Model Nematod Caenorhabditis elegans'ın Doğal Mikrobiyotasının İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, C.elegans'ın doğal mikrobiyotasına yeni bakış açıları sağlar. Aynı zamanda, izole edilmiş mikroplar, mikrobiyota-konakçı etkileşimlerini ve C.elegans biyolojisini karakterize etmek için kontrollü laboratuvar deneylerinde kullanılabilir. Bu protokol, C.elegans ile ilişkili mikropları doğada izole etmeye odaklanır, bu nedenle bu önemli model konağın biyolojisini daha doğal bir bağlamda anlamak için anahtardır.

Caenorhabditis'in diğer nematodlara kıyasla görünümüne aşina olmak yararlı olacaktır. Diseksiyon kapsamında pipetleme başlangıçta zor olabilir, ancak pratik yapmak yardımcı olacaktır. Kompost veya çürümüş meyveler gibi çevresel örnekleri ayrı plastik torbalarda, tüplerde veya temiz kaplarda toplayarak başlayın.

Toplanan çevresel örneklerin parçalarını steril dokuz santimetre boş bir Petri kabına eşit olarak yayın ve numuneyi ortamla örtmek için yaklaşık 20 mililitre steril viskoz ortam ekleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, Caenorhabditis elegans ve ilgili nematodların izole edilmesine ilişkin yönergeleri izleyerek Caenorhabditis nematodlarını araştırın. 20 ila 100 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, Caenorhabditis nematodlarını içeren mümkün olan en az miktarda sıvıyı plakadan toplayın ve bir ila üç mililitre steril M9T içeren üç santimetrelik Petri kabına aktarın.

Bir solucan popülasyonu oluşturmak için, bireysel solucanlar bir nematod büyüme ortamı veya NGM içeren bir plakaya aktarılabilir. Nematodları yıkamak ve nematodların dışında bulunan mikropları çıkarmak için, bunları 10 ila 15 dakika boyunca M9T'de inkübe edin. Nematodları içeren mümkün olan en az miktarda sıvıyı pipetle çıkarın ve bir ila üç mililitre taze M9T içeren yeni bir steril üç santimetre Petri kabına aktarın.

Nematodla ilişkili mikropların tarafsız bir şekilde tanımlanması için, bir milimetre çapında yaklaşık üç steril boncuk içeren bir 96 kuyu plakası hazırlayın ve kuyu başına 19.5 mikrolitre PCR tamponu ve 0.5 mikrolitre proteinaz K karışımı ekleyin. Tek bir yıkanmış nematodu mümkün olduğunca az sıvı ile her bir kuyucuğa aktarın. Aktarılan nematodları 30 hertz'de üç dakika boyunca bir boncuk homojenizatörü kullanarak parçalayın ve sıvıyı tabana almak için plakaları veya tüpleri oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 8.000 G'de santrifüj edin.

C.elegans'ı tanımlamak için, bireysel nematodların DNA'sını izole etmek için bir PCR sikletöründeki örnekleri 50 santigrat derecede bir saat ve 95 santigrat derecede 15 dakika ısıtın veya solucan popülasyonlarının DNA'sını izole etmek için ticari kitler kullanın. Uzun süreli depolama için izole edilmiş DNA'yı eksi 20 santigrat derecede dondurun. DNA ve primer çifti NLP 30 ileri ve NLP 30 ters kullanın ve 154 baz çifti PCR ürünü üretin.

Bakterileri izole etmek için, yaklaşık üç steril bir milimetre boncuk, kuyu başına 20 mikrolitre M9 tamponu içeren 96 delikli bir plaka hazırlayın ve her bir kuyucuğa mümkün olduğunca az sıvı içeren tek bir yıkanmış nematod pipetin. Bir boncuk homojenizatörü kullanmadan önce gösterildiği gibi nematodları parçalayın, ardından sıvıyı tabana almak için plakanın kısa bir santrifüjlenmesi izleyin. Tamamlandığında, süspansiyonu toplayın ve seri olarak bir ila 10 oranında seyreltin.

Seyreltilmiş süspansiyonun 100 mikrolitresine kadar dokuz santimetrelik agar plakalarına kadar plaka. Daha sonra plakaları 24 ila 48 saat boyunca 15 ila 20 santigrat derecede inkübe edin. Saf bakteri kültürünü elde etmek için, steril bir döngü veya kürdan kullanarak inkübe edilmiş plakadan tek bir koloni seçin ve saflaştırma sırasında kullanılan aynı agar ortamını içeren yeni bir agar plakasına çizin.

Plakanın sadece 1 / 3'ünü kullandığınızdan emin olun. Daha sonra yeniden kullanılabilir bir döngüyü sterilize edin veya yeni bir steril döngü kullanın ve numune plakasının başka bir 1/3 kısmında ikinci bir çizgi oluşturmak için ilk çizgi boyunca sürükleyin. İkinci çizgi boyunca bir döngü sürükleyerek ve tek koloni büyümesini sağlamak için üçüncü çizgiyi oluşturarak tekrarlayın.

Plakayı izolasyon için kullanılan aynı büyüme koşulları altında inkübe edin ve gerekirse saflaştırma adımını tekrarlayın. Saf kolonileri aynı sıcaklık ve büyüme koşullarını kullanarak sıvı bir ortamda büyütün. Daha sonra, bakteri DNA'sını saf sıvı kültürlerden çıkararak, 27 ileri ve 1495 ters primer kullanarak 16S ribozomal RNA'yı yükselterek ve PCR'yi metinde açıklandığı gibi gerçekleştirerek bakterileri karakterize edin.

Toplanan meyve ve kompost örnekleri Petri kaplarına dağıtıldığında ve sıvı veya viskoz bir ortama batırıldığında, solucanların substrat malzemesini terk etmesine ve ortamın yüzeyine yüzmesine neden oldu. Mikroplar saf tek koloniler olarak izole edildi ve saflaştırma, bazı C.elegans ile ilişkili bakterilerin biyofilmler oluşturabilmesi veya kolayca toplanabilmesi ve çok türlü kültürlerle sonuçlanması nedeniyle önemli bir rol oynadı. C.elegans'a özgü primerleri, yani NLP 30 ileri ve NLP 30 geri kullanan PCR, C.elegans için 154 baz çifti ürününün amplifikasyonu ile sonuçlandı.

Tek solucanlardan izole edilen DNA, zayıf PCR bantlarıyla sonuçlanırken, en az 50 solucandan oluşan solucan popülasyonlarından DNA ekstraksiyonu daha büyük miktarda ve daha net bantlar verdi. C.elegans'a özgü PCR'nin başarısı, bir laboratuvar suşunun DNA'sının, yani N2'nin, izole nematodların DNA'sı ile eşzamanlı olarak pozitif bir kontrol olarak çalıştırılmasıyla doğrulandı Mikroplar her yerdedir. Bu nedenle, izole edilen mikropların doğadaki solucanla gerçekten ilişkili olmasını sağlamak için steril koşullar altında çalışmak esastır.

İzole mikroplar, konakçı-mikrobiyota etkileşimlerini veya mikropların konakçı biyolojisi üzerindeki rolünü, örneğin kontrollü laboratuvar deneylerinde yaşlanma, gelişme veya bağışıklığı incelemek için kullanılabilir. Bu teknikle izole edilen mikroplar şu anda C.elegans topluluğu tarafından konakçı uygunluğu veya mikropların bağışıklık üzerindeki rolü hakkındaki mikrobiyota çeşitliliğinin anlaşılmasını geliştirmek için kullanılmaktadır.