Name: Preklinik Kardiyak Risk Değerlendirmesi için İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerin Yapısal ve Kasılma Değişikliklerini Değerlendirmek için Hibrit Hücre Analiz Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Öğrenin, insan iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin yapısal ve kasılma değişikliklerini değerlendirmek için hibrit hücre analiz sistemini. Bu yöntem, preklinik kardiyak güvenlik değerlendirmeleri için gerçek zamanlı, insan temelli veriler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Alman Federal Ekonomik İşler ve İklim Eylemi Bakanlığı (ZIM) ve Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı'ndan (KMUinnovativ) gelen hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan kardiyomiyositleri nazik bir şekilde sağladığı için FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc.'e (Madison, WI, ABD) ve kardiyomiyositleri nazik bir şekilde sağladığı için Ncardia B.V.'ye (Leiden, Hollanda) teşekkür ederiz.

NOT: Kontraktilite ve empedans/EFP ölçümü için iş akışı Ek Şekil 2'de verilmiştir.
1. Plaka kaplama
<ol><li>Vakumla kapatılmış ambalajı açın ve 96 delikli plakayı çıkarın. Her iki modülün 96 delikli plakaları için taşıma prosedürleri aynıdır. Kasılma plakasını, kontraktilite modülünde ölçüm yapılana kadar ek olarak verilen membran koruması ile örtülü bırakın.</li>
	<li>Kardiyomiyositlerin tohumlanması için esnek 96 delikli plakaları kaplayın.<ol><li>2,75 mL EHS jel kullanıma hazır çözeltiyi steril bir santrifüj tüpünde aktararak seyreltilmiş bir EHS jel kaplama çözeltisi hazırlayın. Ardından Ca 2+ve Mg 2+ ile 8,25 mL DPBS ekleyin. Çözeltiyi dikkatlice karıştırın. NOT: İsteğe bağlı olarak, fibronektin kuyucukları kaplamak için de kullanılabilir: Ca 2 +ve Mg 2 + ile 13 mL DPBS'de 650 μL fibronektin stok çözeltisini (1 μg / mL) seyrelterek steril bir santrifüj tüpünde 13 mL fibronektin kaplama çözeltisi hazırlayın ve 50 μg / mL çalışma çözeltisi elde edin. Çözeltiyi dikkatlice karıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kaplama çözeltisini laboratuvar otomasyon robotuna yerleştirilmiş steril bir reaktif rezervuarına aktarın.</li>
	<li>"ADD100μL" programını kullanarak laboratuvar otomasyon robotu ile kuyu başına 100 μL kaplama çözeltisi ekleyin. Kapağı tekrar 96 delikli plakaya yerleştirin ve 37 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin. NOT: Laboratuvar otomasyon robotu programının önceden manuel olarak ayarlanması gerekir.</li>
</ol>2. İnsan iPSC türevi kardiyomiyositlerin esnek 96 delikli plakalara tohumlanması (Gün 0)
<ol><li>Hücreleri üreticinin yönergelerine göre çözün.</li>
	<li>Hücreleri manuel bir sayım odasıyla sayın ve hücreleri önerilen kaplama ortamındaki hücreleri hücre üreticisinin talimatlarına göre ayarlayın (örneğin, 1 x 105 hücre / kuyu), bu da96 delikli bir plakanın tamamını tohumlamak için 11 x 10 6 hücre / 11 mL ile sonuçlanır.</li>
	<li>"REMOVE100μL" programını kullanarak laboratuvar otomasyon robotu ile EHS jel çözeltisini kuyulardan çıkarın. Dağıtılan kaplama çözeltisini içeren reaktif haznesini robottan çıkarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu (toplam 11 mL) laboratuvar otomasyon robotuna yerleştirilen steril bir reaktif rezervuarına aktarın ve "CELLS_ADD100 μL" programını kullanarak hücreleri 100 μL / kuyucuk ile tohumlayın.</li>
	<li>Hücre tohumlamasından hemen sonra, esnek 96 delikli plakayı inkübatöre aktarın (37 ° C,% 5 CO2, nem kontrollü) ve hücrelerin gece boyunca yerleşmesine izin verin.</li>
</ol>3. Esnek 96 delikli plakaların orta değişimi (1. Gün)
<ol><li>Plakaları tohumladıktan 18-24 saat sonra, 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde plaka başına en az 22 mL kardiyomiyosit bakım ortamını 37 ° C'ye ısıtın.</li>
	<li>Taze ortamı (en az 22 mL) steril bir reaktif haznesine aktarın ve laboratuvar otomasyon robotunun hemen yanında bırakın. Robota boş bir reaktif haznesi yerleştirin ve "REMOVE100μL" programı ile orta kaldırma işlemini gerçekleştirin. Daha sonra, atık ortamı içeren reaktif rezervuarını, taze ortamı içeren reaktif rezervuarı ile değiştirin ve "ADD100μL" programı ile kuyu başına 200 μL taze ortam dağıtın. 200 μL/kuyuya ulaşmak için bu adımı iki kez gerçekleştirin.</li>
	<li>Orta değişimden hemen sonra, plakayı tekrar inkübatöre aktarın.</li>
