Name: Lineer DNA Şablonlarını Kullanarak Ekzonükleaz Eksikliği Olan Hücresel Ekstraktlardan Hücresiz Protein Sentezi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Keşfedin, E. coli BL21 Rosetta2 ekzonükleaz V eksik hücre ekstrelerinden lineer DNA şablonlarıyla hücresiz protein sentezi yöntemini. Klonlama gereksinimini ortadan kaldırarak hızlı prototipleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ACB ve JLF, ANR SINAPUV hibesi (ANR-17-CE07-0046) tarafından sağlanan finansman desteğini kabul eder. JLF ve JB, ANR SynBioDiag hibesi (ANR-18-CE33-0015) tarafından sağlanan finansman desteğini kabul eder. MSA ve JLF, ANR iCFree hibesi (ANR-20-BiopNSE) tarafından sağlanan finansman desteğini kabul eder. JB, ERC'nin "COMPUCELL" (hibe numarası 657579) başlatan desteğini kabul ediyor. Centre de Biochimie Structurale, Fransız Entegre Yapısal Biyoloji Altyapısı'nın (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01) desteğini kabul etmektedir. MK, INRAe'nin MICA bölümü, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) bölgesinin DIM-RFSI ve ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003) fon desteğini kabul etmektedir. Bu çalışma, Avrupa Araştırma Konseyi Konsolidatör Ödülü (CLB'ye 865973) aracılığıyla finanse edilerek desteklenmiştir.

<ol><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).</li>
<li>McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+use+of+linear+DNA+in+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effective use of linear DNA in cell-free expression systems.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328(2021).</li>
<li>Schinn, S. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+directly+from+PCR%3A+progress+and+applications+of+cell-free+protein+synthesis+with+linear+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA.</a> New Biotechnology. 33 (4), 8(2016).</li>
<li>Prell, A., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+linear+and+circular+DNA+with+gaps+by+the+recBC+enzyme+of+Escherichia+coli.+Effects+of+gap+length+and+the+presence+of+cell-free+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts.</a> European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).</li>
<li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li>
<li>Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+containing+%CF%87+sites+enhances+DNA+stability+and+gene+expression+in+E.+coli+cell-free+transcription-translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).</li>
<li>Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+linear+DNA+templates+in+cell-free+expression+systems+from+diverse+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).</li>
<li>Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+protection+of+linear+DNA+in+cell-free+extracts+from+Escherichia+coli+and+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).</li>
<li>Zhu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell-free+gene+expression+yields+from+linear+templates+in+Escherichia+coli+and+Vibrio+natriegens+extracts+by+using+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).</li>
<li>Batista, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+optimized+cell-free+buffer+enables+robust+expression+from+unprotected+linear+DNA+in+exonuclease-deficient+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).</li>
<li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%3A+protocols+for+a+robust%2C+flexible%2C+and+accessible+platform+technology%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> JoVE. (144), e58882(2019).</li>
<li>Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), 8663(2015).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+reduce+variability+in+E.+Coli-based+cell-free+protein+expression+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li>
<li>Cole, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+interlaboratory+cell-free+protein+synthesis+variability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).</li>
</ol>

Burada, E. coli BL21 Rosetta2'den hazırlanan hücre lizatının, recB veya recBCD operon için genomik nakavt ile doğrusal DNA şablonlarından yüksek protein ekspresyonunu desteklediğini gösteriyoruz. Bu protokol, lineer DNA şablonlarına özgü adım adım lizat kalibrasyon prosedürünü detaylandırır (Şekil 2), bu da lineer DNA'daki σ70 promotörlerinden yüksek ekspresyona yol açan ve equimolar DNA konsantrasyonları için plazmid seviyelerine ulaşan kritik bir adımdır. Bu prot...

