Name: Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde açlığa bağlı otofajinin analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Öğrenin, Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde amino asit tükenmesiyle açlığa bağlı otofajiyi nasıl indükleyeceğinizi ve mutant klonlar arasındaki farkları GFP-Atg8a ile analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sinek suşlarını sağladıkları için THFC ve BDSC'ye minnettarız. Dr. Tong Chao, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32030027, 91754103, 92157201) ve merkezi üniversiteler için Temel araştırma fonları tarafından desteklenmektedir. Yaşam Bilimleri Enstitüsü'ndeki (LSI) çekirdek tesise hizmet verdiği için teşekkür ederiz.

1. Drosophila geçişi ve yumurtlama
<ol><li>Çiftleşme için 3 erkek (genotip hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) ve 15 dişi (genotip y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP ) yetişkin sinekleri (bakınız Malzeme Tablosu) çiftleşme için bir kültür şişesine (25 ° C'de standart mısır unu / pekmez / agar Drosophila ortamı ile) koyun. NOT: Daha sonraki deneyler için yeterli larva sağlamak için aynı haçtan oluşan çoklu kültür şişeleri kurulmalıdır. Genotip hsFLP ubiRFP FRT19A ile erkek sinek suşu; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a, sentromerin (FRT19A) yakınındaki X kromozomunda bir FRT bölgesi taşır. Ayrıca 37 ° C'de ısı şoku üzerine FLP'yi ifade eder. Her yerde bulunan RFP ekspresyonuna sahip bir transgen, X kromozomuna yerleştirilir. GFP-Atg8a, larva yağ gövdesinde cgGal4 kontrolü altında eksprese edilir22. Genotip y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP ile dişi sinek suşu, X kromozomu üzerinde ölümcül bir mutasyon (Mu) ve FRT19A taşır. Ayrıntılı geçiş şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.</li>
	<li>Yumurtlama için, sinekleri yeni bir kültür şişesine aktarın. Giriş sonrası 48 saatte, sinekler sersemletilene kadar "çiftleşme" şişesine dokunun ve şişenin tabanındaki ortama bırakın.<ol><li>"Çiftleşme" şişesinin fişini çekin ve ağzını taze medya (taze kültür şişesi) ile fişi çekilmiş ters çevrilmiş bir şişe ile kapatın. Ardından, şişeleri çevirip dokunarak sinekleri taze kültür şişesine aktarın.</li>
		<li>Taze kültür şişesini (aktarılan sineklerle birlikte) takın ve eski kültür şişesini atın. Bu taze kültür şişesini, taze ortama yumurtlamak için 25 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. NOT: Sinek transfer işleminden önce taze kültür şişelerinin 15 dakika boyunca 25 ° C'ye ısıtılması, sineklerin yeni ortama hızlı bir şekilde adapte olmalarına ve yumurtlamayı hızlandırmalarına yardımcı olacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>6 saatlik yumurtlamadan sonra sinekleri çıkarın. Deneylerin tekrarlanması gerekiyorsa, bu sinekleri başka bir kültür şişesine aktarın (adım 1.2'de açıklandığı gibi). Aksi takdirde, sinekleri% 75 etanol içeren bir şişeye atarak atın).<ol><li>FLP ekspresyonunu indüklemek için şişeyi embriyolarla 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, onları 25 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve embriyoların gelişmeye devam etmesine izin verin. NOT: Mutant klonların başarılı oluşumu daha sonra görüntüleme yoluyla doğrulanabilir. RFP sinyallerinin yokluğu mutant klonları işaretler.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Amino asit açlığı otofajiyi indükler