	<li>Bileşik ilavesine kadar her gün bir orta değişim (200 μL / kuyu) gerçekleştirin.</li>
</ol>4. Bileşik eklemeden önce son orta değişim (Gün 5-7)
<ol><li>Bileşik eklemeden 4-6 saat önce son bir ortam değişimi gerçekleştirin.</li>
	<li>Esnek bir 96 delikli plaka için en az 22 mL tahlil tamponunu ısıtın. Tahlil tamponu, bakım ortamından veya bunların türevlerinden oluşur (örneğin, düşük / hiç serum ortamı, fenol kırmızısı içermeyen ortam veya diğer izotonik tamponlar).</li>
	<li>Taze ortamı steril bir reaktif haznesine aktarın ve laboratuvar otomasyon robotunun hemen yanında bırakın. Robota boş bir reaktif haznesi yerleştirin ve orta temizleme işlemini gerçekleştirin. Daha sonra, atık ortamını içeren reaktif rezervuarını, taze ortamı içeren reaktif rezervuarı ile değiştirin ve taze ortamın 200 μL / kuyucuğunu dağıtın.</li>
	<li>Orta değişimden hemen sonra, esnek plakayı inkübatöre geri aktarın.</li>
</ol>5. Bileşik toplama ve veri kaydı (Gün 5-7)
NOT: Deney için örnek bir ölçüm planı Ek Şekil 3'te verilmiştir.
<ol><li>Steril normal 96 derinliğinde bir kuyu plakası kullanarak laminer akış davlumbazında 4x konsantrasyonda bileşik başına çalışma çözeltisi hazırlayın. Bileşik çözelti, adım 4'te kullanılan tahlil tamponuna dayanır. Bileşik çözeltiyi içeren 96 derinliğindeki kuyucuk plakasını, esnek plaka ile aynı duruma ayarlamak için en az 1 saat boyunca inkübatöre aktarın. NOT: Her deney için kullanılan her ilacın 1x konsantrasyonu şekil ve efsanelerde verilmiştir.</li>
	<li>Bir taban çizgisi ölçümü yapmadan önce plakayı ilgili ölçüm cihazına 1 saat aktarın.</li>
	<li>Kontrol yazılımında (hibrit hücre analiz sisteminin bir parçası) Düzenleme Protokolü'nü açın ve ilgili ölçüm modu kontraktilitesini veya empedansını/EFP'yi seçin.</li>
	<li>Süpürme süresini (bir ölçümün uzunluğu; örneğin, 30 sn) ve tekrarlama aralığını (ölçümler arasındaki süre; örneğin, 5 dakika) tanımlayın ve protokol numarasını kaydedin.</li>
	<li>Protokolü başlat > Devam'ı seçin ve istenen alanları doldurun.</li>
	<li>Son olarak, Ölçümü başlat'ı seçin. Bileşik eklemeden kısa bir süre önce 5 dakikalık aralıklarla en az üç temel ölçüm (süpürme) gerçekleştirin. NOT: Bileşik ilavesinden önce kontraktilite modülünü kullanan bir kontraktilite taban çizgisi ölçümünün örnek verileri Ek Şekil 4'te gösterilmiştir.</li>
	<li>Esnek 96 delikli plakayı ölçüm cihazından çıkarmadan her bir kuyucuktan 50 μL tahlil tamponunu çıkarın.</li>
	<li>Ölçüm planına göre, plakanın her bir kuyucuğuna 4x konsantre bileşik çözeltinin 50 μL'sini ekleyin.</li>
	<li>Bölge işaretçisi ekle'yi seçin ve bileşik toplama işleminden sonra bileşik plaka düzenini ve bileşik çözeltisinin hacmini tanımlayın.</li>
	<li>Son olarak, Standart ölçümle devam et veya Deneysel plana göre ölçüm serileriyle ilerle'yi seçin.</li>
</ol>6. Veri analizi
<ol><li>Kayıt yazılımıyla, uzunluğu ve tekrarlama aralığı kullanıcı tarafından tanımlanan ölçüm süpürmeleri.</li>
	<li>Analiz yazılımıyla, genlik, vuruş hızı, darbe genişliği ve benzeri parametreleri otomatik olarak okuyarak sinyalin şeklini yakalayın. NOT: Ortalama vuruş olarak adlandırılan standart sapmayı içeren ortalama bir sinyal, bir taramanın verilerine dayanarak otomatik olarak hesaplanır. Kullanıcı, yazılımın hesapladığı ve görüntülediği kontraktilite/IMP/EFP parametrelerini tanımlayabilir.</li>
	<li>Analiz yazılımı ile her bileşik için doz-yanıt eğrisini ve IC50/EC50'yi hesaplayın. NOT: Ham veriler ve analiz yazılımı ile oluşturulan analiz sonuçları, çeşitli formatlarda kolayca dışa aktarılabilir. Son olarak, deneysel sonuçları özetlemek ve arşivlemek için veri raporları otomatik olarak oluşturulur. Bir EFP sinyalinin ne ve nasıl ölçüldüğüne dair kapsamlı bir açıklama 17'de tartışılmaktadır.</li>
</ol>

<ol><li>Weaver, R. J., Valentin, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Today%27s+challenges+to+de-risk+and+predict+drug+safety+in+human+%26%2334%3Bmind-the-gap%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human &#34;mind-the-gap&#34.</a> Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).</li>
<li>Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell+%28iPSC%29-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+in+toxicology%3A+strengths+and+weaknesses+for+hazard+identification+and+risk+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).</li>