Hücresiz protein sentezi (CFPS) sistemleri, biyosensör mühendisliği, merkezi olmayan üretim ve genetik devrelerin prototiplenmesi için hızlı, basit ve verimli bir yöntem olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır1. CFPS sistemleri büyük potansiyelleri nedeniyle sentetik biyoloji alanında düzenli olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, şimdiye kadar CFPS sistemleri, teknolojinin tam potansiyeline ulaşmasını sınırlayabilen dairesel plazmidlere dayanmaktadır. Plazmid DNA'sının hazırlanması, klonlama sırasında birçok zaman alıcı adıma ve büyük miktarda DNA izolasyonuna bağlıdır. Öte yandan, bir plazmidden veya sentezlenmiş bir DNA şablonundan PCR amplifikasyonu, CFPS şablonlarını birkaç saat içinde hazırlamak için kullanılabilir 2,3. Bu nedenle, lineer DNA uygulaması CFPS için umut verici bir çözüm sunmaktadır. Bununla birlikte, lineer DNA, hücresel ekstraktlarda doğal olarak bulunan ekzonükleazlar tarafından hızla parçalanır4. λ-faj GamS proteini5'i veya Chi bölgeleri6'yı içeren DNA'yı koruyucu ajanlar olarak kullanmak veya uçlarının kimyasal modifikasyonu ile doğrusal DNA'yı doğrudan korumak gibi bu sorunu ele alan çözümler vardır 2,7,8,9. Tüm bu yöntemler, pahalı ve zaman alıcı olan hücre ekstraktına takviyeler gerektirir. Ekzonükleaz V kompleksinin (RecBCD) hücre lizatlarındaki lineer DNA'yı bozduğu uzun zamandır bilinmektedir4. Son zamanlarda, lineer DNA'nın, ekzonükleaz genleri (recBCD)10 için nakavt edilen hücrelerden lizatlarda çok daha iyi korunabileceğini gösterdik.
Bu protokolde, E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD suşundan sonikasyon lizisi ile hücresiz lizatların hazırlanması için adımlar ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Sonication lizis birkaç laboratuar tarafından kullanılan yaygın ve uygun fiyatlı bir tekniktir11,12. Bu suştan üretilen ekstraktlar, lineer DNA kalıplarından gelen ifadeyi desteklemek için herhangi bir ekstra bileşenin veya DNA kalıbı modifikasyonunun eklenmesine ihtiyaç duymaz. Yöntem, özellikle yerli E. coli promotörlerinden doğrusal DNA ekspresyonu için hücre ekstraktları için tampon optimizasyonunun temel adımına dayanır. Lineer DNA ekspresyonu için bu spesifik tampon optimizasyonunun, yerel σ70 promotörlerinin GamS proteini veya Chi DNA takviyesi olmadan yüksek protein üretimi sağlaması için anahtar olduğu, hatta PCR ürünlerinin saflaştırılmasından kaçındığı gösterilmiştir10. Lineer DNA ekspresyonu için optimal Mg-glu konsantrasyonunun, plazmid DNA'sına benzer olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, optimal K-glu konsantrasyonu, muhtemelen transkripsiyonla ilgili bir mekanizma10'dan dolayı doğrusal ve plazmid DNA'sı arasında önemli bir fark göstermiştir. Bu yöntem kullanılarak ifade edilen proteinlerin işlevselliği, ayak parmağı anahtarlarının hızlı bir şekilde taranması ve enzim varyantlarının aktivite değerlendirmesi10 gibi çeşitli uygulamalar için gösterilmiştir.
Bu protokol, sadece mutant ΔrecBCD hücre ekstraktlarını ve lineer DNA için spesifik kalibrasyonu şablon olarak kullanarak E. coli hücresiz sistemlerde lineer DNA şablonlarını kullanmak için basit, verimli ve uygun maliyetli bir çözüm sunar.

