Name: Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Öğrenin smTIRF mikroskobisi kullanarak kalabalık destekli lipid çift katmanlarında tek molekül görüntüleme yöntemini. Bu protokol, membran biyomoleküllerinin bağlanma, difüzyon ve montajını analiz ederek kalabalık ortamlardaki moleküler etkileşimleri incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, ClyA proteini için plazmid ekspresyonunu paylaştığı için Prof. Benjamin Schuler'e teşekkür ediyor. Bu çalışma Human Frontier Science Program (RGP0047-2020) tarafından desteklenmiştir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada, membrana gömülü biyomoleküller için kalabalık bir ortam ortaya koyan desteklenen lipit çift katmanları (SLB'ler) üzerinde tek moleküllü deneyler gösteriyoruz. Kalabalık ortam, dışlanmış bir hacim etkisi yaratır ve biyomoleküler reaksiyonlarınartmasına yol açar 1,2,39,40. Polimerin öncelikle çift katmanın dışındaki hacmi kapladığı PEG-lipid sistemi için, bu etki özellikle büyük ekto-alan...

Hücresel membranlar oldukça kalabalık ve karmaşık sistemlerdir1. Moleküler kalabalıklaşma, protein ve lipitler gibi membrana bağlı varlıkların difüzyonu üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir 2,3,4. Benzer şekilde, reseptör dimerizasyonu veya membran komplekslerinin oligomerizasyonu gibi lipit membranlar üzerindeki bimoleküler reaksiyonlar 5,6,7 kalabalığından etkilenir. Kalabalıkların doğası, konfigürasyonu ve konsantrasyonu, membran bağlanmasını, difüzyonunu ve protein-protein etkileşimini çeşitli şekillerde yönetebilir 8,9. Hücresel membranlar üzerindeki membran kalabalığını kontrol etmek ve gömülü biyomoleküller üzerindeki etkisini yorumlamak zor olduğundan, araştırmacılar alternatif in vitro sistemler kurmaya çalışmışlardır10.
Yapay kalabalık membranlar için popüler bir yaklaşım, çift katmanlı membranların polimer (polietilen glikol, PEG gibi) aşılanmış lipitlerle dopinglenmesidir11,12. Desteklenen lipit çift katmanları (SLB'ler) üzerindeki protein ve lipit dinamiklerinin görselleştirilmesi sırasında, bu polimerler ayrıca membrana gömülü bileşenleri, çift katmanı altta yatan destekten etkili bir şekilde kaldırarak altta yatan negatif yüklü substrattan (cam gibi) korur. Polimerin boyutunu ve konsantrasyonunu değiştirerek, moleküler kalabalıklaşmanın derecesini ve altta yatan katı destekten ayrılmasını kontrol edebilir13,14. Bu, polimer yastıkları olmayan katı substratlar üzerinde desteklenen lipit çift katmanlıtabakalara göre açıkça bir avantajdır 15,16, transmembran biyomolekülleri aktivitelerini kaybedebilir17,18,19. Daha da önemlisi, birçok membran işlemi için kritik olan hücre zarının kalabalık ortamını in vitro olarak özetlememizi sağlar.
Membranlar üzerindeki yüzey aşılı polimerler de aşılama yoğunluklarına bağlı olarak konfigürasyonlarında değişikliklere uğrar12. Düşük konsantrasyonlarda, membran yüzeyinin üzerinde, mantar olarak bilinen entropik olarak sarılmış bir konfigürasyonda kalırlar. Artan konsantrasyonla, etkileşime girmeye başlarlar ve açılma ve genişleme eğilimindedirler, sonunda membran21 üzerinde yoğun bir fırça benzeri oluşum sağlarlar. Mantardan fırça rejimine geçiş oldukça heterojen olduğundan ve polimerin kötü karakterize edilmiş koşullarında ortaya çıktığından, polimer aşılı membranlarda kalabalıklaşma için iyi karakterize edilmiş koşulların kullanılması önemlidir. Yakın tarihli bir çalışma20 ile karşılaştırıldığında, transmembran biyomoleküllerinin difüzif taşınımını ve aktivitesini koruyan kalabalık membran bileşimlerini tanımlamakta ve raporlamaktayız.
Bu protokolde, PEGile lipid membranlarının nasıl üretileceğini tartışıyoruz ve iki farklı polimer konfigürasyon rejiminde (yani, mantar ve fırça) kalabalığı taklit eden PEG yoğunlukları için önerilerde bulunuyoruz. Protokol ayrıca bu kalabalık membranlara gömülü moleküller için tek moleküllü bağlanma, parçacık izleme ve fotobeyazlatma veri toplama ve analizini de açıklar. İlk olarak, kapsamlı temizleme adımlarını, görüntüleme odasının montajını ve PEG-SLB'lerin oluşumunu açıklıyoruz. İkincisi, tek moleküllü bağlama, parçacık izleme ve fotobeyazlatma deneyleri için ayrıntılar sağlıyoruz. Üçüncüsü, i) nispi bağlanma afinitelerinin çıkarılmasını, ii) moleküler difüzyonun karakterize edilmesini ve iii) membran üzerindeki tek moleküllerin filmlerinden bir protein grubundaki alt birimlerin sayılmasını tartışıyoruz.
