Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması

D-döngü yakalama ve uzatma testleri, mitotik olarak büyüyen maya hücrelerinde homolog rekombinasyon sırasında D-döngü oluşumunun ve uzatma adımlarının tarafsız ve doğrudan kantitasyonuna izin veren ilk testlerdir. Bu canlılıktan bağımsız teknik, D-döngü metabolizmasındaki proteinlerin, sadece BIR ürünlerine bakarak, daha sonraki rollerden ayrılması mümkün olmayacak şekilde incelenmesine izin verir. Gelecekte, BRCA2 ve homolog rekombinasyondaki bloom ve Warner kilo vakaları da dahil olmak üzere anahtar proteinlerin rolünü daha iyi anlamak için bu tahlillerin insan hücrelerine geçişini öngörüyoruz.

Numuneleri beş dakika boyunca santrifüj yaparak başlayın. Peleti 2.5 mililitre 1x psoralen çözeltisinde yeniden askıya alın ve 60 x 15 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Çapraz bağlama kontrolü olmaması için, peleti 2,5 mililitre TE1 çözeltisinde yeniden askıya alın.

Ardından, UV ışık kaynağını orbital çalkalayıcıda üst kısımda 50 RPM'ye ayarlayın. 365 nanometre uzun dalga ampulleri ile bir UV çapraz bağlayıcı kullanarak numuneleri çapraz bağlamak için. Petri kaplarını, önceden soğutulmuş plastik veya pleksiglas plaka üzerinde hafifçe sallayarak 10 dakika boyunca UV ışık kaynağının bir ila iki santimetre altına yerleştirin.

Ardından numuneyi 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Petri kabını 2,5 mililitre TE1 çözeltisi ile durulayın ve bunu tüpe ekleyin. Numuneleri beş dakika boyunca santrifüj yapın.

Süpernatantı atın ve peleti eksi 20 santigrat derecede saklayın. Örnekleri çözülmesi için buzun üzerine yerleştirin. Aynı zamanda, kuru bir banyoyu 30 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.

Numuneleri bir mililitre sferoplasting tamponda yeniden askıya alın ve 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Daha sonra 3.5 mikrolitre zymolyase çözeltisi ekleyin ve dokunarak hafifçe karıştırın. 15 dakika boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

Ve sonra tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Üç dakika boyunca santrifüj yapın ve örnekleri buzun üzerine yerleştirin. Numuneleri bir mililitrelik sferoplasting tamponda üç kez yıkayın ve numuneleri üç dakika boyunca santrifüj edin.

Numuneleri bir mililitre soğuk kısıtlama enzim tamponunda yeniden askıya alın. Üç dakika boyunca santrifüj yapın ve örnekleri buzun üzerine yerleştirin. Yıkamayı bir kez tekrarlayın.

Numuneleri bir mililitre soğuk 1x kısıtlama enzim tamponunda yeniden askıya alın. Örneği eşit olarak ikiye bölün. Numuneleri dört santigrat derecede 16.000 G'de üç dakika boyunca santrifüj yapın.

Her numuneden bir tüpü hibridize oligolarla 180 mikrolitre 1.4x kısıtlama enzim tamponunda ve oligoları hibridize etmeden 180 mikrolitre 1.4x kısıtlama enzim tamponunda başka bir tüpü askıya alın. Numuneleri sıvı azot içinde çıtçıtla dondurun. Örnekleri buz üzerinde çözün.

Bir kuru banyoyu önceden 65'e, diğerini 37 santigrat dereceye ısıtın. Aliquot numunenin 36 mikrolitresi yeni bir mikro santrifüj tüpüne ve dört mikrolitre% 1 SDS'ye ve tüpün yan tarafına hafifçe dokunarak karıştırılır. Her beş dakikada bir hafifçe dokunarak 15 dakika boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin.

Kuluçkadan hemen sonra buz üzerine numuneler yerleştirin. 4,5 mikrolitre% 10 Triton X-100 ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Her numuneye 20 ila 50 birim yüksek doğrulukta EcoR1 veya HindIII kısıtlama enzimi ekleyin.

