Name: Saccharomyces cerevisiaede Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'de yakınlık ligasyonu ve kantitatif PCR kullanarak D-loop oluşumunu ve uzamasını tarafsızca ölçme yöntemini. Bu teknik, homolog rekombinasyonda protein rollerini ayırt etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Heyer laboratuvarındaki çalışmalar, W.-D.H.'ye GM58015 ve GM137751 hibeleri ile desteklenmektedir. Piazza laboratuvarındaki araştırmalar Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-StG 3D-loop, büyük anlaşma 851006) tarafından desteklenmektedir. D.R., T32CA108459 ve A.P. Giannini Vakfı tarafından desteklenmektedir. Shih-Hsun Hung'a (Heyer Lab) DLC/DLE tahlil sonuçlarını paylaştığı ve bu protokolde detaylandırılan tahlillerdeki değişiklikleri ayrıca doğruladığı için teşekkür ederiz.

1. Büyüme öncesi, DSB indüksiyonu ve numune toplama
NOT: Ade suşları için tüm ortamların %0,01 adenin ile desteklenmesi önerilir.
<ol><li>Maya pepton dekstroz adenin (YPDA) (% 1 maya ekstresi,% 2 pepon,% 2 glikoz,% 2 agar,% 0.001 adenin) üzerindeki uygun haploid suşları (bakınız Tablo 1) çizin ve 30 ° C'de 2 gün boyunca büyüyün.</li>
	<li>15 mL'lik bir cam kültür tüpünde 5 mL YPDA'yı aşılamak için tek bir koloni kullanın. Havalandırma için sallama veya dönme ile kültürleri 30 ° C'de doygunluğa kadar büyütün.</li>
	<li>DLC testi: 5x psoralen stok çözeltisini (200 geçirmez etanolde 0,5 mg/mL trioksalen) bir duman davlumbazında, psoralen'i oda sıcaklığında gece boyunca sürekli çalkalama veya ters çevirme ile alüminyum folyoya sarılmış 50 mL'lik bir konik tüp içinde çözerek hazırlayın. Buharlaşmayı önlemek için vidalı üst kısmı şeffaf bir filmle kapatın. Psoralen uygun çözünmesini sağlamak için 50 mL konik tüp başına 7 mL'den fazla 5x psoralen stok çözeltisi hazırlamayın.</li>
	<li>Ertesi gün, uygun büyüklükte bir şişede (tomurcuklanan maya, kültürün hacminin en az 5 katı olan bir şişede en uygun şekilde büyür) 50-100 mL YEP-laktat (% 1 maya ekstresi,% 2 pepton,% 2 w laktat,% 0.001 adenin) aşılamak için gece kültüründe yetiştirilen YPDA'nın 5 mL'sini kullanın. ~ 0.03'lük bir OD600'e .</li>
	<li>Kültürü 30 ° C'de ~ 16 saat boyunca 220 rpm'de sallayarak büyütün. ~ 16 saatten sonra, kültürün OD600'ünü ölçün ve ~ 0.5-0.8 olmalıdır. Az veya aşırı büyümüş kültürleri kullanmayın.</li>
	<li>Her zaman noktası için, uygun hücre hacmini konik bir tüpte toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Tipik olarak, bu, DLC testi için 1 x 108 hücre (bir haploid vahşi tip suş için OD 600 1.0'da yaklaşık7.5 mL kültür) ve DLE testi için 5 x 10 7 hücredir (OD600 1.0'da yaklaşık 2.5 mL kültür).</li>
	<li>OD600 değerlerinin doğruluğunu sağlamak için, OD okumasını 0,2 veya altında tutmak üzere OD600≥0,2 olan kültürler için 1:5 seyreltmeler hazırlayın. Vahşi tip suşlar için, DLC analizi için en uygun zaman noktaları 2 saat ile 6 saat arasındadır ve DLE analizi için en uygun zaman noktaları 4 saat ile 8 saat arasındadır (bkz. Şekil 3 ve Şekil 4).</li>
	<li>DLC testi<ol><li>Her zaman noktasından önce, folyoya sarılı 50 mL'lik konik bir tüp içindeki tüm numuneler için bir duman davlumbazında yeterli miktarda 1x psoralen çözeltisi (0.1 mg / mL trioksalen, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0,% 20 etanol) hazırlayın. RT'de bırakın.</li>
		<li>Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'de santrifüj yapın. Peleti bir duman davlumbazında 2,5 mL 1x psoralen çözeltisinde yeniden askıya alın ve 60 mm x 15 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Alternatif olarak, çapraz bağlamasız bir kontrol için peleti 2,5 mL TE1 çözeltisinde (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) yeniden askıya alın.</li>
		<li>Örnekleri çapraz bağlayın. Uzun dalga (365 nm) ampullerle uyumlu bir UV çapraz bağlayıcı için, Petri kaplarını UV ışık kaynağının 1-2 cm altına yerleştirin ve kapak -20 ° C'de önceden soğutulmuş plastik veya pleksiglas bir plakanın üzerine çıkarılmış olarak yerleştirin. Bir UV ışık kutusu için, Petri kaplarını doğrudan UV ışık kaynağının üzerine yerleştirin. Numuneleri hafifçe sallayarak 10 dakika boyunca maruz bırakın. NOT: UV ışık kaynağının ~ 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörüngesel çalkalayıcının üzerine ayarlanması önerilir.</li>
		<li>Bir duman davlumbazında, numuneyi yeni bir 15 mL tüpe aktarın. Petri kabını 2,5 mL TE1 çözeltisi ile durulayın ve bunu tüpe ekleyin. Numuneleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'de santrifüj edin, süpernatanı uygun şekilde atın ve peleti -20 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>DLE testi<ol><li>Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'de santrifüj yapın. Spini tekrarlamadan ve peletleri -20 ° C'de saklamadan önce hücre peletini 2,5 mL soğuk TE1 çözeltisinde yıkayın. Numuneler bir sonraki adıma geçmeden önce 1 haftaya kadar saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>0 saatte numune toplamak için,% 20 galaktoz ilavesinden önce örnekleri toplayın. Sonraki zaman noktaları için, kültürlere% 20 galaktoz ekleyerek% 2'lik bir nihai konsantrasyona DSB oluşumunu indükleyin. Kalan örnekleri yukarıda açıklandığı gibi toplayın, pelet ve DSB indüksiyonu sonrası zamana göre dondurun (yani, 4 saatlik örnek,% 20 galaktoz ilavesinden 4 saat sonra toplanır).</li>
</ol>2. Hücre sferoplastı, lizis ve restriksiyon bölgesi restorasyonu
<ol><li>Örnekleri buz üzerinde çözün. Kuru bir banyoyu önceden 30 ° C'ye ısıtın.</li>
	<li>Numuneleri 1 mL sferoplast tamponda (0,4 M sorbitol, 0,4 M KCl, 40 mM sodyum fosfat tamponu pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) yeniden askıya alın ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>3.5 μL zymolyase çözeltisi ekleyin (% 2 glikoz, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mg / mL zymolyase 100T; 17.5 μg / mL zymolyase nihai konsantrasyonu). Dokunarak veya ters çevirerek hafifçe karıştırın. 15 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin ve ardından buzun üzerine yerleştirin. 15 dakikalık inkübasyon sırasında sıvı azot veya kuru buz elde edin.</li>
	<li>4 °C'de 2.500 x g'de 3 dakika santrifüj yapın ve numuneleri buz üzerine yerleştirin. Numuneleri 1 mL sferoplast tamponda 3 kat yıkayın. Numuneleri 4 °C'de 2.500 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
	<li>Numuneleri 1 mL soğuk 1x kısıtlama enzim tamponunda (50 mM potasyum asetat, 20 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat, RT'de 100 μg/mL BSA pH ~8.0) yeniden askıya alın ve 4 °C'de 16.000 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Örnekleri buzun üzerine yerleştirin. Yıkamayı 1x tekrarlayın.</li>
	<li>Numuneleri 1 mL soğuk 1x kısıtlama enzim tamponunda yeniden askıya alın. Numuneyi (her biri 0,5 mL) iki adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne bölün. Numuneleri 4 °C'de 16.000 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
	<li>Her numuneden bir tüpü hibridize oligolarla 180 μL 1.4x kısıtlama enzim tamponunda (bakınız Tablo 2) ve oligoları hibridize etmeden 180 μL 1.4x kısıtlama enzim tamponunda bir tüpü yeniden askıya alın. Her hibridize edici oligo, 1x TE'de (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) yeniden askıya alınır ve 7 nM'lik bir son konsantrasyonda kullanılır. 1x TE, oligoları hibridize etmeden 1.4x kısıtlama enzim tamponundaki hibridize oligoların yerini alır. NOT: Hibridize oligolar, çalışma seyreltmesinde küçük alikotlarda -20 ° C'de saklanmalıdır. Hibridize oligoların konsantrasyonu optimizasyon gerektirebilir; bkz: Tartışma.</li>
	<li>Numuneleri sıvı azot veya kuru buz/etanol içinde çıtçıtla dondurun ve -80 °C'de saklayın. Örnekler bu aşamada birkaç ay saklanabilir.</li>
</ol>3. Restriksiyon enzim sindirimi ve intramoleküler ligasyon
<ol><li>Örnekleri buz üzerinde çözün. Bir kuru banyoyu önceden 65 ° C'ye, diğerini 37 ° C'ye ısıtın.</li>
	<li>Pipet 36 μL numuneyi buz üzerinde yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne dönüştürür. Kalan numuneyi depolama için derhal -80 ° C'ye iade edin.</li>