<ol><li>Bir laboratuvar spatulası kullanarak, gelişmekte olan larvaları içeren ortamı, yumurtlamadan 75 saat sonra bir Petri kabına alın. Yemeğe 3 mL 1x PBS ekleyin ve uzun forseps kullanarak kültür ortamını ve larvaları yavaşça ayırın. 10 ila 15 erken üçüncü instar larvasını seçin. NOT: Erken üçüncü instar larvalarının dikkatlice seçilmesi gerekir. Larvaların gelişim aşaması bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. Kısıtlı yumurtlama süresi nedeniyle, kültür şişesindeki larvaların çoğunun 75 saatlik inkübasyonla erken üçüncü instar aşamasında olması beklenir. Bununla birlikte, farklı kültür ortamı tarifleri larvaların gelişimsel zamanlamasında değişikliklere yol açabilir. Erken üçüncü instar larvalarını ayırt etme kriterleri vücut uzunluğu, ön ve arka spiracles varlığı ve ağız aparatının mandibuler kancalarıdır23.</li>
	<li>9 delikli cam çöküntü spot plakasının kuyucuklarını 1x PBS ile doldurun ( bkz. Ayrılmış üçüncü instar larvalarını uzun forseps kullanarak kuyucuklara yerleştirin ve tüm ortam kalıntılarını gidermek için larvaları iyice yıkayın.</li>
	<li>Boş bir şişede 5 mL% 20 sakkaroz (1x PBS'de) çözeltisi alın ve temiz üçüncü instar larvalarını uzun forseps kullanarak bu çözeltiye yerleştirin. Bu şişeyi, diseksiyon için hasat etmeden önce 6 saat boyunca 25 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin. NOT: % 20 sakkaroz (1x PBS'de) çözeltisi, amino asit eksikliği olan açlık ortamı olarak işlev görür.</li>
</ol>3. Üçüncü instar larva diseksiyonu ve örnek doku işleme
<ol><li>İki çift # 5 forseps ( Malzeme Tablosuna bakınız) her iki tarafta da bir bileme taşı ile eşit şekilde keskinleştirin.</li>
	<li>9 delikli cam çöküntü spot plakasının her bir kuyucuğuna 400 μL 1x PBS ekleyin ve larvaları uzun forsepslerle kuyucuklara aktarın. Bir larvayı dorsal tarafı (trakealı taraf) yukarı bakacak şekilde bir kuyuya yerleştirin.<ol><li>Larva gövdesinin ortasındaki iki # 5 forseps ile larva kütikülünü tutun ve tırnak etlerini yavaşça yırtın. Maruz kalan yağ gövdeleri, diğer larva iç dokuları ile birlikte, larvaların karkasına hala bağlanacaktır. İç organları mümkün olduğunca açığa çıkaracak kadar çekin. Tüm larvalar için bu adımı tekrarlayın. NOT: Her larva vücut gövdesi boyunca iki büyük yağ gövdesine sahiptir. Yağlı vücut dokusu, diseksiyon mikroskobu24 altında kolayca ayırt edilebilen beyaz, opak ve düz bir tek katmanlıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Larva karkası, 500 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpleri sallamadan 25 ° C'de 30 dakika inkübe edin. DİKKAT: %4 PFA toksiktir. Koruma için eldiven ve maske takın. NOT: 1x PBS arabelleğinde %4 PFA hazırlanması önerilir. PFA tozu anında 1x PBS'de çözünmez. Bu nedenle, karışım gece boyunca bir inkübatörde 65 ° C'de inkübe edilmeli veya 25 ° C'de 45 dakika aralıklı olarak çalkalanmalıdır.</li>
	<li>Karkasın %4 PFA ile 30 dakikalık inkübasyonundan sonra, PFA çözeltisini pipetleyin, tüpe 500 μL 1x PBS ekleyin ve 1x PBS çözeltisini atmadan önce tüpü düz bir rotatörde 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayın (3x'i tekrarlayın).</li>
	<li>Uzun forseps kullanarak, sabit ve yıkanmış larva karkasını, 1x PBS ile doldurulmuş 9 çöküntülü nokta plakasındaki bir kuyuya aktarın. # 5 forseps kullanarak, tüm yağ olmayan vücut dokularını çıkarın.</li>
	<li>Yağ gövdesinin parçalarını, montaj ortamı olarak% 80 gliserol kullanarak bir mikroskop slaydına monte etmek için # 5 forseps kullanın ve üstüne bir kapak kayması yerleştirin. NOT: GFP sinyalini korumak için monte etmeden önce, %80 gliserolün pH'ını kontrol edin (pH kağıtları kullanarak, pH = 7 en uygunudur). % 80 gliserol içinde DAPI ile montaj ortamı (bakınız Malzeme Tablosu), yağ vücut hücrelerinin çekirdeklerinin görüntülenmesinde yardımcı olacaktır. Bu slaytlar karanlıkta 4 °C'de saklandığında 1 hafta boyunca stabildir.</li>
</ol>