<table><tbody><tr><td>2-YT Et Suyu</td><td>Invitrogen</td><td>22712020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Güvenli Kilitli tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1,5 mL mikrotüp</td></tr><tr><td>384 kuyulu kare tabanlı mikroplaka</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>3PGA (D- (-) -3-Fosfogliserik asit disodyum)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>yapışkan plaka contası</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td></td><td></td>232701</tr><tr><td>Agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidrat)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2</td><td>Merck Millipore</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 & Delta; recB</td><td>Addgene</td><td>176582</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 ve Delta; recBCD</td><td>Addgene</td><td>176583</td><td></td></tr><tr><td>cAMP (Adenozin 3' 5'-siklik monofosfat)</td> <td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>CoA (Koenzim A hidrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15 mL PP Santrifüj Tüpleri, CentriStar Kapaklı Raf Paketli, Steril</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>15 mL tüp</td></tr><tr><td>Corning 50 mL PP Santrifüj Tüpleri, CentriStar Kapaklı Konik Taban, Steril</td><td>Corning</td><td></td><td>430828 50 mL tüp</td></tr><tr><td>CTP (Sitidin 5'-trifosfat, disodyum tuzu hidrat)</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp; J62238</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Ditiyotreitol)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Folinik asit (katı folinik asit kalsiyum tuzu)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanozin 5?-Trifosfat,&nbsp; Disodyum Tuzu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>371701</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; H3375</td><td></td></tr><tr><td>K fosfat dibazik (K2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>231-834-5</td><td></td></tr><tr><td>K fosfat monobazik (H2KO4P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamat</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17232</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Şırınga Filtre Ünitesi, 0.22 & m, polietersülfon</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>membran filtresi 0.22 &mikro; m</td></tr><tr><td>Monarch PCR & DNA Temizleme Kiti</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td>PCR & DNA temizleme Kiti</td></tr><tr><td>Monarch Plazmid Miniprep Kiti</td><td>NEB</td><td>T1010S</td><td>Plazmid Miniprep Kiti</td></tr><tr><td>NAD (B-nikotinamid adenin dinükleotid hidrat)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NIST-izlenebilir FITC standardı</td><td>Invitrogen</td><td>F36915</td><td>NIST-FITC</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi kiti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740414.1</td><td>Plazmid Maxiprep Kiti</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>plaka okuyucu</td><td>Biotek ve nbsp;</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Rekombinant EGFP Protein</td><td>Kromotek</td><td>egfp-250</td><td>rekombinant eGFP</td></tr><tr><td>Q5 Yüksek Sadakatli 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>DNA polimeraz</td></tr><tr><td>Q5 Yüksek Sadakatli 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492L</td><td>DNA polimeraz</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Test Kiti</td><td>DNA</td> bağlayıcı boya ile Thermo <td>Q32850</td><td>florometrik test</td></tr><tr><td>RTS Amino Asit Örnekleyici</td><td>biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Steril su</td><td></td><td></td><td>Millipore RiOs 8 sisteminden arıtılmış su, otoklavlama ile sterilize edilmiştir.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Yaşam Bilimleri ürünleri Cytiva</td><td>17-1321-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche 10109550001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik işlemci Vibra hücresi VC-505</td><td>SONICS</td><td>VC505</td><td>sonikatör</td></tr><tr><td>UTP Na3 (Üridin 5'- trifosfat, trisodyum tuzu hidrat)</td> <td>Acros Organics&nbsp;</td><td></td><td></td>226310010</tr><tr><td>Su, nükleaz içermeyen</td><td>Thermo</td><td>R0581</td><td>nükleaz içermeyen su</td></tr></tbody></table>

lineer dna Şablonlarını kullanarak ekzonükleaz eksikliği olan hücresel ekstraktlardan hücresiz protein sentezi

Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates

Hücresiz protein sentezi (CFPS), sayısız avantajı nedeniyle sentetik biyoloji alanında son zamanlarda çok popüler hale gelmiştir. CFPS için lineer DNA şablonlarının kullanılması, klonlama, transformasyon ve plazmid ekstraksiyonu adımlarını ortadan kaldırarak deneysel süreyi azaltarak teknolojinin tam potansiyeline ulaşmasını sağlayacaktır. Lineer DNA, şablonun yüksek konsantrasyonlarını elde etmek için PCR ile hızlı ve kolay bir şekilde çoğaltılabilir, böylece potansiyel in vivo ekspresyon toksisitesi önlenir. Bununla birlikte, lineer DNA kalıpları hücre ekstraktlarında doğal olarak bulunan ekzonükleazlar tarafından hızla parçalanır. Bu problemin üstesinden gelmek için, nükleaz inhibitörlerinin eklenmesi veya korunma için lineer DNA uçlarının kimyasal modifikasyonu gibi önerilen birkaç strateji vardır. Tüm bu stratejiler ekstra zamana ve kaynaklara mal olur ve henüz plazmid protein ekspresyonu seviyelerini elde edememiştir. CFPS için lineer DNA kalıplarını kullanmak için alternatif bir strateji için ayrıntılı bir protokol burada sunulmuştur. Ekzonükleaz eksikliği olan nakavt hücrelerinden hücre ekstraktlarını kullanarak, lineer DNA şablonları herhangi bir son modifikasyon gerektirmeden bozulmadan kalır. Özellikle lineer DNA için Mg-glutamat (Mg-glu) ve K-glutamat (K-glu) için sonikasyon lizisi ve tampon kalibrasyonu ile Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD suşundan hücre lizatının hazırlık adımlarını sunuyoruz. Bu yöntem, E. coli CFPS'deki plazmid DNA'sından elde edilenle karşılaştırılabilir protein ekspresyon seviyelerine ulaşabilir.