	<li>4 μL% 1 SDS (% 0.1 nihai konsantrasyon) ekleyin ve tüpün kenarına hafifçe dokunarak karıştırın. Her 5 dakikada bir hafifçe dokunarak 15 dakika boyunca 65 °C'de inkübe edin. Kuluçkadan hemen sonra buz üzerine numuneler yerleştirin. NOT: Bu SDS tedavisi, DNA ile ilişkili proteinlerin denatürasyonunu, nükleer zarfın çözünmesini ve kısıtlama enzimi sindirimi ve molekül içi ligasyon adımlarından önce kromatin erişilebilirliğini teşvik eder.</li>
	<li>4,5 μL %10 Triton X-100 (%1 nihai konsantrasyon) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Her numuneye 20-50 U kısıtlama enzimi (EcoRI-HF veya HindIII-HF) ekleyin ve her 20-30 dakikada bir nazik ajitasyonla 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bu süre zarfında, kuru bir banyoyu 55 ° C'ye önceden ısıtın ve bir su banyosunu 16 ° C'ye önceden ayarlayın.</li>
	<li>Her numuneye 8,6 μL %10 SDS (%1,5 nihai konsantrasyon) ekleyin ve pipetleme ve kılavuzlama yoluyla karıştırın. 10 dakika boyunca 55 °C'de inkübe edin. Her numuneye 80 μL %10 Triton X-100 (%6 nihai konsantrasyon) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>Her numuneye ATP'siz 660 μL 1x ligasyon tamponu (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,2.5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8.0 + T4 DNA ligaz (8 U/numune) ekleyin ve nazik ters çevirerek karıştırın. Her 30 dakikada bir ters çevirme ile 1,5 saat boyunca 16 °C'de inkübe edin. Örnekleri inkübasyondan hemen sonra buz üzerine yerleştirin.</li>
</ol>4. DNA saflaştırma
<ol><li>Bir kuru banyoyu önceden 65 ° C'ye, diğerini 37 ° C'ye ısıtın. Her numuneye 1 μL 10 mg/mL proteinaz K (1x TE pH 8.0'da hazırlanmış) ekleyin (12.5 μg/mL nihai konsantrasyon). 65 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve numuneleri soğuyana kadar inkübasyondan hemen sonra buz üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Numuneleri 2 mL tüplere aktarın. Bir davlumbazda çalışırken, her numuneye eşit miktarda (~800 μL) fenol/kloroform/izoamil alkol (P/C/IA; pH 8.0) ekleyin. Numuneleri ~ 30 s vortekste edin ve numuneleri bir mikrosantrifüjde 16.000 x g'de 5-10 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
	<li>Her numunenin üst fazının 600 μL'sini yeni bir 1,5 mL'lik tüpe dikkatlice çıkarın. Alt fazı ve 2 mL tüpleri uygun şekilde atın.</li>
	<li>Her numuneye 1/10 hacim 3 M sodyum asetat pH 5.2 (~60 μL) ekleyerek DNA'yı çökeltin, ardından 1 hacim izopropanol (~ 660 μL). Numuneleri 5x-10x ters çevirin ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Numuneleri 2 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin ve ardından numuneleri bir mikrosantrifüjde 4 ° C'de 15 dakika boyunca 16.500 x g'de santrifüj yapın. Numuneleri buza geri döndürün, süpernatanı dökün ve tüpü bir kağıt havluya boşaltın.</li>
	<li>DNA peletini 200 μL% 70 etanol ile yıkayın. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 16.500 x g'de santrifüj yapın, numuneleri tekrar buzun üzerine yerleştirin, süpernatanı dökün ve kalan alkolü bir pipetle çıkarın. Numuneleri, tüplerin kapakları 37 °C'de 15-20 dakika açık olacak şekilde kurulayın.</li>
	<li>DNA peletlerini vorteks yaparak 50 μL 1x TE'de yeniden askıya alın. RT'de 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın, girdap yapın ve daha sonra 30 dakika boyunca kuru bir banyoda 37 ° C'de inkübe edin. Örnekleri tekrar vorteksleyin ve sonra buzun üzerine yerleştirin. Numuneler bu aşamada birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir, ancak çapraz bağlama (yalnızca DLC) ve qPCR adımları için hemen devam etmeniz önerilir.</li>
</ol>5. Psoralen çapraz bağlantı tersine çevirme (yalnızca DLC testi için)
<ol><li>Pipet 9 μL saflaştırılmış DNA, buz üzerindeki bir PCR tüpüne dönüşür. 1 μL 1 M KOH (0,1 M nihai konsantrasyon) ekleyin. Numuneleri bir termosiklusta 30 dakika boyunca 90 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>19.73 μL sodyum asetat çözeltisi ekleyin (0.1 M sodyum asetat, 9.6 mM Tris-HCl pH 8.0, 1.0 mM EDTA pH 8.0). Numuneler bu aşamada birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir, ancak hemen qPCR adımına geçmeniz önerilir.</li>
</ol>6. Kantitatif PCR, kontroller ve analiz
<ol><li>Çapraz bağlantılı veya çapraz bağlanmasız 2 μL saflaştırılmış DNA kullanarak, üreticinin talimatlarına göre 20 μL qPCR reaksiyonu ayarlayın. Her reaksiyonu çift olarak ayarlayın. Hem DLC hem de DLE tahlilleri için, beş kontrol reaksiyonu ve bir DLC / DLE niceleme reaksiyonu veya numune başına toplam altı reaksiyon çift olarak çalıştırılır. Ek Tablo S1 ve Ek Tablo S2 , bu reaksiyonları ve analizleri ayarlamak için bir şablon sağlar ve qPCR primerlerinin dizileri Tablo 3'te listelenmiştir.</li>
	<li>qPCR bisiklet koşullarının her qPCR kiti için optimize edilmesi gerekir.<ol><li>Kullanılan qPCR kitlerine bağlı olarak aşağıdaki DLC qPCR koşullarını kullanın: ilk denatürasyon (3 dakika boyunca 95 °C); 50 tur amplifikasyon (15 s için 95 °C, 25 s için 61 °C, tek bir kazanımla 15 s için 72 °C); erime eğrisi analizi (5 s için 95 °C, 1 dakika için 65 °C, sürekli kazanım ile 97 °C); ve soğutma (30 s için 37 ° C).</li>
		<li>DLE testi için aşağıdaki qPCR koşullarını kullanın: ilk denatürasyon (5 dakika boyunca 95 °C); 50 tur amplifikasyon (15 s için 95 °C, 30 s için 60 °C, tek bir kazanımla 15 s için 72 °C); erime eğrisi analizi (5 s için 95 °C, 1 dakika için 65 °C, sürekli kazanım ile 97 °C); ve soğutma (30 s için 37 ° C). Farklı qPCR makineleri/kitleri için optimizasyonun gerekli olabileceğini unutmayın.</li>
	</ol></li>
	<li>DLC testi<ol><li>Denetimler: Tablo 3'teki qPCR primerlerinin listesine bakın. Astar bağlanma bölgelerinin bir haritası Şekil S1'de gösterilmiştir. İlgili genomik özellikler ve amplikonlar için ek dizi dosyaları için, A plazmid Düzenleyicisi (ApE) dosyalarını kontrol edin; Ek Sıra Dosyaları 1-5.<ol><li>ARG4'te Genomik DNA: ARG4'te bulunan dsDNA'yı yükseltmek için olWDH1760 / olWDH1761 kullanın. Bu reaksiyonu bir yükleme kontrolü olarak kullanın ve bu kontrole DLC sinyal reaksiyonu dışındaki diğer tüm reaksiyonları normalleştirin.</li>
			<li>DAP2'de intramoleküler ligasyon verimliliği: DLC ligasyonuna paralel olarak intramoleküler ligasyon için EcoRI sindirimi tarafından oluşturulan 1.904 bp fragmanını kullanın. Bu ligasyon kavşağı boyunca amplifikasyon, molekül içi ligasyon verimliliğini bildirir ve DLC sinyalinin normalleştirildiği bir kontrol görevi görür.</li>
			<li>DSB indüksiyonu: İndüklenen DSB'yi kapsayan bir bölgeyi yükseltmek için olWDH1766/olWDH1767 kullanın.</li>
			<li>Psoralen çapraz bağlama ve rezeksiyon: EcoRI tanıma alanının aşağısındaki benzersiz PhiX bölgesini yükseltmek için olWDH2019/olWDH2020 kullanın. Çapraz bağlantı tersine çevirme olmadan, çapraz bağlama verimliliğini belirlemek için ARG4 (çapraz bağlı dsDNA) üzerindeki ssDNA (çapraz bağlanma yok) oranını kullanın. Çapraz bağlantının tersine çevrilmesi ile rezeksiyon, ARG4'e göre sinyalin 1'inden 0.5'ine aşamalı bir düşüşe yol açacaktır.</li>
			<li>EkoR I tanıma alanı restorasyonu ve kesme: Rezeke edilen iplikçik üzerinde DSB'nin yukarı yönünde restore edilmiş EcoRI tanıma bölgesini kapsayan bir bölgeyi büyütmek için olWDH1768/olWDH1764 kullanın. olWDH1769/olWDH1763, DAP2'deki EcoRI kısıtlama enzim bölgesini kapsayan bir bölgeyi güçlendirir. İntramoleküler ligasyon kontrolü olarak kullanmak için bu bölgede EcoRI bölünmesi yapın.</li>
		</ol></li>
		<li>DLC sinyali: Rezeke edilmiş (istilacı) ipliğin ve donörün intramoleküler ligasyonu ile oluşturulan kimerik DNA molekülünü yükseltmek için olWDH1764 / olWDH1765 kullanın.</li>
		<li>Analiz: Yinelenen reaksiyonların her biri için Cp değerlerinin ortalama ve standart sapmasını hesaplayın. Diğer tüm kontrol qPCR'lerini normalleştirmek için ARG4 genomik DNA qPCR Cp değerlerini referans olarak kullanın. DAP2'deki molekül içi ligasyon kontrolüne DLC sinyalini normalleştirin. 2 saatte tipik DLC sinyal değerleri için Şekil 3'e bakınız.</li>
	</ol></li>
	<li>DLE testi<ol><li>Denetimler: Tablo 3'teki qPCR primerlerinin listesine bakın. Astar bağlanma bölgelerinin bir haritası Şekil S1'de gösterilmiştir. İlgili genomik özellikler ve amplikonlar için ek dizi dosyaları için, A plazmid Düzenleyicisi (ApE) dosyalarını (Ek Dizi Dosyaları 1-5) kontrol edin.<ol><li>ARG4'te genomik DNA: Bölüm 6.3.1.1'e bakınız.</li>