<li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+Validation+studies+and+best+practice+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Regulatory+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).</li>
<li>Pang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+testing+in+the+era+of+induced+pluripotent+stem+cells%3A+A+perspective+regarding+the+use+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiac+safety+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation.</a> Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).</li>
<li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).</li>
<li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+mechanical+conditioning+into+a+high+throughput+contractility+assay+for+cardiac+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892(2020).</li>
<li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22New+Methods+in+Cardiovascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).</li>
<li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Cardiac+cell+culture%3A+a+critical+review+of+current+technologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87(2019).</li>
<li>Laverty, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).</li>
<li>Volkova, M., Russel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthracycline+cardiotoxicity%3A+prevalence%2C+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment.</a> Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).</li>
<li>Bozza, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthracycline-induced+cardiotoxicity%3A+molecular+insights+obtained+from+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+%28hiPSC-CMs%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs).</a> The AAPS Journal. 23 (2), (2021).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li>
<li>Brown, G. E., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+liver+and+heart+tissues+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of liver and heart tissues for drug development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225(2018).</li>
<li>Scott, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+impedance-based+cellular+assay+using+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+to+quantify+modulators+of+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility.</a> Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).</li>
<li>Gossmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-pharmacological+characterization+of+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).</li>
<li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+multi-parameter+measurement+of+cardiomyocytes+dynamics+with+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy.</a> Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).</li>
<li>Doerr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+easy-to-use+hybrid+system+for+extracellular+potential+and+impedance+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).</li>
<li>Obergrussberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+pharmacology+studies+using+EFP+and+impedance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Safety pharmacology studies using EFP and impedance.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).</li>
<li>Bot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-site+comparison+of+excitation-contraction+coupling+using+impedance+and+field+potential+recordings+in+hiPSC+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).</li>
<li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Workshop+report%3A+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li>
<li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiwell+cardiac+%C2%B5GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li>
<li>Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R.Human+iPSC-derived+cardiomyocyte+networks+on+multiwell+micro-electrode+arrays+for+recurrent+action+potential+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59906(2019).</li>
</ol>

B.L., M.Go. ve P.L., esnek plakaların üreticisi olan innoVitro GmbH'de çalışmaktadır. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. ve S.S., hibrit cihazın üreticisi Nanion Technologies GmbH'de çalışmaktadır.