Lineer ve plazmid DNA için ayrı ayrı optimal Mg-glutamat ve K-glutamat seviyeleri için lizatın kalibrasyonundan sonra temsili sonuçlar burada gösterilmiştir (Şekil 1). Mg-glutamat optimal konsantrasyonu, 8 mM'de Δ recB ve ΔrecBCD ekstraktları arasında benzerdir (Şekil 1B). Bununla birlikte, plazmid DNA'sı için optimal K-glutamat konsantrasyonu 140 mM'dir, oysa aynı ekstrakt için lineer DNA için optimal K-glutamat konsantrasyonu 20 mM'dir (<stro...

Burada sunulan, Escherichia coli BL21 Rosetta2'nin (ΔrecBCD ve ΔrecB) ekzonükleaz V nakavt suşlarından hücre ekstraktlarının hazırlanması ve tampon kalibrasyonu için bir protokoldür. Bu, lineer DNA şablonlarını kullanarak hücresiz protein sentez sistemlerinde ekspresyon için hızlı, kolay ve doğrudan bir yaklaşımdır.

Lineer DNA Şablonlarını Kullanarak Ekzonükleaz Eksikliği Olan Hücresel Ekstraktlardan Hücresiz Protein Sentezi

Cell-free protein synthesis (CFPS) has recently become very popular in the field of synthetic biology due to its numerous advantages. Using linear DNA ...

