMV casus yakalayıcısının z ortalama hidrodinamik çapı 133 nanometre iken, OMV-RBD için 152.6 nanometre idi. Bu farklılıklar, RBD'nin yoğun görüntülemeden sonra OMV partikül boyutunu arttırmasından kaynaklanıyor olabilir.TEM sonuçları, DLS sonuçlarından elde edilen partikül boyutu dağılımı ile tutarlıdır. Karışımın harmanlanması için rotasyon çok önemlidir. Reaksiyonun verimliliği dönmeden çok daha düşük olabilir.

a-plug-display-nanoparticle-vaccine-platform-based-on-outer-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokol, SARS karşı rekombinant reseptör-bağlayıcı etki alanı (RBD) tabanlı altbirim aşılar eğitim için genel bir yordam açıklanır. RBD 293T hücrelerinin protein, RBD ve fare sera kurulmuş bir SARS pseudovirus nötralizasyon tayini ile nötralizasyonu aktivitesi tespit ile farelerin bağışıklık transfeksiyon ve anlatım yöntemleri içerir.

Rekombinant RBD tabanlı SARS Aşılar için Protokol: Protein hazırlanması, Hayvan Aşılama ve Nötralizasyon Algılama

Bu videoda, çok değerlikli dış zar vezikülü (OMV) aşıları oluşturmak için bir yöntem gösterilmektedir. Memeli hücreleri, bir SpyTag ve bir polihistidin etiketine kaynaşmış viral antijenleri eksprese etmek ve salgılamak için transfekte edilir. Bu antijenler daha sonra bir nikel-nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) afinite sütunu kullanılarak saflaştırılır. Saflaştırılmış antijen, yüzeye bağlı SpyCatcher (SC) proteinini eksprese eden dış zar vezikülleri ile karıştırılır. Çoklu antijenler,...

Çok Değerlikli Gösteren Bir Dış Membran Vezikül Aşısı Oluşturulması

Biz-si mühendislik hepatit E virüs kapsid protein theranostic nanopartikül (HEVNP). HEVNP icosahedral istikrarlı Mukozal teslim kafese kendi kendine monte edilerek üretilir. Burada, HEVNPs değiştirilmesi yüzey Günese maruz kalan kalıntıları özellikle tümör hücreleri bağlamak sentetik ligandlar çekimlerine katıldı diziyi değiştirerek hedefleme tümör için açıklamak.

Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

Burada, pseudotyped parçacıklar spike protein yüksek patojenik virüs Ortadoğu solunum sendromu ve şiddetli akut solunum Sendromu coronaviruses birleştiren bir BSL-2 ayar oluşturmak için bir protokol mevcut. Pseudotyped bu parçacıklar hedef ana bilgisayar hücreler virüs girdiği miktar izin luciferase muhabir gen içerir.

Bir biyogüvenlik seviye 2 ortamda yüksek patojenik Coronaviruses çalışmaya Pseudotyped parçacıklar imalatı

Aşı geliştirmede kullanılmak üzere kendi kendine biraraya gelen protein nano taneciklerinin (SAPN' ler) saflaştırılmasını, yeniden katlanması ve karakterizasyonu nun tanımlanmasını açıklayan ayrıntılı bir yöntem burada verilmiştir.

Trimerik Epitop Sunumu Gerektiren Aşılar için E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nano tanecikleri Üretimi

Burada, antijen gösteren virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler) üzerindeki nötralizasyon epitoplarını tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) türevli VLP'lerin immün özürlülüğü, protein G-konjuge manyetik boncuklarla birleştirilmiş zarf glikoproteinlere özgü monoklonal antikorlar kullanılarak gerçekleştirilir. Yakalanan VLP'ler daha sonra viral çekirdek protein Gag spesifik antikorlar kullanan SDS-PAGE ve Batı blot analizine tabi tutulur.

Virüs Benzeri Parçacık (VLP) Tabanlı Aşılarda Bir Yakalama Tahlili Kullanılarak Görüntülenen Antijenlerde Nötralizasyona Duyarlı Epitopların Tespiti

Bu protokolde, rekombinant SARS-CoV-2 spike'a konjuge edilen kuantum noktaları, hücre bazlı testlerin, plazma zarındaki hACE2'ye ve ardından bağlı proteinlerin sitoplazmaya endositozunu izlemek için hücre bazlı tahlilleri izlemesini sağlar.

HEK293T Hücrelerinde Bağlanma ve Endositozu İzlemek için Kuantum Nokta Konjuge SARS-CoV-2 Spike Trimerlerinin Yüksek Verimli Konfokal Görüntülemesi

Mevcut protokol, HA, S glikoproteini, ilgili hibrid tip glikanlar ve yüksek mannoz oligosakkaritlerine CV-N bağlanmasını incelemek için SPR bağlanma testleri için yeni araçları açıklamaktadır. SPR, bu glikanlara dimerik veya monomerik CV-N'yi bağlamak için KD'yi belirlemek için kullanılır.

Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral Ajanların Mühendisliği

Burada, anjiyotensin dönüştürücü enzim-2'ye bağlı manyetik mikroküreler tarafından yakalanan sağlam şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) viral partikülleri üzerinde iki benzersiz spike protein epitopunu aynı anda tespit etmek için çift raportörlü bir akış sitometrik sistemi kullanan yeni geliştirilmiş bir multipleks floresan immünolojik testi açıklıyoruz.

Viral Partiküller Üzerindeki Yüzey Protein Epitoplarının Multipleks Çift Raportör Stratejisi ile Profillenmesi

Gerçek virüsü yakından taklit eden SARS-CoV-2 virüsü benzeri parçacıklar üretmek için optimize edilmiş bir in vitro protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, bir biyogüvenlik seviye 3 laboratuvarı gerektirme kısıtlamaları olmadan viral enfeksiyon, montaj ve çıkış mekanizmalarının araştırılmasını sağlar.

Viral Yaşam Döngülerini In Vitro Araştırmak için SARS-CoV-2 Virüsü Benzeri Bir Parçacık Sisteminin Üretimi

Bu makale, luciferaz raporlayıcı sistemi kullanarak SARS-CoV-2 sahtetipli parçacıkların üretilmesi metodolojisini ve giriş inhibitörlerini tanımlamada kullanımını açıklamaktadır. Bu protokoller, rekombinant insan ACE2-Fc füzyon proteini ve küçük moleküllü bileşik arbidol olmak üzere iki farklı giriş inhibitörü kullanılarak gösterilmiştir.

MLV tabanlı psödovirüsler kullanılarak SARS-CoV-2 giriş inhibitörlerinin potansiyel antiviral olarak tanımlanması için prosedürler

Öğrenin dış membran veziküllerini biyomühendislik ve aşı geliştirme için nasıl kullanılır. Bu yöntem çoklu antijen sunumuyla bağışıklık yanıtını güçlendirir.

SARS-CoV-2 Reseptör Bağlama Etki Alanını Gösteren Dış Membran Veziküllerine Dayalı Bir Tak ve Görüntüle Nanopartikül Aşı Platformu (Video) | JoVE Journal

SARS-CoV-2 Reseptör Bağlama Etki Alanını Gösteren Dış Membran Veziküllerine Dayalı Bir "Tak ve Görüntüle" Nanopartikül Aşı Platformu

Daha fazla video keşfet