			<li>YLR050C'de molekül içi ligasyon verimliliği: DLE ligasyonuna paralel olarak intramoleküler ligasyona tabi tutulacak 765 bp'lik bir fragman oluşturmak için HindIII sindirimini kullanın. Bu ligasyon kavşağı boyunca amplifikasyon, molekül içi ligasyon verimliliğini bildirir ve DLE sinyalinin normalleştirildiği bir kontrol görevi görür.</li>
			<li>DSB indüksiyonu: Bkz. bölüm 6.3.1.3.</li>
			<li>Arjantin III tanıma bölgesi restorasyonu ve kesimi: Sırasıyla rezeke edildiği ve uzatıldığı kırık iplikçik üzerindeki HindIII kısıtlama enzim bölgelerini kapsayan bir bölgeyi büyütmek için olWDH2010/olWDH2012 ve olWDH2009/2011 kullanın.</li>
		</ol></li>
		<li>DLE sinyali: DSB'nin istilacı iplikçik yukarı akışının rezeke edilmiş ucunun DSB'nin yeni genişletilmiş uç aşağı akışına intramoleküler ligasyonu ile oluşturulan kimerik DNA molekülünü yükseltmek için olWDH2009 / olWDH2010 kullanın.</li>
		<li>Analiz: Yinelenen reaksiyonların her biri için Cp değerlerinin ortalama ve standart sapmasını hesaplayın. Diğer tüm kontrol qPCR'lerini normalleştirmek için ARG4 genomik DNA qPCR Cp değerlerini referans olarak kullanın. DLE sinyalini YLR050C'deki molekül içi ligasyon kontrolüne normalleştirin. 6 saatteki tipik DLE sinyal değerleri Şekil 4 ve önceki yayınlar9'da bildirilmiştir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).</li>
<li>Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+recombination+and+genomic+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of recombination and genomic maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501(2015).</li>
<li>Mimitou, E. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sae2%2C+Exo1+and+Sgs1+collaborate+in+DNA+double-strand+break+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing.</a> Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).</li>
<li>Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+Holliday+junctions+are+intermediates+of+DNA+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair.</a> Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).</li>
<li>Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPA+coordinates+DNA+end+resection+and+prevents+formation+of+DNA+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins.</a> Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).</li>
<li>Mazón, G., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mph1+and+Mus81-Mms4+prevent+aberrant+processing+of+mitotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates.</a> Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).</li>
<li>Saini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+bubble+during+break-induced+replication+drives+conservative+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis.</a> Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).</li>
<li>Piazza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+processing+of+displacement+loops+during+recombinational+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair.</a> Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).</li>
<li>Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity+ligation-based+method+for+quantitative+measurement+of+D-loop+extension+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).</li>
<li>Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+roles+of+Rad52%2C+Rad54%2C+and+Rad55+proteins+in+Rad51-mediated+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination.</a> Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).</li>
<li>Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+homology+search+during+DNA+double-strand+break+repair+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo.</a> Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).</li>
<li>Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysis+of+homologous+DNA+pairing+by+yeast+Rad51+and+Rad54+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins.</a> Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).</li>
<li>Wright, W. D., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+functions+as+a+heteroduplex+DNA+pump+modulated+by+its+DNA+substrates+and+Rad51+during+D-loop+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation.</a> Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).</li>
<li>Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+role+of+Rad54+in+Rad51-ssDNA+filament-dependent+homology+search+and+synaptic+complexes+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation.</a> Nature Communications. 10 (1), 4058(2019).</li>
<li>Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+drives+ATP+hydrolysis-dependent+DNA+sequence+alignment+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination.</a> Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).</li>
<li>Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break-induced+replication+and+telomerase-independent+telomere+maintenance+require+Pol32%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32.</a> Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombination+execution+checkpoint+regulates+the+choice+of+homologous+recombination+pathway+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair.</a> Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).</li>
<li>Donnianni, R. A., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break-induced+replication+occurs+by+conservative+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+break-induced+replication+shows+that+it+stalls+at+roadblocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks.</a> Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).</li>
<li>Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+kinetics+of+break-induced+replication+%28BIR%29+by+the+assay+for+monitoring+BIR+elongation+rate+%28AMBER%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER).</a> Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).</li>
<li>Pham, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+restraining+break-induced+replication+at+two-ended+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks.</a> The EMBO Journal. 40 (10), 104847(2021).</li>
<li>Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralens+as+photoactive+probes+of+nucleic+acid+structure+and+function%3A+Organic+chemistry%2C+photochemistry%2C+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry.</a> Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).</li>
<li>Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkali+reversal+of+psoralen+cross-link+for+the+targeted+delivery+of+psoralen+monoadduct+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion.</a> Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).</li>
<li>Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-catalyzed+reversal+of+a+psoralen-DNA+cross-link%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link.</a> Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Mph1+helicase+dissociates+Rad51-made+D-loops%3A+Implications+for+crossover+control+in+mitotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination.</a> Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Srs2+promotes+synthesis-dependent+strand+annealing+by+disrupting+DNA+polymerase+%CE%B4-extending+D-loops%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops.</a> eLife. 6, 22195(2017).</li>
<li>Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top3-Rmi1+dissolve+Rad51-mediated+D+loops+by+a+topoisomerase-based+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism.</a> Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).</li>
<li>Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+treatment+and+single-molecule+real-time+sequencing+reveal+D-loop+length%2C+position%2C+and+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution.</a> eLife. 9, 59111(2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Sunulan testler, yakınlık ligasyonu ve qPCR kullanılarak yeni ortaya çıkan ve genişletilmiş D-döngülerinin (DLC testi), D-döngü uzantısının (DLE testi) ve BIR ürün oluşumunun (hibridize edici oligonükleotid içermeyen DLE testi) tespit edilmesine izin verir. Rad51'in DSB'den uzak bölgelere ChIP-qPCR'si daha önce Rad51 aracılı homoloji araması ve D-döngü oluşumu için bir proxy olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu ChIP-qPCR sinyali, kırılma bölgesi ile potansiyel bir donör arasındaki sekans homolojisinden ve Rad51 il...