<ol><li>Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+Molecular+machinery+for+self-eating%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autophagy: Molecular machinery for self-eating.</a> Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).</li>
<li>Jin, S., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cancer%3A+Management+of+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress.</a> Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).</li>
<li>Yang, Z., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eaten+alive%3A+A+history+of+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eaten alive: A history of macroautophagy.</a> Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).</li>
<li>Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagosome%3A+Origins+unknown%2C+biogenesis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).</li>
<li>Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagosomes%2C+phagosomes%2C+autolysosomes%2C+phagolysosomes%2C+autophagolysosomes...Wait%2CI%27mconfused%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused.</a> Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+autophagy+proteins-Diversification+in+eukaryotes+and+potential+ancestors+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).</li>
<li>Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+regulation+of+starvation-induced+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body.</a> Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+import+regulates+cytosolic+protein+homeostasis+and+neuronal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity.</a> Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).</li>
<li>Ichimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin-like+system+mediates+protein+lipidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin-like system mediates protein lipidation.</a> Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).</li>
<li>Rusten, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body+is+induced+by+ecdysone+through+regulation+of+the+PI3K+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway.</a> Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).</li>
<li>Nishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Atg5%2FAtg7-independent+alternative+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy.</a> Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).</li>
<li>Ravikumar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammalian+autophagy+in+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).</li>
<li>Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+controls+phagophore+expansion+during+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).</li>
<li>Shintani, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+proteins+facilitate+the+formation+of+transport+vesicles+in+the+cytoplasm+to+vacuole+targeting+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).</li>
<li>Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+regulation+by+nutrient+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Autophagy regulation by nutrient signaling.</a> Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).</li>
<li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+and+why+to+study+autophagy+in+Drosophila%3A+It%27s+more+than+just+a+garbage+chute%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute.</a> Methods. 75, 151-161 (2015).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li>
<li>Senecoff, J. F., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directionality+in+FLP+protein-promoted+site-specific+recombination+is+mediated+by+DNA-DNA+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).</li>
<li>Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis in Drosophila.</a> Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).</li>
<li>Zappia, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F%2FDp+inactivation+in+fat+body+cells+triggers+systemic+metabolic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes.</a> eLife. 10, 67753(2021).</li>
<li>Demerec, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDemerec%2C+M+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).</li>
<li>Rizki, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+fat+body+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux%27s+Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval fat body surfaces.</a> Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).</li>
<li>Szeto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALIS+are+stress-induced+protein+storage+compartments+for+substrates+of+the+proteasome+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy.</a> Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Renna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+inducers+of+autophagy+that+enhance+the+clearance+of+mutant+proteins+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+RNA+interference+screen+identifies+genes+that+regulate+autophagy+at+different+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages.</a> Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).</li>
<li>Tian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+for+analysis+of+autophagy+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An antibody for analysis of autophagy induction.</a> Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).</li>
<li>Nezis, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy in Drosophila.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 146767(2012).</li>
<li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+materials+for+monitoring+mitochondrial+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology.</a> Materials. 14 (15), 4180(2021).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Mevcut protokol, (1) larva yağ cisimlerinde mutant klonlar taşıyan sinekler üretmek, (2) amino asit açlığı yoluyla otofajiyi indüklemek ve (3) larva yağ cisimleri diseke etmek için yöntemleri açıklamaktadır. Larva yağ gövdelerinde klonları başarılı bir şekilde üretmek için, aşağıdaki kritik adımların özenle gerçekleştirilmesi gerekir. (1) Isı şokunun doğru bir şekilde zamanlaması çok önemlidir, çünkü mitotik rekombinasyon sadece doku mitoz geçirdiğinde gerçekleşir ve (2) hem ısı şoku sıcaklığı hem de süresi FLP ekspresyo...