Protokol çok önemlidir, çünkü hücresiz protein sentez sistemlerinde, hatta yerel E.coli parametrelerinden bile doğrusal DNA şablonlarının hızlı, kolay ve doğrudan kullanılmasını sağlar. Başlıca avantajları, klonlamadan, lineer DNA uçlarının kimyasal modifikasyonlarından ve gama veya chi DNA gibi koruyucu takviyelerden kaçınarak tasarruf edilen zaman miktarıdır. İlgilenilen farklı organizmalar için kendi kendini bildiren sentez ekstraktları geliştirildiğinden, yöntemimiz doğrusal DNA kullanarak bu ekstraktlarda prototiplemeyi hızlandırmanın bir yolunu sunar.Başlamak için, BL21 Rosetta-2 delta recBCD'yi eksi 80 santigrat derece gliserol stoğundan, mililitre kloramfenikol başına 10 mikrogram içeren ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe eden 2x YTP agar plakasına streak suşu yerleştirin. Daha sonra, agar plakasından tek bir koloniyi, mililitre kloramfenikol başına 10 mikrogram ile desteklenmiş 40 mililitreden biraz daha fazla 2x YTP'ye aşılayın ve gece boyunca 200 RPM sallama ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, gece kültürünü 100 kez, mililitre kloramfenikol başına 10 mikrogram içeren dört litre taze 2x YTP ortamına seyrelterek bir alt kültür yapın.Ortamın dört litresini dört ayrı şişeye bölün. 1.5 ila 2.0 optik yoğunluğa ulaşmak için yaklaşık üç ila dört saatlik bir büyüme için 37 santigrat derece, 200 RPM'de inkübe edin. Kültürü buza koyun, hücreleri dört santigrat derecede 12 dakika boyunca 5.000 G'de döndürün ve ardından dekantı boşaltarak atın.Ardından, hücre peletlerini DTT ile 800 mililitre soğutulmuş S30A'da yeniden askıya alın. Yine, hücreleri daha önce gösterildiği gibi dört santigrat derecede 12 dakika boyunca 5.000 G'de döndürün ve süpernatantı dekantasyonla atın. DTT ile 160 mililitre soğutulmuş S30A'da hücre peletlerini yeniden askıya aldıktan sonra, hücreleri soğutulmuş ve önceden tartılmış 50 mililitrelik tüplere aktarın.Hücreleri 2000 G'de dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca döndürün ve daha sonra dekantı boşaltarak atın. Yine, hücreleri 2000 G'de dört dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün ve ardından bir pipet kullanarak kalan süpernatantı dikkatlice çıkarın. Ardından, hücre peletinin ağırlığını hesaplamak ve hücre peletlerini eksi 80 santigrat derecede tutmak için tüpün ağırlığını yeniden ölçün.Hücre peletlerini eksi 80 santigrat dereceden aldıktan sonra, bir ila iki saat boyunca buz üzerinde çözün ve hücre peletlerini, hücre peletinin ağırlığının gramı başına DTT tamponu ile 0.9 mililitre S30A'da yeniden askıya alın. Daha sonra, hücreleri yeniden askıya almak için yavaşça pipetleyin, mümkün olduğunca üst köpükten kaçının. Yeniden askıya alınan hücrelerin bir mililitrelik alikotlarını 1.5 mililitrelik mikrotüplere yerleştirin ve bunları dört santigrat derecede buz veya önceden soğutulmuş soğuk bir blok üzerinde tutun.Daha sonra, üç döngü için% 20 genlik kurulumuna sahip bir sonikatördeki her tüpü sonikleştirin ve lizatı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 G'de döndürün. Süpernatantı bir pipetle topladıktan sonra, 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücre lizatını 80 dakika boyunca 200 RPM ajitasyonda 37 santigrat derecede inkübe edin.Lisatı aşağı doğru döndürdükten ve süpernatantı önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik mikrotüplerde topladıktan sonra, tüm tüpleri buz üzerinde tutarken, önceden soğutulmuş PCR 8 şeritli tüplerde aliquot 30 mikrolitre. Flash, lizat alikotlarını kuru buz üzerinde dondurur ve eksi 80 santigrat derecede saklar. Makalede açıklandığı gibi tampon hazırlama sekmesine göre bir ana karışım hazırlayın.10.5 mikrolitrelik bir reaksiyon hacmi için, 1.05 mikrolitre farklı Mg-glutamat stok konsantrasyonları ve 9.45 mikrolitre ana karışım ekleyin ve yavaşça karıştırın. Yukarıdaki reaksiyonların 10 mikrolitresini pipet, 384 delikli kare tabanlı bir mikro plakaya dönüştürür ve yapışkan bir plaka contası kullanarak örtün. Floresan verilerini, dakikada 307 döngüde sürekli yörüngesel sarsıntı ile 30 santigrat derecede sekiz saatlik inkübasyon için düzenli aralıklarla bir plaka okuyucu ile kaydederek floresan çıkışı olarak gen ekspresyonunu ölçün.Son noktada en yüksek floresan değeri ile sonuçlanan Mg-glutamat konsantrasyonunu belirledikten sonra, K-glutamat kalibrasyonuna geçin. Deneyi çalıştırın ve test edilen K-glutamat konsantrasyonları arasından en yüksek floresan değerini tanımlayın, böylece bu lizat için Mg-glutamat ve K-glutamat için en uygun tampon bileşimini tanımlayın. Mg-glutamat ve K-glutamat değerleri belirlendikten sonra, elde edilen parti hacmine göre optimize edilmiş tampon bileşiminin stok tüplerini hazırlayın.Gerekli tampon tüplerinin sayısını hesapladıktan sonra, tüp başına 38 mikrolitre aliquot ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. İlk olarak, optimum ana karışım hazırlığı için 1,5 mililitrelik bir mikrotüpü etiketleyin. Tamponun ve lizatın doğru hacimlerini ekleyin ve nazikçe karıştırın.Daha sonra, önce DNA örneklerini pipetleyin, ardından nükleaz içermeyen su ve son olarak en uygun ana karışım. Hücre içermeyen reaksiyonu, plaka okuyucuya eklemeden hemen önce bir pipetle nazikçe karıştırın ve kabarcıklardan kaçının. Plaka okuyucudaki reaksiyonları ayarladıktan sonra, kinetik çalışmalar, dakikada 307 döngüde sürekli yörüngesel sarsıntı ile 30 santigrat derecede sekiz saatlik inkübasyon için düzenli aralıklarla floresan verilerini kaydetti.Lisatın kalibrasyonundan sonra, Mg-glutamat optimal konsantrasyonu, hem doğrusal hem de plazmid DNA'sı için ekstraktlar arasında sekiz milimolar'da benzerdi. Bununla birlikte, plazmid DNA için optimal K-glutamat konsantrasyonu 140 milimolar, lineer DNA için optimal K-glutamat konsantrasyonu ise 20 milimolar'dır. Kalibrasyon adımlarından sonra, GFP ekspresyon seviyeleri, vahşi tip, delta recB ve delta recBCD ekstraktlarındaki lineer ve plazmid DNA'ları arasında karşılaştırıldı.Lineer DNA'dan GFP ekspresyonu, delta recB ve delta recBCD suşlarından elde edilen ekstraktlarda plazmid DNA'sından ekspresyonun sırasıyla% 102 ve% 138'ine ulaştı. Protokoldeki en önemli şeyler, hücrenin sonikasyon lizisidir ve tampon kalibrasyon adımları, özellikle doğal parametreleri kullanırken, doğrusal ve plazmid DNA için ayrı ayrıdır. Bu teknik, biyolojik tasarımların hücresiz sistemlerde, örneğin biyosensörlerin, enzimlerin ve yolakların taranması veya sentetik genetik devrelerin prototiplenmesinin hızlandırılmasına yardımcı olacaktır.