Homolog rekombinasyon (HR), DNA çift sarmallı kırılmaların (DSB'ler), iplikler arası çapraz bağlantıların ve ssDNA boşluklarının onarımının yüksek doğrulukta bir mekanizmasının yanı sıra DNA hasar toleransı için bir yoldur. HR, homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) ve translezyon sentezi gibi DNA hasarı onarımı / toleransı için hataya eğilimli yollardan farklıdır, çünkü onarım olayını şablonlamak için donör olarak sağlam, homolog bir dupleks DNA kullanır. Dahası, İK yolundaki anahtar ara ürünlerin çoğu geri dönüşümlüdür ve bireysel yol adımlarının mükemmel bir şekilde düzenlenmesine izin verir. Hücre döngüsünün S, G2 ve M fazları sırasında İK, iki uçlu DSB'lerinonarımı için NHEJ ile rekabet eder 1. Ek olarak, HR, ssDNA boşlukları ve tek taraflı DSB'ler de dahil olmak üzere replikasyonla ilişkili DNA hasarının onarımı için ve DNA lezyonu bypass2'nin bir mekanizması olarak DNA replikasyonu için gereklidir.
HR yolundaki kritik bir ara madde, yer değiştirme döngüsü veya D-döngüsüdür (Şekil 1). Son rezeksiyonu takiben, reaksiyondaki merkezi rekombinaz, Rad51, kırık molekülün yeni rezeke edilmiş ssDNA'sına yüklenir ve sarmal bir filament2 oluşturur. Rad51 daha sonra uygun bir homolog donörü, tipik olarak somatik hücrelerdeki kardeş kromatidini tanımlamak için bir homoloji araştırması yapar. D-döngüsü, Rad51-ssDNA filamenti homolog bir dubleks DNA'yı istila ettiğinde oluşur, bu da kırık ipliğin Watson-Crick baz eşleşmesine donörün tamamlayıcı ipliği ile eşleştirilmesine yol açar ve karşı donör ipliğinin yerini alır. Kırık ipliğin 3' ucunun bir DNA polimeraz ile uzatılması, DNA hasarı olayı sırasında kaybedilen bazların yerini alır ve genişletilmiş D-döngü ara ürününün senteze bağımlı iplik tavlama (SDSA), çift Holliday kavşağı (dHJ) veya kırılmaya bağlı replikasyon (BIR) HR alt yolları yoluyla bir dsDNA ürününe çözünürlüğünü teşvik eder.
İK yolundaki ara ürünleri fiziksel olarak izleyen testler, her adım için genetik gereksinimlerin analizine izin verir (yani, yol analizi). DSB oluşumu, uç rezeksiyon, dHJ'ler, BIR replikasyon kabarcıkları ve HR ürünleri, Güney lekelenmesi 3,4,5,6,7 ile kolayca gözlenir. Bununla birlikte, Güney lekelenmesi yeni ortaya çıkan ve genişlemiş D-döngüleri hakkında rapor vermekte başarısız olmaktadır ve bu nedenle, bu eklem moleküllerini güvenilir bir şekilde ölçmek için alternatif bir yöntem gereklidir 4,8,9. Gelişmekte olan D-döngü oluşumunu analiz etmek için yaygın olarak kullanılan bir strateji, Rad51'in kromatin-immünopresipitasyonu (ChIP) ve kantitatif PCR (qPCR) 10,11'dir. Bununla birlikte, ChIP-qPCR ile ölçülen dsDNA ile Rad51 ilişkisi, dizi homolojisinden ve Rad51 aksesuar faktörü Rad5410,11'den bağımsızdır. Buna karşılık, burada sunulan D-döngü analizi yöntemini kullanan ve D-döngü yakalama (DLC) testi olarak adlandırılan kayda değer bir sinyal, DSB oluşumuna, dizi homolojisine, Rad51'e ve Rad51 aksesuar proteinleri Rad52 ve Rad548'e bağlıdır. Saccharomyces cerevisiae Rad51-terfi eden D-döngü oluşumunun Rad54'e in vivo olarak bağlı olduğu bulgusu, Rad54'ün tomurcuklanan maya Rad518,12,13,14,15 ile homoloji araştırması ve D-döngü oluşumu için gerekli olduğunu gösteren çok sayıda in vitro sulandırma deneyi ile uyumludur.
D-döngü uzantısını ölçmeye yönelik mevcut yaklaşımlar, öncelikle yarı kantitatif PCR yoluyla, benzer şekilde sorunludur. D-döngü uzantısını tespit etmek için tipik bir PCR tabanlı tahlil, bir kırılma bölgesi ile ektopik bir donör arasındaki rekombinasyondan ve müteakip rekombinasyonla ilişkili DNA sentezinden kaynaklanan, kırık iplikçik üzerindeki homoloji bölgesinin bir primer yukarı akışı ve donör iplikçik üzerindeki homoloji bölgesinin aşağı yönünde başka bir primer yoluyla benzersiz bir diziyi güçlendirir. Bu yöntemi kullanarak, rekombinasyonla ilişkili DNA sentezinin tespiti, gerekli olmayan Pol δ işlemsellik faktörü Pol3216'yı gerektirir. Bu bulgu, POL32 delesyonunun in vivo17 gen transformasyonu üzerinde sadece hafif bir etkiye sahip olduğu gözlemiyle çelişmektedir. Dahası, bu PCR tabanlı analizler D-döngü uzantısını ve BIR ürün oluşumunu geçici olarak çözmekte başarısız olur, bu da sinyalin ssDNA yerine dsDNA ürünlerinden kaynaklandığını düşündürmektedir17,18,19. D-döngü uzantısı (DLE) testi yakın zamanda bu tutarsızlıkları gidermek için geliştirilmiştir. DLE testi, ilk 3' istilacı uç9'un aşağı yönünde ~ 400 baz çifti (bp) bir bölgede rekombinasyonla ilişkili DNA sentezini ölçer. Bu yöntemle, D-döngü uzantısı Pol32'den bağımsızdır ve DSB indüksiyonundan sonraki 4 saat içinde tespit edilebilirken, BIR ürünleri ilk olarak 6 saatte gözlenir. Nitekim, Haber ve Malkova laboratuvarlarından yeni bir yayın, genomik DNA'nın bu hazırlama yönteminin kullanılmasının tekil olarak ssDNA'nın korunmasıyla sonuçlandığını belirtmiştir 9,20.
Burada, DLC ve DLE testleri ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu analizler, S. cerevisiae'de yeni ortaya çıkan ve uzatılmış D-döngülerini tespit etmek için yakınlık ligasyonuna dayanır (Şekil 2)8,9. BIR ürünleri aynı tahlil sistemi kullanılarak ölçülebilir. Her iki tahlil için, kromozom (Chr.) V üzerindeki URA3 lokusunda bulunan bir HO endonükleaz kesim bölgesinde DSB oluşumu, galaktoz ile indüklenebilir bir promotörün kontrolü altında HO endonükleazın ekspresyonu ile indüklenir. Rad51 aracılı DNA iplikçik invazyonu, Chr. II'deki LYS2 lokusunda bulunan ektopik bir donörün yerinde yeni ortaya çıkan D-döngü oluşumuna yol açar. DSB'nin sağ tarafında donöre homoloji bulunmadığından, SDSA ve dHJ oluşumu yoluyla onarım mümkün değildir. DSB'nin BIR ile ilk onarımı mümkündür, ancak canlı ürünlerin oluşumu sentromer21'in varlığı ile engellenir. Bu kasıtlı tasarım, üretken DSB onarımını önler, böylece onarılmış DBS'lere sahip hücreler tarafından büyümenin yeniden başlamasını önler, aksi takdirde zaman seyri analizi sırasında kültürü geçebilir.
DLC tahlilinde, D-döngüsü içindeki heterodupleks DNA'nın iki ipliğinin psoralen çapraz bağlanması, rekombinasyon ara maddesini korur. Kırık (rezeke edilmiş) iplikçik ve sindirim üzerinde kısıtlama enzim bölgesi restorasyonunu takiben, çapraz bağlama, homolog kırık ve donör DNA'ların yukarı yönündeki benzersiz dizilerin bağlanmasına izin verir. qPCR kullanılarak, her numunede bulunan kimerik DNA molekülünün seviyesi ölçülür. DLE testinde, çapraz bağlama gerekli değildir ve kısıtlama enzim bölgesi restorasyonu ve sindirimi ve ardından intramoleküler ligasyon bunun yerine kırık molekülün 5' ucunu yeni genişletilmiş 3' ucuna bağlar. Yine, qPCR, her numunedeki bu kimerik ürünün nispi miktarlarını ölçmek için kullanılır. Kısıtlama enzim bölgesi restorasyonunun yokluğunda, DLE testi, D-döngü uzantısını takiben oluşan BIR (dsDNA) ürününün göreceli seviyelerini rapor eder.
Vahşi tip bir suş kullanan her tahlil için temsili sonuçlar gösterilir ve okuyucular, rekombinasyon mutantlarının analizi için bu testlerin kullanımı için Piazza ve ark.8 ve Piazza ve ark.9'a yönlendirilir 8,9. Bu katkının amacı, diğer laboratuvarların DLC ve DLE tahlillerini benimsemelerini sağlamaktır ve talep üzerine bunlara destek sağlanmaktadır.