Ve her 20 ila 30 dakikada bir nazik ajitasyonla bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bu süre zarfında, önceden ısıtılmış kuru banyo 55 santigrat dereceye ve su banyosu 16 santigrat dereceye kadar. Her numuneye 8,6 mikrolitre %10 SDS ekleyin ve pipetleme ve kılavuz çekme yoluyla karıştırın.

10 dakika boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin. Her numuneye 80 mikrolitre %10 Triton X-100 ekleyin ve pipetle karıştırın. Her numuneye ATP'siz 660 mikrolitre 1x ligasyon tamponu, pH 8.0'da bir milimolar ATP ve sekiz birim T4 DNA ligaz ekleyin ve ters çevirerek yavaşça karıştırın.

Her 30 dakikada bir ters çevirme ile 1,5 saat boyunca 16 santigrat derece inkübe edin. Örnekleri inkübasyondan hemen sonra buz üzerine yerleştirin. Protokolde açıklandığı gibi DNA saflaştırmasını takiben, üreticinin talimatlarına göre 20 mikrolitrelik bir qPCR reaksiyonu oluşturmak için iki mikrolitre saflaştırılmış DNA kullanın.

Her numune için beş kontrol reaksiyonu ve bir niceleme reaksiyonu ayarlayın ve bunları çift olarak çalıştırın. Çift sarmallı kırılma veya DSB indüksiyonundan iki saat sonra DLC tahlil analizi, psoralen çapraz bağlamanın kritik olduğunu ve verimliliğin numune toplama ile qPCR arasındaki süreye bağlı olduğunu göstermiştir. ARG4 Cp değerleri çapraz bağlı örnekler arasında benzerdi, ancak çapraz bağları olmayan DNA daha verimli bir şekilde çoğaldığı için çapraz bağlanmayan örnek için daha düşüktü.

Tüm örnekler için, moleküller arası ligasyon qPCR kontrolü aralık dahilindeydi. Sağlam DSB indüksiyonu, HO endonükleaz tanıma bölgesi boyunca çoğalan kontrol için düşük bir qPCR sinyali ile kanıtlanmıştır. EcoR1 qPCR kontrolü için de benzer sonuçlar gözlenmiştir.

Hibridize oligo ile DLC sinyali, moleküller arası ligasyon kontrolüne normalleştirilerek hesaplandı. DSB indüksiyonundan altı saat sonra yapılan DLE tahlil analizi, ARG4 CP değerlerinin, oligoları hibridize eden ve hibridize etmeyen numune arasında benzer olduğunu göstermiştir. Moleküller arası ligasyon qPCR kontrolü, oligoları hibridize eden ve etmeyen numune için kabul edilebilir bir sinyal, ancak başarısız numune için daha düşük bir sinyal ortaya çıkardı.

Her üç örnekte de sağlam DSB indüksiyonu vardı. HindIII bölünmesi, hibridize oligo tarafından restriksiyon enzim bölgesi restorasyonuna bağlı olduğundan. Rezeke edilmiş iplikçikteki HindIII bölünme bölgesi boyunca amplifikasyonda genişlik arasında ve oligo örnekleri olmadan anlamlı bir fark vardı.

Genişletilmiş iplikçik üzerindeki alan boyunca amplifikasyonda daha küçük bir fark gözlenmiştir, çünkü burada HindIII bölünmesi de uzatmaya bağlıdır. Numunelerin ve tamponun her zaman soğuk tutulması gerekir. Numuneler, hibridize edici oligolarla veya hibridize oligolar olmadan 1.4x soğuk kısıtlama enzim tamponunda yeniden süspansiyonu takiben flaş dondurulmalıdır.

D-döngü oluşumunun ve uzantısının ürün oluşumu üzerindeki etkileri, Güney lekelenme veya genetik sonlanım noktası testleri kullanılarak incelenebilir. Homoloji araştırması üzerine etkileri yüksek SP kullanılarak araştırılabilir. Kromatin-immünopresipitasyon, ilgilenilen bir proteinin işe alınması hakkında bilgi sağlayabilir.