Bu sistemi tek moleküllü görüntüleme ile karakterize etmemize rağmen, protokol, kalabalıklaşmanın lipit membranları üzerindeki biyomoleküler reaksiyonlar üzerindeki etkisini anlamak isteyen tüm membran biyofizikçileri için yararlıdır. Genel olarak, kalabalık ve desteklenen lipit çift katmanları yapmak için sağlam bir boru hattı, bunlar üzerinde yürütülen çeşitli tek moleküllü testler ve ilgili analiz rutinleri sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>2.5 ml Şırıngalar</td><td>HMD Healthcare</td><td>Dispo Van, 2.5 ml Tüberkülin</td><td>Plastik şırınga</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Finar Kimyasallar</td><td>10020LL025</td><td></td></tr><tr><td>Akrilik Levha</td><td></td><td></td><td>2 mm kalınlığında</td></tr><tr><td>Akrilik Levha</td><td>BigiMall</td><td></td><td>2 mm,</td></tr><tr><td>Şeffaf Banyo Sonikatörü</td><td>Branson</td><td>CPX-1800</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma</td><td>528730</td> <td>ve nbsp; HPLC sınıfı</td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Avanti</td><td>700100</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Kavanoz</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>S6016</td><td>Cam Kapaklı 8 Sürgülü Kavanoz</td></tr><tr><td>Lameller</td><td>VWR</td><td>631-1574</td><td>24 mm X 50 mm</td></tr><tr><td>Cy3-DNA Strand</td><td>IDT</td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3</td></tr><tr><td>Siyanin Boyası (Cy3)</td><td>Cytiva Yaşam Bilimleri</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>İnvitrojen</td><td>D3911</td><td>Dil Boyası (1,1'-Dioktadesil-3,3,3',3'-Tetrametilindokarbosiyanin Perklorat ('DiI'; DiIC18(3))</td></tr><tr><td>)DNA Bağlayıcı Dizi 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T</td></tr><tr><td>DNA Bağlayıcı Dizi 2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT</td></tr><tr><td>DNA Tokoferol Zinciri</td><td>Biyomerleri</td><td></td><td>Toko-CCCAATGTGACCGACTGTGA</td></tr><tr><td>DOPE-PEG2000</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilen glikol)-2000] (amonyum tuzu)</td></tr><tr><td>Çift Taraflı Bant</td><td>3M</td><td>LF93010LE</td><td></td></tr><tr><td>Matkap Uçları (Elmas Kaplı)</td><td></td><td></td><td>0,5 - 1 mm</td></tr><tr><td>Delme Makinesi</td><td>Dremel</td><td>220</td><td>İş İstasyonu</td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Boncukları</td><td>Invitrogen</td><td>F10720</td><td></td></tr><tr><td>Cam Kaydıraklar</td><td>Mavi Yıldız</td><td></td><td>Mikro Slaytlar, PIC-1</td></tr><tr><td>Cam Şişeler</td><td>Sigma</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit</td><td>Lobachemie</td><td>00182</td><td>%30 Çözelti, AR Sınıfı</td></tr><tr><td>Labolene</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td></td><td>&nbsp; Deterjan</td></tr><tr><td>Lazer 532 nm</td><td>Tutarlı</td><td>Safir</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Kesici</td><td>Üniversal Lazer Sistemleri</td><td>ILS12.75</td><td></td></tr><tr><td>Lissamine Rhodamine DOPE</td><td>Avanti</td><td>810150</td><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(lissamine rodamin B sülfonil) (amonyum tuzu)</td></tr> <tr><td>Metanol</td><td>Finar Kimyasallar</td><td>30932LL025</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Tuzlu Su (PBS)</td><td></td><td></td><td>1X</td></tr><tr><td>Plazma Temizleyici</td><td>Harrick Plasma Inc</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti</td><td>850457</td><td>1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin</td></tr><tr><td>Programlanabilir Şırınga Pompası</td><td>Yeni Çağ Pompa Sistemleri</td><td>NE1010</td><td>Yüksek Basınçlı Şırınga Pompası</td></tr><tr><td>PTFE</td><td>Kapaklar Sigma</td><td>27141</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Boru</td><td>Cole-Parmer</td><td>WW-06417-21</td><td>Masterflex, 0.022 "ID x 0.042" OD</td></tr><tr><td>Sülfürik Asit</td><td>SD İnce Kimyasallar</td><td></td><td>%98, AR Sınıfı</td></tr><tr><td>TIRF Objektif</td><td>Olympus</td><td>UPLAPO100XOHR</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu Kurutucu</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorteks Karıştırıcı</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tek moleküllü difüzyon ve polimer kalabalık lipid membranlara montaj