<table><tbody><tr><td><Güçlü>1. Ön büyüme, DSB indüksiyonu ve numune toplama</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman<></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>güçlü15 ve 50 mL konik tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL cam kültür tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL, 500 mL veya 1 L şişeler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm düz tabanlı</td><td></td> optik olarak şeffaf petri kapları<td></td><td>Önerilen: Corning, Katalog Numarası 430166; veya Genesee Scientific, Katalog Numarası 32-150G</td></tr><tr><td>15 ve 50 mL konik tüp adaptörlü</td><td></td><td></td><td></td>tezgah üstü santrifüj</tr><tr><td>Tezgah üstü orbital çalkalayıcı veya tüp döndürücü/tabanca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Döndürücü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV çapraz bağlayıcı veya orbital çalkalayıcının</td><td></td><td></td> <td>üzerine yerleştirilmiş 365 nm UV ampullü ışık kutusuÖnerilen: Spectrolinker XL-1500 UV Çapraz Bağlayıcı (Spectronics Corporation) veya Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Katalog Numarası 611110831</td></tr><tr><td><güçlü>Malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%60 w sodyum DL-laktat şurubu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1375</td><td>Medya hazırlığı için</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423500</td><td>Medya hazırlığı için</td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD Difco</td><td>211840</td><td>Ortam hazırlığı için</td></tr><tr><td>Bacto maya özütü</td><td>BD Difco</td><td>212750</td><td>Ortam hazırlığı için</td></tr><tr><td>D-(+)-glikoz</td><td>BD Difco</td><td>0155-17-4</td><td>Ortam hazırlığı için</td></tr><tr><td>Trioxsalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6137</td><td>Psoralen çapraz bağlama</td></tr><tr><td><güçlü>2. Sferoplasti, lizis ve restriksiyon enzim bölgesi restorasyonu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuru banyo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen veya kuru buz/etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı mikrosantrifüj veya mikrosantrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X kısıtlama enzimi (CutSmart) tamponu (500 mM potasyum asetat, 200 mM Tris-asetat, 100 mM magnezyum asetat, 1 mg / mL BSA, pH 7.8-8.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Zymolyase 100T</td><td>ABD Biyolojik</td><td>Z1004</td><td>Sferoplasti için</td></tr><tr><td><güçlü>3. Restriksiyon enzimi sindirimi ve molekül içi ligasyon< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Su banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101</td><td>DLC testi HindIII-HF için kısıtlama enzimi sindirimi</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>R3104</td><td>DLE testi için kısıtlama enzimi sindirimi</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td>Molekül içi ligasyon</td></tr><tr><td><güçlü>4. DNA saflaştırma< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Malzemeler< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ve 2 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fenol / kloroform / izoamil alkol (P / C / IA) 25:24:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>DNA saflaştırması</td></tr><tr><td><Güçlü>5. Psoralen çapraz bağlantı ters çevirme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Thermocycler / PCR makinesi</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><güçlü > 6. qPCR< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Lightcycler 480</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td>Yazarlar tarafından kullanılan qPCR makinesi</td></tr><tr>Yazarlar tarafından kullanılan <td>Lightcycler 96</td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td>qPCR makinesi</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 96 Kuyucuklu Plaka, beyaz</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>qPCR için 96 oyuklu plakalar</td></tr><tr>Yazarlar tarafından kullanılan<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix</td><td>BioRad</td><td>1725271</td><td>qPCR kiti</td></tr><tr><td>SYBR Green I Master Mix</td><td>Yazarlar</td><td></td><td>tarafından kullanılan Roche 4707516001 qPCR kiti</td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae'de proximity ligation ve kantitatif pcr ile homolog rekombinasyon ara Ürünlerinin saptanması