Empedans/EFP/kontraktiliteli hibrid sistem, klinik öncesi ilaç geliştirme için kardiyak yükümlülüklerin yüksek verim güvenliği farmakolojik ve toksikolojik değerlendirmesi için kapsamlı bir metodolojidir. Hayvan modelleri kullanılmadan klinik öncesi güvenlik testleri için modern bir yaklaşım sağlar, ancak zaman ve maliyetleri önemli ölçüde azaltan daha yüksek verim yetenekleri ile. Bu sistem, Langendorff Kalbi ve klinik öncesi fonksiyonel ve yapısal toksisite değerlendirmesi için diğer hayvan modelleri için tamamlayıcı b...

Modern ilaç geliştirmenin ana hedeflerinden biri, ilaç keşif boru hattındaki yeni terapötiklerin tezgahtan başucuna başarı oranının iyileştirilmesidir. Bu yeni ilaçların güvenli farmakolojik testleri genellikle kardiyovasküler sistem üzerinde preklinik aşamalarda ilaç yıpranma oranının neredeyse dörtte birini oluşturan advers ilaç reaksiyonlarını ortaya koymaktadır1. Yeni yaklaşım metodolojilerinin (NAM'lar) geliştirilmesi ve entegrasyonu, klinik öncesi değerlendirmenin, özellikle de kalp gibi çekirdek pil organlarının modernizasyonunda kilit bir rol oynamaktadır. Bu metodolojiler hayvansız yaklaşımlar olduğundan, indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kökenli kardiyomiyositler (CM'ler) gibi insan bazlı hücre modellerinin kullanılması, son on yılda güvenlik farmakolojik ve toksikolojik konularının modern değerlendirmesi için iş gücü haline gelmiştir2. Bu tür araştırmalar için yaygın olarak kullanılan tahlil sistemleri mikroelektrot dizisi (MEA) ve voltaja duyarlı boya bazlı deneysel yaklaşımlardır3.
Bununla birlikte, bu hücre tipinin iddia edilen fenotipik ve fonksiyonel olgunlaşmamışlığı, klinik olmayan ve klinik çalışmalar arasındaki translasyonel boşlukları azaltma potansiyeli olan ideal bir insan tabanlı hücre modelinin önüne engeller koymaktadır4.
İma edilen olgunlaşmamış fenotipin nedenini anlamak ve insan iPSC-CM'lerinin olgunlaşma sürecini in vitro olarak zorlamanın yollarını bulmak için yıllar boyunca muazzam araştırmalar yapılmıştır.
Uzun hücre kültürü süreleri, civardaki diğer hücre tiplerinin yokluğu veya hormonal stimülasyon eksikliği gibi kardiyak olgunlaşma ipuçlarının eksikliğinin olgunlaşma sürecini etkilediği gösterilmiştir5. Ayrıca, düzenli hücre kültürü plakalarının fizyolojik olmayan ortamı, doğal insan kalbinin eksik fizyolojik substrat sertliği nedeniyle insan iPSC-CM'lerinin olgunlaşmasını engelleyen önemli bir neden olarak tanımlanmıştır 5,6.
Bu sorunun üstesinden gelmek için, hücrelerin tipik iki boyutlu hücre kültürleri yerine doğal kardiyak mimariye benzeyecek şekilde üç boyutlu olarak hizalandığı 3D hücre kültürü sistemleri de dahil olmak üzere doğal fizyolojik koşullara odaklanan farklı tahlil sistemleri geliştirilmiştir7. Her ne kadar 3D analizlerle daha iyi olgunlaşma elde edilse de, vasıflı bir işgücüne duyulan ihtiyaç ve bu sistemlerin düşük verimi, ilaç geliştirme sürecinde bunun bol miktarda kullanılmasını engellemektedir, çünkü zaman ve maliyet, yeni terapötiklerin finansal düzeyde değerlendirilmesinde temel bir rol oynamaktadır8.