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Hücresel membranlar, biyomoleküler reaksiyonlar ve sinyalizasyon için oldukça kalabalık ortamlardır. Bununla birlikte, lipitlerle protein etkileşimini araştıran çoğu in vitro deney, çıplak çift katmanlı membranlar kullanır. Bu tür sistemler, membrana gömülü proteinler ve glikanlar tarafından kalabalıklaşmanın karmaşıklığından yoksundur ve hücresel membran yüzeylerinde karşılaşılan ilişkili hacim etkilerini dışlar. Ayrıca, lipit çift katmanlarının oluştuğu negatif yüklü cam yüzey, transmembran biyomoleküllerinin serbest difüzyonunu önler. Burada, kalabalık lipid membranları için bir mimik olarak iyi karakterize edilmiş bir polimer-lipid membranı sunuyoruz. Bu protokol, polietilen glikol (PEG) konjuge lipitleri, crowder'ları desteklenen lipit çift katmanına (SLB) dahil etmek için genelleştirilmiş bir yaklaşım olarak kullanır. İlk olarak, tek moleküllü deneyler yapmak için mikroskobik slaytların ve örtülerin temizleme prosedürü sunulmuştur. Daha sonra, PEG-SLB'leri karakterize etme ve tek moleküllü izleme ve fotobeyazlatma kullanarak biyomoleküllerin bağlanması, difüzyonu ve montajının tek moleküllü deneylerini gerçekleştirme yöntemleri tartışılmaktadır. Son olarak, bu protokol, tek moleküllü fotobeyazlatma analizi ile kalabalık lipit membranları üzerinde bakteriyel gözenek oluşturan toksin Sitolisin A'nın (ClyA) nanopore montajının nasıl izleneceğini göstermektedir. Örnek veri kümelerine sahip MATLAB kodları, parçacık izleme, difüzyon davranışını ayıklama ve alt birim sayımı gibi bazı yaygın analizleri gerçekleştirmek için de dahil edilmiştir.

ClyA proteininin PEGile membranlara bağlanmasının izlenmesi Adım 4.5'ten sonra, bağlanma kinetiği, zaman içinde membran yüzeyine bağlanan parçacıkların sayısını çizerek tahmin edilir (Video 1). ClyA proteini% 5 mol% PEG2000 lipitli bir zara bağlandığında, parçacık yoğunluğu artar ve doygunluğa ulaşır (Şekil 5). Bağlı parçacıklara (camgöbeği daireleri) uyan üstel bir bozunum, membran bağlanması için zaman sabitini (τb) verir (özellikle, başlangı...

Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Hücresel membranlar, gömülü proteinlerin ve şekerlerin varlığı nedeniyle oldukça kalabalıktır. Sentetik kalabalık destekli lipid çift katmanlı üzerinde tek moleküllü görüntüleme gösteriyoruz. Bu platform, kalabalıklaşmanın membran biyomoleküler reaksiyonları üzerindeki etkisini moleküler düzeyde araştırmak için yararlıdır.Protokol, membran biyomoleküllerinin bağlanma, difüzyon ve montaj analizini açıklar. Deneydeki başarı, substratın titizlikle temizlenmesine, çift katmanın zarar görmesini önlemeye ve tek moleküllü görüntülemede yüksek sinyal-gürültü oranının korunmasına bağlıdır. Prosedürü benimle birlikte gösteren Aditya Upasani ve Vishwesh Haricharan Rai, laboratuvardan yüksek lisans öğrencileri.Plazma ile muamele edilmiş akrilik slaytı temiz doku kağıdına yerleştirerek başlayın. Çift taraflı lazer kesim bandını soyun ve slayda yapıştırın. Pipet ucu kullanarak, bir kanaldan diğerine sızıntıyı önlemek için bandı düzleştirin.Plazma ile işlenmiş kapak kaymasını bantlı kızağın üzerine yerleştirerek odayı kapatın. Bir pipet ucu kullanarak, kanalı suya sıkı tutmak için kapak kaymasını bantlı bölgelere hafifçe bastırın. Cam kaydıraklar kullanılıyorsa, epoksi reçine kullanarak kenarları kapatın.Hazırlanan mikroakışkan görüntüleme odalarını kurutulmuş koşullar altında bir ila iki hafta saklayın. Piranha çözeltisi kullanılarak önceden temizlenmiş bir cam şişe alın ve tamponu ekledikten sonra üç milimolar'ın son lipit konsantrasyonunu elde etmek için PEG 2000 lipitlerinin istenen mol fraksiyonuna POPC ve DOPE-PEG (2000) kloroform çözeltisi ekleyin. Benzer şekilde, lipitlerin diğer membran bileşimleri de hazırlanabilir.Daha sonra, kloroformu şişeden küçük bir girdap ile yumuşak bir azot akışı kullanarak kurutun, böylece istenen lipitler şişenin yüzeyinde düzgün bir şekilde kaplanır. Şişeyi bir saat boyunca vakumlu bir kurutucuda tutarak artık kloroformu çıkarın. Daha sonra şişeye bir mililitre PBS ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Gece boyunca inkübasyondan sonra, çözelti bulanık ve sütlü hale gelene kadar şişeyi bir ila iki dakika boyunca yavaşça vorteksleyin. Şimdi bu çözeltinin 100 mikrolitresini küçük bir 500 mikrolitrelik santrifüj tüpüne aktarın. 50 ila 100 nanometre çapında küçük unilamellar veziküller üretmek için, bir banyo sonikatöründe yaklaşık bir saat boyunca çözeltiyi sonikleştirin.Sonikasyonun sonunda çözüm netleşecektir, eğer çözelti hala bulanıksa, daha sonra 30 dakika daha sonikasyon yapın. Daha sonra lipit çözeltisinde 30 milimolar'lık son bir konsantrasyona soniklenmiş veziküllere kalsiyum klorür ekleyin. Numune çözeltisini deliğe sıkıca oturacak şekilde enjekte etmek için bir mikro pipet ucu kesin.Lipit çözeltisini karıştırın ve görüntüleme odasındaki deliklerden birinden enjekte edin. Bitişik kanalların kirlenmesini önlemek için odadan çıkıştan çıkan fazla çözeltiyi temiz bir mendille silin. Islak dokuyu 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünün sonuna yerleştirerek bir nemlendirme odası hazırlayın.Sürgüyü tüpe yerleştirin ve tüp kapağını kapatın. Tüpü yana doğru yerleştirin ve bu tertibatı nemlendirilmiş bir odada, 90 dakika boyunca, tercihen 37 santigrat derecede bir inkübatörde bırakın. Odayı bol miktarda PBS tamponu ile iyice yıkayın, yıkama sırasında hava kabarcıklarının odaya girmesini önleyin, çünkü bu membranda kusurlara neden olabilir.Hareketlilik ve montaj üzerine herhangi bir deney yapmadan önce, bir floresan boncuk örneği hazırlayarak ve bunları mikroakışkan kanala düşük konsantrasyonlarda ekleyerek TIRF mikroskobunu hizalayın, böylece tek boncuklardan floresan lekeler görüntülerde üst üste binmez. İlk olarak, boncukları epifloresan modunda görselleştirin. Aydınlatma epifloresan modundayken, bir çeviri aşamasında oturan M5 aynasını, nesnelden çıkan ışın toplam iç yansıma konfigürasyonu elde edilene kadar bükülecek şekilde hareket ettirin.TIR aydınlatmasının sağlanıp sağlanmadığını doğrulamak için, TIR