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

Hücre döngüsünün S ve G2 fazları sırasında ortaya çıkan DNA çift sarmallı kırılmalar ve iplikler arası çapraz bağlantılar da dahil olmak üzere DNA hasarı, homolog rekombinasyon (HR) ile onarılabilir. Ek olarak, İK, durma veya çökme sonrasında önemli bir çoğaltma çatalı kurtarma mekanizmasını temsil eder. Bu karmaşık yolun birçok geri dönüşümlü ve geri dönüşümsüz adımının düzenlenmesi, sadakatini arttırır. İK sırasında oluşan rekombinasyon ara ürünlerinin fiziksel analizi, bu kontrollerin çeşitli nükleoprotein faktörleri ve interaktörleri tarafından karakterize edilmesini sağlar. Rekombinasyon yolundaki spesifik olayları ve ara ürünleri analiz etmek için iyi kurulmuş yöntemler olmasına rağmen, bu yoldaki iki kritik adım olan D-döngü oluşumunun ve genişlemesinin tespiti yakın zamana kadar zor olmuştur. Burada, HR yolundaki anahtar olayları, yani DNA çift sarmallı kopma oluşumunu, D-döngü oluşumunu, D-döngü uzantısını ve Saccharomyces cerevisiae'de kırılmaya bağlı replikasyon (BIR) yoluyla ürünlerin oluşumunu tespit etmek için etkili yöntemler açıklanmaktadır. Bu analizler, ilgili rekombinasyon ara ürünlerini ve yüksek hassasiyetli ürünleri tespit eder ve hücresel canlılıktan bağımsızdır. D-döngülerinin, D-döngü uzantısının ve BIR ürününün algılanması, yakınlık ligasyonuna dayanır. Birlikte, bu analizler, İK proteinlerinin ve düzenleyicilerinin işlevlerini yoldaki önemli adımlarda ince bir şekilde ele almak için popülasyon düzeyinde İK'nın kinetiğinin incelenmesine izin verir.