Yeni terapötiklerin güvenlik farmakolojik ve toksikolojik değerlendirmesi için önemli okumalar, insan iPSC-CM'lerinin fonksiyonel ve yapısal özelliklerindeki değişikliklerdir, çünkü kardiyovasküler sistemin bileşiğe bağlı advers ilaç reaksiyonları genellikle bu özelliklerden birini veya her ikisini de etkiler 1,9. Bu kadar geniş advers reaksiyonların iyi bilinen örnekleri, antrasiklin ailesinin anti-kanser ilaçlarıdır. Burada, kardiyovasküler sistem üzerindeki tehlikeli fonksiyonel ve olumsuz yapısal etkiler, hastalarda kanser tedavisi sırasında ve sonrasında ve ayrıca in vitro hücre bazlı tahlillerde yaygın olarak bildirilmektedir10,11.
Bu çalışmada, hiPSC-CM'ler üzerindeki hem fonksiyonel hem de yapısal bileşik yan etkilerinin değerlendirilmesi için kapsamlı bir metodoloji açıklanmaktadır. Metodoloji, kardiyomiyosit kontraktil kuvvetinin analizini ve empedans/Hücre Dışı Alan Potansiyeli (EFP) analizini içerir. Kasılma kuvveti, fizyolojik mekanik koşullar altında, doğal insan kalp dokusunun mekanik ortamını yansıtan yumuşak (33 kPa) silikon substratlar üzerinde kültürlenmiş hücrelerle ölçülür.
Sistem, klinik öncesi kardiyak güvenlik farmakolojik ve toksikolojik çalışmaları için insan iPSC-CM'lerinin yüksek verimli analizi için 96 kuyucuklu plakalarla donatılmıştır ve bu nedenle Langendorff kalp veya kalp dilimleri12,13 gibi şu anda kullanılan 3D yaklaşımlara avantaj sağlar.
Ayrıntılı olarak, hibrid sistem, fizyolojik koşullar altında kardiyak kontraktilitenin değerlendirilmesi veya gerçek zamanlı hücresel yapısal toksisitenin analizi için iki modülden oluşur 6,14. Her iki modül de hızlı ve uygun maliyetli veri toplama için özel yüksek verimli 96 delikli plakalarla çalışır.
Bir 3D yapıya ihtiyaç duymadan, kontraktilite modülü, normal hücre kültürü plakalarının genellikle içerdiği sert cam veya plastik yerine, hücreler için substrat olarak esnek silikon membranlar içeren özel plakalar kullanır. Membranlar tipik insan biyomekanik kalp özelliklerini yansıtır ve bu nedenle in vivo koşulları yüksek verimle taklit eder. İnsan iPSC-CM'leri genellikle diğer hücre bazlı tahlillerde bileşik kaynaklı pozitif inotropi ile ilgili yetişkin kardiyomiyosit davranışını gösteremezken, hücreler kontraktilite modülünün plakaları üzerinde kültürlendiğinde daha yetişkin benzeri bir reaksiyon değerlendirilebilir. Önceki çalışmalarda, iPSC-CM'lerin izoproterenol, S-Bay K8644 veya omecamtiv mecarbil 6,15 gibi bileşiklerle tedavi üzerine pozitif inotropik etkiler gösterdiği gösterilmiştir. Burada, kasılma kuvvetinin genliği (mN/mm2), vuruş süresi ve vuruş hızı gibi birincil parametrelerin yanı sıra eğrinin altındaki alan, kasılma ve gevşeme eğimleri, vuruş hızı değişimleri ve aritmiler gibi büzülme döngüsünün ikincil parametreleri gibi çoklu kontraktilite parametreleri değerlendirilebilir (Ek Şekil 1)16 . Tüm parametrelerdeki ilaca bağlı değişiklikler, kapasitif mesafe algılaması ile non-invaziv olarak değerlendirilir. Ham veriler daha sonra özel yazılımlar tarafından analiz edilir.
Yapısal toksisite modülü, yapısal hücresel toksisite ve elektrofizyolojik özelliklerin analizi için bir okuma olarak benzersiz empedans ve EFP parametrelerini ekler17,18. Elektriksel empedans spektroskopisi teknolojisi, bilinen kardiyotoksik bileşiklerle muamele edilmiş insan iPSC-CM'lerinde gösterildiği gibi, gerçek zamanlı olarak izlenen hücre yoğunluğunda veya hücre ve tek katmanlı bütünlükte bileşiğin neden olduğu değişiklikleri ortaya koymaktadır13. Farklı frekanslarda (1-100 kHz) empedans okumaları ile fizyolojik bir yanıtı daha da incelemek mümkündür ve böylece membran topografyasındaki, hücre-hücre veya hücre-matris kavşaklarındaki değişiklikleri ortaya çıkarmak mümkündür. İnsan iPSC-CM'lerinin ek EFP kaydı, CiPA çalışması17,19'un ışığında gösterildiği gibi, bileşik işlemle ortaya çıkan elektrofizyolojik etkilerin analizini de sağlar.