kaçınma alanı boncuk numunesini aydınlatırken ve yüzeyden uzakta serbest yüzen boncuklar gözlenmediğinde yalnızca yüzeydeki boncukların görünür olduğunu kontrol edin. Deneyin başlangıcında, floroforların fotoğraf tahribatını önlemek için lazer gücünü objektif arka odak düzleminde beş ila 10 miliwatt'a ayarlayın. Slaytı mikroskop aşamasında tutun ve önce çıplak membrana odaklanın, lipit membranlarındaki küçük safsızlık izleri membranı görselleştirmek için yeterlidir.Mikro pipet kullanarak numuneyi PEG SLB kaplı görüntüleme odasına enjekte edin. Tek moleküllü bağlayıcı kinetiği ölçmek için, etiketli biyomolekülleri giriş deliklerinden mikroakışkan odasına dakikada 50 ila 500 mikrolitre akış hızında akıtmak için bir şırınga pompası kullanın. Saniyede 25 ila 50 kare hızında 5.000 kare kaydetmek için gerekli film alma parametrelerini ayarlayın.Film edinimine başlayın ve membran yüzeyinde yeni lekelerin ortaya çıkmasında daha fazla artış olana kadar şırınga pompasından sürekli akış altında 5.000'den fazla kare elde edin ve makalede açıklandığı gibi bağlayıcı kinetiği analiz edin. Tek parçacık takibi için, etiketli biyomolekülleri düşük konsantrasyonlarda bir mikro pipet kullanarak kanala ekleyin. Veri kümelerinden geri kazanılan izlerin yüksek doğrulukta olmasını sağlamak için, konsantrasyonu mikrometre kare başına 0,1 parçacıktan daha az bir yoğunluğa optimize edin, böylece tek tek parçacıklar nadiren yolları kesişir.Gerekirse, odayı nemlendirici bir ortamda inkübe edin ve görüntülemeden önce tamponla yıkayın. Tek parçacık yörünge analizi için, saniyede 10 ila 100 karede 200 ila 500 kare elde edin ve görüntü elde etme sırasında minimum aşama kayması ile objektif lensi çift katmanlı düzleme odaklanmış halde tutun. Alt birimleri ölçmek için, etiketli biyomoleküllerin ilgili konsantrasyonunu mikroakışkan görüntüleme odasına ekleyin ve slaytı gerekli süre boyunca istenen sıcaklıkta nemlendirici bir odada inkübe edin.Görüntülemeden önce, görüntüleme odasını bir tamponla yıkayın. Slaytı bir mikroskop üzerine yerleştirin ve etiketli molekülleri görselleştirmek için odağı ayarlayın. Lazer gücünü, floroforun ağartılmasının kademeli olarak gerçekleştiği bir seviyeye ayarlayın.Her bir birleştirilmiş kompleks için ideal olarak, foto ağartma adım hızını el yazmasında açıklandığı gibi 10 ila 20 kare arasında tutmak için lazer gücünü kontrol edin ve tüm moleküller tamamen foto ağartılana kadar görüntüleri elde edin. Numune hazneye girer girmez film edinimine başlayarak ve PEG SLB'nin farklı segmentlerinden membran bağlandıktan sonra sabit zaman aralıklarında yeni foto beyazlatma filmleri elde ederek zamana bağlı bir montaj ölçümü gerçekleştirin. Sitolisin A'nın lipit membranlarına yüzde beş mol DOPE-PEG (2000) ile bağlanması, partikül yoğunluğunun arttığını ve doygunluğa ulaştığını göstermiştir.Bağlı parçacıklara uyan üstel bir bozunma fonksiyonu, Sitolisin A membran bağlanması için zaman sabiti verir. Membranda herhangi bir PEG polimeri olmadan, çoğu izleyici SLB'ler üzerinde sınırlı difüzyon gösterdi. membran çift katmanındaki küçük PEG 2000 seviyeleri, altta yatan yüzeyden kaldırılarak izleyici moleküllerinin yüzey kısıtlamaları olmadan dağılmasına izin verdi.Bununla birlikte, çift katmanlı membranda yüksek konsantrasyonda aşırı hapsolma gözlenir. İki farklı PEG 2000 lipid membranında lipofilik DNA izleyicinin difüzyonu için ISD2 dağılımı, yüksek konsantrasyonlarda PEG'de azalmış hareketlilik göstermiştir. Kalabalık lipid çift katmanlı membran üzerinde inkübe edildikten sonra Sitolisin A, çeşitli montaj ara ürünlerinin oluşumunu öneren birçok farklı foto beyazlatma adımı sergiledi.Etiketleme verimliliğini düzelttikten sonra, oligomerlerin son dağılımı baskın yapı olarak dodecamerik Cytolysin A türlerini gösterdi. Membran protein bağlama tertibatı ve diğer reaksiyonlar uygun membran kalabalık ortamlarında yapılmalıdır. Görüntüleme odasını temizlemeye, çift katmanı bozmaktan kaçınmaya ve TIRF mikroskobunun kurulmasına dikkat edilmelidir.