DLC testi DLC testi, bölgeye özgü bir DSB'nin tek bir donöre invazyonuyla oluşan hem yeni ortaya çıkan hem de genişletilmiş D-döngülerini tespit eder (Şekil 2). Psoralen çapraz bağlanması, kırık ipliği ve donörü D-döngüsü içindeki heterodubleks DNA aracılığıyla fiziksel olarak bağlar. Kırılmanın rezeke edilmiş ipliği üzerinde uzun, hibridize edici bir oligo ile restriksiyon enzim bölgesi restorasyonu, restriksiyon enzim bölünmesine izin verir, ardından qPCR ile ö...

D-döngü yakalama (DLC) ve D-döngü uzatma (DLE) testleri, Saccharomyces cerevisiae'de indüklenebilir çift sarmallı bir kırılma yerinde D-döngü oluşumunu, D-döngü uzantısını ve ürün oluşumunu ölçmek için kantitatif PCR ile birlikte yakınlık ligasyonu prensibini kullanır.

Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

D-döngü yakalama ve uzatma testleri, mitotik olarak büyüyen maya hücrelerinde homolog rekombinasyon sırasında D-döngü oluşumunun ve uzatma adımlarının tarafsız ve doğrudan kantitasyonuna izin veren ilk testlerdir. Bu canlılıktan bağımsız teknik, D-döngü metabolizmasındaki proteinlerin, sadece BIR ürünlerine bakarak, daha sonraki rollerden ayrılması mümkün olmayacak şekilde incelenmesine izin verir. Gelecekte, BRCA2 ve homolog rekombinasyondaki bloom ve Warner kilo vakaları da dahil olmak üzere anahtar proteinlerin rolünü daha iyi anlamak için bu tahlillerin insan hücrelerine geçişini öngörüyoruz.Numuneleri beş dakika boyunca santrifüj yaparak başlayın. Peleti 2.5 mililitre 1x psoralen çözeltisinde yeniden askıya alın ve 60 x 15 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Çapraz bağlama kontrolü olmaması için, peleti 2,5 mililitre TE1 çözeltisinde yeniden askıya alın.Ardından, UV ışık kaynağını orbital çalkalayıcıda üst kısımda 50 RPM'ye ayarlayın. 365 nanometre uzun dalga ampulleri ile bir UV çapraz bağlayıcı kullanarak numuneleri çapraz bağlamak için. Petri kaplarını, önceden soğutulmuş plastik veya pleksiglas plaka üzerinde hafifçe sallayarak 10 dakika boyunca UV ışık kaynağının bir ila iki santimetre altına yerleştirin.Ardından numuneyi 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Petri kabını 2,5 mililitre TE1 çözeltisi ile durulayın ve bunu tüpe ekleyin. Numuneleri beş dakika boyunca santrifüj yapın.Süpernatantı atın ve peleti eksi 20 santigrat derecede saklayın. Örnekleri çözülmesi için buzun üzerine yerleştirin. Aynı zamanda, kuru bir banyoyu 30 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.Numuneleri bir mililitre sferoplasting tamponda yeniden askıya alın ve 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Daha sonra 3.5 mikrolitre zymolyase çözeltisi ekleyin ve dokunarak hafifçe karıştırın. 15 dakika boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.Ve sonra tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Üç dakika boyunca santrifüj yapın ve örnekleri buzun üzerine yerleştirin. Numuneleri bir mililitrelik sferoplasting tamponda üç kez yıkayın ve numuneleri üç dakika boyunca santrifüj edin.Numuneleri bir mililitre soğuk kısıtlama enzim tamponunda yeniden askıya alın. Üç dakika boyunca santrifüj yapın ve örnekleri buzun üzerine yerleştirin. Yıkamayı bir kez tekrarlayın.Numuneleri bir mililitre soğuk 1x kısıtlama enzim tamponunda yeniden askıya alın. Örneği eşit olarak ikiye bölün. Numuneleri dört santigrat derecede 16.000 G'de üç dakika boyunca santrifüj yapın.Her numuneden bir tüpü hibridize oligolarla 180 mikrolitre 1.4x kısıtlama enzim tamponunda ve oligoları hibridize etmeden 180 mikrolitre 1.4x kısıtlama enzim tamponunda başka bir tüpü askıya alın. Numuneleri sıvı azot içinde çıtçıtla dondurun. Örnekleri buz üzerinde çözün.Bir kuru banyoyu önceden 65'e, diğerini 37 santigrat dereceye ısıtın. Aliquot numunenin 36 mikrolitresi yeni bir mikro santrifüj tüpüne ve dört mikrolitre% 1 SDS'ye ve tüpün yan tarafına hafifçe dokunarak karıştırılır. Her beş dakikada bir hafifçe dokunarak 15 dakika boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan hemen sonra buz üzerine numuneler yerleştirin. 4,5 mikrolitre% 10 Triton X-100 ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Her numuneye 20 ila 50 birim yüksek doğrulukta EcoR1 veya HindIII kısıtlama enzimi ekleyin.Ve her 20 ila 30 dakikada bir nazik ajitasyonla bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bu süre zarfında, önceden ısıtılmış kuru banyo 55 santigrat dereceye ve su banyosu 16 santigrat dereceye kadar. Her numuneye 8,6 mikrolitre %10 SDS ekleyin ve pipetleme ve kılavuz çekme yoluyla karıştırın.10 dakika boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin. Her numuneye 80 mikrolitre %10 Triton X-100 ekleyin ve pipetle karıştırın. Her numuneye ATP'siz 660 mikrolitre 1x ligasyon tamponu, pH 8.0'da bir milimolar ATP ve sekiz birim T4 DNA ligaz ekleyin ve ters çevirerek yavaşça karıştırın.Her 30 dakikada bir ters çevirme ile 1,5 saat boyunca 16 santigrat derece inkübe edin. Örnekleri inkübasyondan hemen sonra buz üzerine yerleştirin. Protokolde açıklandığı gibi DNA saflaştırmasını takiben, üreticinin talimatlarına göre 20 mikrolitrelik bir qPCR reaksiyonu oluşturmak için iki mikrolitre saflaştırılmış DNA kullanın.Her numune için beş kontrol reaksiyonu ve bir niceleme reaksiyonu ayarlayın ve bunları çift olarak çalıştırın. Çift sarmallı kırılma veya DSB indüksiyonundan iki saat sonra DLC tahlil analizi, psoralen çapraz bağlamanın kritik olduğunu ve verimliliğin numune toplama ile qPCR arasındaki süreye bağlı olduğunu göstermiştir. ARG4 Cp değerleri çapraz bağlı örnekler arasında benzerdi, ancak çapraz bağları olmayan DNA daha verimli bir şekilde çoğaldığı için çapraz bağlanmayan örnek için daha düşüktü.Tüm örnekler için, moleküller arası ligasyon qPCR kontrolü aralık dahilindeydi. Sağlam DSB indüksiyonu, HO endonükleaz tanıma bölgesi boyunca çoğalan kontrol için düşük bir qPCR sinyali ile kanıtlanmıştır. EcoR1 qPCR kontrolü için de benzer sonuçlar gözlenmiştir.Hibridize oligo ile DLC sinyali, moleküller arası ligasyon kontrolüne normalleştirilerek hesaplandı. DSB indüksiyonundan altı saat sonra yapılan DLE tahlil analizi, ARG4 CP değerlerinin, oligoları hibridize eden ve hibridize etmeyen numune arasında benzer olduğunu göstermiştir. Moleküller arası ligasyon qPCR kontrolü, oligoları hibridize eden ve etmeyen numune için kabul edilebilir bir sinyal, ancak başarısız numune için daha düşük bir sinyal ortaya çıkardı.Her üç örnekte de sağlam DSB indüksiyonu vardı. HindIII bölünmesi, hibridize oligo tarafından restriksiyon enzim bölgesi restorasyonuna bağlı olduğundan. Rezeke edilmiş iplikçikteki HindIII bölünme bölgesi boyunca amplifikasyonda genişlik arasında ve oligo örnekleri olmadan anlamlı bir fark vardı.Genişletilmiş iplikçik üzerindeki alan boyunca amplifikasyonda daha küçük bir fark gözlenmiştir, çünkü burada HindIII bölünmesi de uzatmaya bağlıdır. Numunelerin ve tamponun her zaman soğuk tutulması gerekir. Numuneler, hibridize edici oligolarla veya hibridize oligolar olmadan 1.4x soğuk kısıtlama enzim tamponunda yeniden süspansiyonu takiben flaş dondurulmalıdır.D-döngü oluşumunun ve uzantısının ürün oluşumu üzerindeki etkileri, Güney lekelenme veya genetik sonlanım noktası testleri kullanılarak incelenebilir. Homoloji araştırması üzerine etkileri yüksek SP kullanılarak araştırılabilir. Kromatin-immünopresipitasyon, ilgilenilen bir proteinin işe alınması hakkında bilgi sağlayabilir.