Otofaji, amino asit açlığı1 dahil olmak üzere çeşitli streslerin neden olduğu "kendi kendine yeme" sürecidir. Makrootofaji (bundan böyle otofaji olarak anılacaktır) en iyi çalışılmış otofaji türüdür ve hücresel homeostazın korunmasında yeri doldurulamaz bir rol oynar2. Otofajinin arızalanması çeşitli insan hastalıkları ile ilişkilidir3. Ek olarak, otofaji ile ilişkili bazı genler çeşitli hastalıkların tedavisinde potansiyel hedeflerdir4. 
Otofaji son derece sofistike bir şekilde düzenlenir5. Açlıktan öldükten sonra, izolasyon membranları çift membranlı otofagozomlar oluşturmak için sitoplazmik materyalleri ayırır6. Otofagozomlar daha sonra amfizomlar ve otolizozomlar oluşturmak için endozomlar ve lizozomlarla kaynaşır. Lizozomal hidrolitik enzimlerin yardımıyla, yutulan sitoplazmik içerikler parçalanır ve besinler geri dönüştürülür7. 
Otofaji evrimsel olarak korunmuş bir süreçtir8. Drosophila melanogaster, in vivo otofaji sürecini incelemek için harika bir modeldir. Amino asit açlığı, insan karaciğeri ve yağ dokusunun bir analoğu olan sinek yağ vücut dokusunda otofajiyi kolayca indükler9. Otofajideki kusurlar, diğerlerinin yanı sıra Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 ve p62 gibi otofaji ile ilişkili çeşitli proteinlerin farklı punkta paternlerini bozar10. Bu nedenle, bu otofaji belirteçlerinin paternlerini analiz etmek, otofaji defektlerinin oluşumunu ve kusurlu otofaji basamağını ayırt etmeye yardımcı olacaktır. Örneğin, ubikitin benzeri protein Atg8, en yaygın kullanılan otofaji belirteci11'dir. Drosophila melanogaster'de, yeşil floresan protein (GFP) etiketli Atg8a içeren transgenik suşlar başarıyla geliştirilmiştir12. GFP-Atg8a, beslenen hücrelerdeki sitosol ve çekirdeklerde yayılır. Açlıktan ölmek üzere, GFP-Atg8a fosfatidiletanolamin (PE) tarafından işlenir ve modifiye edilir ve izolasyon membranlarını ve tamamen gelişmiş otofagozomları13,14 etiketleyen punkta oluşturur. Doğrudan floresan mikroskopi ile otofaji indüksiyonu, GFP-Atg8 punkta oluşumu15'te bir artış olarak kolayca gözlemlenebilir. Atg8a puncta, otofaji başlatma defekti varlığında açlığa yanıt olarak oluşmaz. GFP-Atg8a, otolizozomlardaki düşük pH ile söndürülüp sindirilebildiğinden, otofaji geç evrelerde16'da bloke edilirse, GFP-Atg8a puncta sayıları artabilir.
Otofaji beslenme mevcudiyetine karşı oldukça hassas olduğu için17, kültür koşullarındaki küçük farklılıklar genellikle fenotiplerde farklılıklara yol açar. Bu nedenle, aynı dokudaki vahşi tip kontrol hücrelerine karşı mutant hücreleri analiz eden bir yöntem olan klonal analiz, otofaji defektlerinin diseksiyonunda büyük bir avantaja sahiptir18. Homolog kromozomlar arasındaki flippas / flippase tanıma hedefi (FLP / FRT) aracılı bölgeye özgü rekombinasyondan yararlanarak, mozaik dokuları taşıyan sinekler kolayca19,20 yapılır. Mutant hücreleri çevreleyen vahşi tip hücreler, bireysel farklılıkları önlemek için mükemmel bir iç kontrol oluşturur21.
Bu çalışma, amino asit açlığı ile otofajinin nasıl indükleneceğini ve GFP-Atg8a eksprese eden mozaik yağ vücut dokularının nasıl üretileceğini açıklamaktadır. Bu protokoller, mutant klonlar arasındaki otofajideki farklılıkları analiz etmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr> <tr><td># 5 Forseps</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>9 Pansuman Spot plaka</td><td>PYREX</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sangon Biyoteknoloji</td><td>A100854-0100</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Biyoteknoloji</td><td>A610440-0500</td><td>1x PBS çözeltisinin bileşimi</td></tr><tr><td>KH2PO 4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600445-0500</td><td>1x PBS çözeltisinin bileşimi</td></tr><tr><td>Laboratuvar spatulası</td><td>Fisher</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>Uzun forseps</td><td>R' DEER</td><td>RST-14</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kapak camı</td><td>CITOTEST</td><td>80340-1130</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>CITOTEST</td><td>80302-2104</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>1x PBS çözeltisinin bileşimi</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>1x PBS çözeltisinin bileşimi</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Standart mısır unu / pekmez / agar sinek yemi</td><td></td><td></td><td>Maşa Laboratuvarı Stereo</td></tr><tr><td>mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd.</td><td></td><td></td>10021418</tr><tr>DAPI <td>Vectorlabratory</td><td>H-1200-10</td><td>ile Vectashield antifade montaj ortamı</td><td>Önerilen montaj ortamı</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Fly stokları<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>y'w* Iso FRT19A</td><td></td><td></td><td>Tong Lab'ın sinek stokları</td></tr><tr><td>y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP</td><td></td><td></td><td>Tong Lab'ın sinek stokları</td></tr><tr><td>y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP</td><td></td><td></td><td>Tong Lab'ın sinek stokları</td></tr><tr><td>hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a</td><td></td><td></td><td>Tong Lab'ın sinek stokları</td></tr></tbody></table>

drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde açlığa bağlı otofajinin analizi

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Otofaji, hücresel bir kendi kendine sindirim sürecidir. Açlık da dahil olmak üzere çeşitli streslere yanıt olarak bozunma için lizozomlara kargo gönderir. Otofajinin arızalanması yaşlanma ve çoklu insan hastalıkları ile ilişkilidir. Otofaji makinesi, mayadan insanlara kadar yüksek oranda korunmaktadır. Omurgalı karaciğeri ve yağ dokusu için bir analog olan Drosophila melanogaster'in larva yağ gövdesi, in vivo otofajiyi izlemek için benzersiz bir model sağlar. Otofaji, larva yağ gövdesindeki besin açlığı ile kolayca indüklenebilir. Otofaji ile ilişkili genlerin çoğu Drosophila'da korunur. Etiketli otofaji belirteçlerini ifade eden birçok transgenik sinek suşu geliştirilmiştir, bu da otofaji sürecindeki farklı adımların izlenmesini kolaylaştırır. Klonal analiz, aynı doku parçasında farklı genotiplere sahip hücrelerdeki otofaji belirteçlerinin yakından karşılaştırılmasını sağlar. Mevcut protokol, (1) larva yağ gövdesinde somatik klonlar üretmek, (2) amino asit açlığı yoluyla otofajiyi indüklemek ve (3) larva yağ gövdesini diseke etmek, otofaji farklılıklarını bir otofagozom belirteci (GFP-Atg8a) ve klonal analiz kullanarak analiz etmek için bir model oluşturmayı amaçlayan prosedürleri detaylandırmaktadır.

Beslenen koşullar altında, GFP etiketli ubikitin benzeri protein, GFP-Atg8a, hücrelerin içine yayılır. Açlıktan öldüğünde, yeşil punkta oluşturur ve otofagozomları etiketler. Otofagozomlar lizozomlarla kaynaştığında, GFP asidik otolizozomlarda söndürülür ve yeşil punkta kaybolur. Otofaji indüklenmezse veya otofagozom olgunlaşması hızlanırsa, GFP punkta sayısının düşük olması beklenir. Bununla birlikte, otofagozomlar ve lizozomlar arasındaki füzyon bloke edilirse veya otolizozomun pH'ı bazik hale gelirse, GFP punktasının ...

Bu protokol, Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde otofajinin besin tükenmesi yoluyla indüklenmesini açıklamakta ve transgenik sinek suşlarını kullanarak otofajideki değişiklikleri analiz etmektedir.

Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde açlığa bağlı otofajinin analizi