single-molecule-diffusion-assembly-on-polymer-crowded-lipid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bir depolanabilir, taşınabilir lipit iki katmanlı oluşum sistemi göstermektedir. Dondurulmuş bir membran ön-madde çevre sıcaklığına getirildiğinde bir lipid iki-tabakalı zar üzerinden% 80 başarı oranı ile 1 saat içinde oluşturulabilmektedir. Bu sistem iyon kanalları ile ilişkili zahmetli süreçler ve uzmanlık azaltacaktır.

Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu

sentez ve tek molekül düzeyinde halkalı polimerlerin uzadıya hareket karakterizasyonu için bir protokol sunulmuştur.

Tek Molekül Düzeyde Halkalı Polimerlerin Sentezi ve eritin Devlet Onların Pasif Hareket Karakterizasyonu

Biz bir sıvı lipid iki katmanının çevrili nanometrik protein yamaları ile cam fonksiyonel hale getirilmesi için bir protokol mevcut. Bu alt tabakalar gelişmiş optik mikroskop ile uyumludur ve hücre yapışması ve göç çalışmaları için platform olarak hizmet etmesi beklenmektedir.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.

Elastin benzeri Proteinlerin tanımlanmış Supramoleküler Yapılara Yönlendirilmiş Montajı ve Tüp Bebek Tespülasyonu

Mitokondriyal füzyon mitokondriyal dinamiğin altında yatan önemli bir homeostatik reaksiyondur. Burada açıklanan bir in vitro reconstitution sistemi membran tethering çözebilir mitokondriyal iç membran füzyon çalışması, yerleştirme, hemifüzyon, ve gözenek açılması. Hücre zarı sistemlerinin araştırılmasında bu yaklaşımın çok yönlülüğü tartışılmıştır.

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Hücresiz resusyon, sitoiskelet düzeneğini anlamak için önemli bir araç olmuştur ve son on yıldaki çalışmalar, septin dinamiklerini minimal sistemlerde incelemek için yaklaşımlar oluşturmuştur. Burada septin montajını farklı membran bağlamlarında gözlemlemek için üç tamamlayıcı yöntem sunulmaktadır: düzlemsel çift katmanlılar, küresel destekler ve çubuk destekleri.

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Mevcut protokol, biyouyumlu lipozomlar üretmek için mikroakışkan bir teknik olan oktanol yardımlı lipozom montajını (OLA) tanımlamaktadır. OLA, verimli kapsülleme ile monodispersed, mikron boyutunda lipozomlar üretir ve anında çip üzerinde deneylere izin verir. Bu protokolün sentetik biyoloji ve sentetik hücre araştırmaları için özellikle uygun olması beklenmektedir.

Biyomühendislik için On-Chip Oktanol Destekli Lipozom Montajı

Öğrenin smTIRF mikroskobisi kullanarak kalabalık destekli lipid çift katmanlarında tek molekül görüntüleme yöntemini. Bu protokol, membran biyomoleküllerinin bağlanma, difüzyon ve montajını analiz ederek kalabalık ortamlardaki moleküler etkileşimleri incelemenizi sağlar.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Daha fazla video keşfet