cell-free-protein-synthesis-from-exonuclease-deficient-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Doğmakta olan peptidil-tRNAs içeren ribozomların biyokimyasal analizler için büyük bir engel, aynı örneklerde diğer ribozom varlığı olmuştur analiz edilen spesifik mRNA dizisinin çevirisinde yer almayan ribozomlar. Biz sadece ilgi doğmakta olan peptidil-tRNA içeren ribozomlar arındırmak için basit bir yöntem geliştirdi.

Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

Kaynak: Wiegand, D.J., ve diğerleri. Hızla Büyüyen Bakteri Vibrio natriegens Kullanılarak Hücresiz Protein Ekspresyonu. J. Vis. Uzm. (2019).Bu video, birleştirilmiş in vitro transkripsiyon ve translasyon gerçekleştirmek için Vibrio natriegens ham lizatına dayalı bakteriyel hücresiz bir protein ekspresyon sisteminin kullanımını göstermektedir. Temel bileşenlerle bir ana karışımın hazırlanmasını ve bir DNA şablonundan fonksiyonel proteinlerin adım adım sentezini vurgular.

Bakteriyel Ham Hücre Ekstraktı Kullanılarak Hücresiz Protein Ekspresyonu

Bu makale, ekstrakromozomal dairesel DNA'yı (eccDNA) saflaştırmak için Circle-Seq adı verilen hassas bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, kolon saflaştırmayı, kalan doğrusal kromozomal DNA'nın çıkarılmasını, yuvarlanan daire amplifikasyonunu ve yüksek verimli dizilemeyi kapsar. Circle-Seq, ökaryotik eccDNA'nın genom ölçeğinde taranması ve genom kararsızlığı ve kopya sayısı varyasyonunun incelenmesi için geçerlidir.

Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma

Biz bir basit tekniğinde gen uzunluğunda DNA moleküllerinin immobilizasyon için boş hücre gen ifade deneyler biochips üzerinde gerçekleştirmek için kullanılan bir yüzey üzerinde açıklayınız.