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Bu protokol, Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde amino asit tükenmesi yoluyla otofajinin nasıl indükleneceğini ve mutant klonlar arasındaki otofajideki farklılıkların nasıl analiz edileceğini açıklar. Otofaji, kültür koşullarında beslenme mevcudiyetine karşı oldukça hassas olduğundan, aynı dokudaki vahşi tip hücrelere karşı mutant hücreleri analiz eden bir yöntem olan klonal analiz, otofaji defektlerinin diseksiyonunda bir avantaja sahiptir. Üç erkek ve 15 dişi yetişkin sineği, çiftleşme için 25 santigrat derecede standart mısır unu veya pekmez veya agar Drosophila media içeren bir kültür şişesine sokarak başlayın.İndüksiyondan 48 saat sonra, sinekler sersemleyene kadar çiftleşme şişesine dokunun ve şişenin tabanındaki ortamın üzerine bırakın. Çiftleşme şişesinin fişini çekin ve ağzını taze medya ile fişi çekilmiş ters çevrilmiş bir kültür şişesi ile kapatın. Ardından, sinekleri taze kültür şişesine aktarmak için şişeleri çevirin ve dokunun.Taze kültür şişesini takın ve eski şişeyi atın. Taze kültür şişesini, taze ortama yumurtlamak için 25 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Altı saatlik yumurtlamadan sonra sinekleri çıkarın ve% 75 etanol içeren bir şişeye atarak sinekleri atın.Flippase ekspresyonunu indüklemek için şişeyi embriyolarla 37 santigrat derecelik bir su banyosunda bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, onları 25 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin ve embriyoların gelişmeye devam etmesine izin verin. Bir laboratuvar spatulası kullanarak, gelişmekte olan larvaları içeren ortamı, yumurtlamadan 75 saat sonra bir Petri kabına alın.Yemeğe 1X PBS ekleyin ve uzun forseps kullanarak kültür ortamını ve larvaları yavaşça ayırın. Sonra 10 ila 15 erken üçüncü instar larvasını seçin. Dokuz kuyucuklu bir cam çöküntü spot plakasının kuyularını 1X PBS ile doldurun ve ayrılmış üçüncü instar larvalarını uzun forseps kullanarak kuyucuklara yerleştirin.Tüm ortam kalıntılarını gidermek için larvaları iyice yıkayın. Boş bir şişeye beş mililitre% 20 sakkaroz çözeltisi alın ve temiz üçüncü instar larvalarını uzun forseps kullanarak bu çözeltiye yerleştirin. Bu şişeyi, diseksiyon için hasat etmeden önce altı saat boyunca 25 santigrat derecelik bir inkübatörde inkübe edin.Dokuz kuyucuklu cam çöküntü spot plakasının her bir kuyucuğuna 1X PBS ekleyin ve larvaları uzun forsepslerle kuyucuklara aktarın. Bir larvayı sırt tarafı yukarı bakacak şekilde bir kuyuya yerleştirin. Larva gövdesinin ortasındaki iki 5 forseps ile larvaların kütikülünü tutun ve tırnak etlerini yavaşça yırtın.Maruz kalan yağ gövdeleri, diğer larva iç dokuları ile birlikte, larvaların karkasına hala bağlanacaktır. İç organları mümkün olduğunca açığa çıkaracak kadar çekin. Tüm larvalar için bu adımı tekrarlayın.Larva karkası, 500 mikrolitre% 4 PFA içeren 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpleri sallamadan 25 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra PFA çözeltisini pipetleyin. Tüpe 500 mikrolitre 1X PBS ekleyin.Tüpü düz bir rotatör üzerinde 10 dakika boyunca yavaşça çalkalayın ve ardından 1X PBS çözeltisini atın. Bunu üç kez tekrarlayın. Uzun forsepsler kullanarak, sabit ve yıkanmış larva karkasını, 1X PBS ile doldurulmuş dokuz çöküntü nokta plakasındaki bir kuyuya aktarın.Yağsız tüm vücut dokularını 5 forseps ile çıkarın. Son olarak, yağ gövdesinin parçalarını, montaj ortamı olarak% 80 gliserol kullanarak bir mikroskop slaydına monte edin ve üstüne bir kapak kayması yerleştirin. Mutant bir ve mutant iki, X kromozomu üzerinde iki bağımsız ölümcül mutanttır ve izojenize sarı beyaz FRT 19A sinekleri burada bir kontrol görevi görür.GFP-Atg8a paternleri kontrol, mutant bir veya mutant iki mozaik larva yağ gövdesinde analiz edildi ve mutant klonlar veya kontrol klonları RFP ile negatif olarak işaretlendi. Kontrol klonlarında, GFP-Atg8a Puncta'nın kalıpları, çevredeki RFP pozitif hücrelerdekilere benzerdi. Mutant bir mutant klonda, GFP-Atg8a Puncta büyük ölçüde azaldı.Ve mutant iki mutant klonda, GFP-Atg8a Puncta'nın sayısı ve büyüklüğü arttı. Larva gelişim aşaması burada kritiktir. Gelişim süresi ve açlık süresi, her laboratuvarın kültür ortamı tariflerine göre değiştirilmelidir.Bu prosedür seçici otofajiyi araştırmak için uygulanabilir. Örneğin, mitopaji, bir mitokondriyal hedefleme dizisine bir floresan proteini ekleyerek sinek yağ gövdelerinde izlenebilir.