detection-homologous-recombination-intermediates-via-proximity

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

HO-uyarılmış translokasyon tahlil tek iplikli DNA, çift iplikli tatili diploid birden fazla lokusların kurulmasından sonra tavlama...

HO-Endonuclease Oluşum kantitasyonu ve Analiz Tavlama Tek-Strand kromozomal Translokasyonlar Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

Bu videoda, radyoaktif işaretli problar kullanarak fare embriyonik kök hücrelerinin genomundaki homolog rekombinasyon olaylarını tanımlamak için Southern blotting tekniğini açıklıyoruz. Homolog rekombinasyon olaylarını içeren DNA bölgeleri, proba bağlı DNA'yı içeren zar X-ışınlarına maruz kaldığında farklı bantlar olarak görünür.

Fare Embriyonik Kök Hücre Genomunda Homolog Rekombinasyonu Tespit Etmek için Güney Blotting

Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Ribonucleotides genom ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında dahil en bol kanonik olmayan nükleotit arasındadır. Düzgün kaldırdıysanız, ribonucleotides DNA hasarı ve mutagenesis neden olabilir. Burada, ribonucleotide birleşme DNA ve mutajenik etkileri içine bolluk değerlendirmek için kullanılan iki deneysel yaklaşımlar mevcut.

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

Burada, fare embriyonik kök Southern blot ve/veya PCR kullanarak hücre Homolog rekombinasyon olayları tanımlamak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem ile nonmuscle myosin II genetik değiştirme fare modelleri geleneksel embriyonik kök hücre tabanlı Homolog rekombinasyon aracılı hedefleme teknolojisi kullanarak oluşturma tarafından örneklenir.

Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması

Sıralama (RH-seq) ile karşılıklı hemizygosity türler arasındaki bir özellik farkıgenetik temelharita için güçlü bir yeni yöntemdir. Hemizygot havuzları transposon mutagenezi tarafından oluşturulur ve fitness yüksek sıralama boyunca kullanarak rekabetçi büyüme ile izlenir. Elde edilen verilerin analizi, özelliğin altında yatan genleri saptar.

Genom-Geniş Karşılıklı Hemizygosity Analizi ile Saccharomyces Maya Türleri Arasındaki Termotolerans Farklarının Genetik Haritalama

Burada, bir çapraz bağlayıcı varlığında gliserol gradyan santrifüjleme olan Grafix'in (Gradyan Fiksasyonu), spliceosome kompleksine geçici olarak bağlanan birleştirme faktörleri arasındaki etkileşimleri tanımlamak için kullanımını açıklıyoruz.

Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes Geçici Interactors Tespiti için Grafix kullanımı

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

İn vivo olarak dahil edilen ve mikroskopi ve akış sitometrisi ile Click kimyası kullanılarak tespit edilen bir timidin analoğu olan EdU'yu kullanarak S. cerevisiae'deki S-faz süresini doğru bir şekilde belirlemek için iki tamamlayıcı protokol tanımladık. DNA replikasyon süresinin ve mutantlarda gözden kaçan replikasyon kusurlarının kolay karakterizasyonuna izin verir.

Saccharomyces cerevisiae'de 5-Etinil-2'-deoksiüridin Kullanımı Kullanılarak S-Faz Süresinin Belirlenmesi

Bu protokol, tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae'den doğal kromatin bağlamında ilgilenilen tek kopyalı bir gen lokusunu saflaştırmak için bölgeye özgü rekombinasyona dayalı lokusa özgü bir kromatin izolasyon yöntemi sunar.

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'de yakınlık ligasyonu ve kantitatif PCR kullanarak D-loop oluşumunu ve uzamasını tarafsızca ölçme yöntemini. Bu teknik, homolog rekombinasyonda protein rollerini ayırt etmeyi sağlar.

Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması

Daha fazla video keşfet