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

İfade boş hücre sistemleri yüksek üretilen iş sentezi ve önemli protein testi ile taranması için maliyet-etkin ve güçlü araçlardır. Burada, Vibrio natriegens plazmid DNA, doğrusal DNA ve mRNA şablonunu kullanarak hızlı protein üretimi için kullanılan boş hücre proteini ifade sistemin hazırlanması açıklayın.

Boş hücre Protein ifade kullanarak hızla büyüyen bakteri Vibrio natriegens

Dairesel RNA'lar üreten muhabir genleri klonlayıp analiz ediyoruz. Bu muhabir genler doğrusal birleştirme analiz etmek ve Alu elemanları içeren yapılar daha büyüktür. Dairesel RNA'ları araştırmak için yapılar hücrelere dönüştürülr ve doğrusal RNA çıkarıldıktan sonra RT-PCR kullanılarak ortaya çıkan RNA analiz edilir.

Dairesel RNA'ları Analiz Etmek Için Minigen İçeren Alu Elementin Kullanımı

Çalışma, sentetik gen parçalarından protein tarama kampanyaları için klonlama yapmadan veya canlı hücreler kullanmadan büyük (μg-mg) miktarlarda DNA oluşturmak için bir protokol tanımlamaktadır. Minimal şablon enzimmatik olarak sindirilir ve daireselleştirilir ve daha sonra izotermal yuvarlanan daire amplifikasyonu kullanılarak yükseltilir. Hücresiz ifade reaksiyonları, teşvik edilmemiş ürünle gerçekleştirilebilir.

Hücresiz Sistemler Kullanarak Protein Prototipleme için Minimal, Doğrusal Şablonların Amplifikasyonu için Hızlı, Enzymatik Yöntemler

Bu protokol, Escherichia coli'nin tasarlanmış bir suşunu kullanarak ve sadece standart laboratuvar ekipmanı gerektiren hücresiz gen ekspresyözü için bakteriyel lisat üretmek için hızlı ve basit bir yöntemi açıklar.

Bakteri hücresi içermeyen Lysate'in Hızlı, Uygun Fiyatlı ve Karmaşık Olmayan Üretimi

İyi karakterize edilmiş genetik parçalar, yeni genetik devrelerin tasarımı için gereklidir. Burada, genetik parçaları hızlı bir şekilde karakterize etmek için uygun maliyetli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz. Yöntemimiz, hücresiz lizatları, klonlamayı önlemek için lineer DNA'yı ve verimi artırmak ve reaksiyon hacimlerini azaltmak için akustik sıvı işlemeyi birleştirerek maliyeti ve zamanı azaltır.

Genetik Parçaların Hücresiz Sistemlerle Hızlı Karakterizasyonu

Bu çalışma, Escherichia coli'den (E. coli ) hücre ekstraktının hazırlanmasını ve ardından 24 saatten kısa sürede hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarını açıklamaktadır. Hücresiz otoindüksiyon (CFAI) protokolünün açıklaması, araştırmacı gözetimini azaltmak ve elde edilen hücre ekstraktı miktarlarını artırmak için yapılan iyileştirmeleri detaylandırmaktadır.

Hücresiz Otomatik İndüksiyon İş Akışını Kullanarak 24 Saat İçinde Hücrelerden Hücresiz Protein Sentezine

Bu protokol, sentetik hücrelerin yapımında kullanılan Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) sistemini tanımlar. Farklı mikro bölmelerde temsili sonuçlarla temel aşamaları ana hatlarıyla belirtir. Protokol, sentetik hücre topluluğundaki çeşitli laboratuvarlar için en iyi uygulamaları oluşturmayı ve sentetik hücre gelişiminde ilerlemeyi ilerletmeyi amaçlamaktadır.

Sentetik hücreler oluşturmak için hücresiz protein sentez sistemi

Keşfedin, E. coli BL21 Rosetta2 ekzonükleaz V eksik hücre ekstrelerinden lineer DNA şablonlarıyla hücresiz protein sentezi yöntemini. Klonlama gereksinimini ortadan kaldırarak hızlı prototipleme sağlar.

Lineer DNA Şablonlarını Kullanarak Ekzonükleaz Eksikliği Olan Hücresel Ekstraktlardan Hücresiz Protein Sentezi

Daha fazla video keşfet