analyzing-starvation-induced-autophagy-drosophila-melanogaster-larval

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tek Drosophila Ommatidium Diseksiyon ve Görüntüleme

Biz eğitim için sağlam biyokimyasal ve mikroskobik yöntemler...

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

Drosophila melanogaster larvaları besleme devresi besleme hızındaki değişimler stomatogastric sinir devresi değişiklikler ile korelasyon sağlayan bir basit ama güçlü bir model oluşturuyor. Bu devre, ağız kanca projeksiyonlar hem de foregut göndermek merkezi serotonerjik nöronların oluşmaktadır.

Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila</i

Burada üçüncü instar (L3) Drosophila melanogaster larva evresi içinde organizma yağ seviyelerini ölçmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, değişmiş yağ mağazaları ile larva ayırt etmek için yağ dokusunun nispeten düşük yoğunluğa patlatır. Yüzdürme-tabanlı analiz, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik tarama için değerli bir araçtır.

Yağ Düzeylerinin Belirlenmesi A Yüzdürme tabanlı Yöntemi<em&gt; Drosophila</em

Yüksek yağlı diyet beslenme obezite Drosophila, anlayış temel moleküler mekanizmalar içinde lipotoxicity karıştığı için bir model olarak ikna etmek için iletişim kuralı bu. Ayrıca yüksek işlem hacmi triacylglyceride tahlil Drosophila ve potansiyel olarak diğer (böcek) modelleri çeşitli diyet, çevresel, genetik veya fizyolojik koşullar altında yağ birikimi ölçmek için sağlar.

Yüksek yağlı diyet beslenme ve yüksek işlem hacmi Triacylglyceride tahlil Drosophila Melanogaster

Biz oksijen tüketimi ve Drosophila melanogaster larva ve yetişkin Beynindeki hücre dışı asitleştirme ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bir metabolik analyzer adapte ve en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı ile kullanılmaktadır. Mikro-doku bağlar bu protokolü kritik bileşenidir ve tasarlanmış ve bunların kullanımı bu analizi için özel olarak yaratılmıştır.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

Bu iletişim kuralı bir hücre tanıma ve mikrobiyal enfeksiyonlar Gümrükleme ölçmek için yetişkin Drosophila melanogaster içinde vivo fagositoz tahlil açıklar.

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

Burada açıklanan, farklı makro besin kalitesinde diyetlere maruz kalan Drosophila melanogaster larvaları tarafından belirli bir zaman aralığında yenen yiyecek miktarının kolorimetrik olarak ölçülmesini sağlayan bir protokoldür. Bu tahliller nöronal termogenetik ekran bağlamında gerçekleştirilir.

Drosophila Larvaları Kullanılarak Termogenetik Nöronal Ekranda Makro besin alımının nicelleştirilmesi

Uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskopisi, spesifik kimyasal moieties'in seçici, etiketsiz görüntülenmesini sağlar ve lipit moleküllerini in vivo olarak görüntülemek için etkili bir şekilde sunulmuştır. Burada, SRS mikroskopi prensibine kısa bir giriş sağlıyoruz ve Caenorhabditis elegans'talipid depolama görüntülemede kullanımı için yöntemleri açıklıyoruz.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Bu protokol, Drosophila melanogaster kullanılarak şeker açığa çıkarılan arama davranışını kaydetmek için davranışsal bir testi açıklar. Test, beslenme ve yiyecek arama ile ilgili davranışların yanı sıra altta yatan nöronal mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Drosophila'da Şeker Kaynaklı Yerel Arama Davranışının İzlenmesi

Öğrenin, Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde amino asit tükenmesiyle açlığa bağlı otofajiyi nasıl indükleyeceğinizi ve mutant klonlar arasındaki farkları GFP-Atg8a ile analiz edin.

Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde açlığa bağlı otofajinin analizi

Daha fazla video keşfet