Bu çalışmada, her ikisi de kardiyotoksik antrasiklinler olarak iyi tanımlanan epirubisin ve doksorubisin ve oldukça düşük kardiyovasküler toksisite riski olan bir tirozin kinaz inhibitörü (TKI) olan erlotinib ile tedavi edilen insan iPSC-CM'leri kullanılmıştır. Epirubisin, doksorubisin ve erlotinib ile kronik değerlendirme 5 gün boyunca yapıldı. Sonuç, hücreler erlotinib ile tedavi edildiğinde kontraktilitede ve baz empedansında küçük değişiklikler gösterir, ancak sırasıyla epirubisin ve doksorubisin ile tedavi edildiğinde kasılma genliği ve baz empedansında zaman ve doza bağlı toksik bir azalma gösterir. Kalsiyum kanal blokeri nifedipin ile akut ölçümler yapıldı ve kasılma genliğinde, alan potansiyel süresinde ve baz empedansında azalma göstererek bu bileşiğin fonksiyonel ve yapısal seviyeler üzerindeki kardiyotoksik yan etkilerini gösterdi.

<table><tbody><tr><td>Ticari insan iPSC türevi kardiyomiyositler&nbsp;</td><td>Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)</td><td>R1059</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj (50 mL tüpler)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15878722</td><td></td></tr><tr><td>12 kanallı ayarlanabilir pipet (100-1250 & mu; L)</td> Ca2 + ve Mg2 + GE ile <td>Integra Biosciences</td><td>4634</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td> <td>Healthcare HyClone</td><td>SH304264.01</td><td></td></tr><tr><td>96 derin kuyu plakası</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A43075</td><td></td></tr><tr><td>EHS jel</td><td></td><td></td><td>Hücre Dışı Matris Jel</td></tr><tr><td>FLEXcyte 96 / CardioExcyte hibrit cihaz</td><td>Nanion Technologies&nbsp;</td><td>19 1004 1005</td><td>Hibrit hücre analiz sistemi&nbsp;</td></tr><tr><td>FLX-96 FLEXcyte Sensör Plakaları</td><td>Nanion Technologies</td><td>20 1010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Fibronektin stok çözeltisi (Geltrex'e bağlı)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex hESC Nitelikli, Kullanıma Hazır, Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Matrisi</td><td>ThermoFischer Bilimsel</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>İnsan iPSC'den türetilmiş kardiyomiyositler kaplama ve bakım ortamı</td><td>FCDI</td><td>R1059</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör (37 &deg; C, %5 CO2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51023121</td><td></td></tr><tr><td>Laminer Akış Başlığı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51032678</td><td></td></tr><tr><td>NSP-96 CardioExcyte 96 Sensör Plakaları 2.0 mm şeffaf</td><td>Nanion Technologies</td><td>20 1011</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları (1250&mikro; L)</td><td>Integra Biosciences</td><td>94420813</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif Rezervuarı</td><td>Integra Biosciences</td><td>8096-11</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet (örn. 25 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16440901</td><td></td></tr><tr><td>Tek kanallı ayarlanabilir pipet (örn. 100-1000 &mu; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Vakum aspirasyon sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567479</td><td></td></tr><tr><td>İsteğe bağlı: VIAFLO ASSIST</td><td>Integra Biosciences</td><td>4500</td><td>Laboratuvar otomasyonu Robotu</td></tr><tr><td>Su banyosu (37 &°; C)</td> <td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>15365877</td><td></td></tr></tbody></table>

preklinik kardiyak risk değerlendirmesi için İnsan ipsc kaynaklı kardiyomiyositlerin yapısal ve kasılma değişikliklerini değerlendirmek için hibrit hücre analiz sistemi

Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

Kardiyak kontraktilitenin değerlendirilmesi, yeni terapötiklerin geliştirilmesi ve klinik aşamalara güvenli geçişi için büyük önem taşımaktadır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaç keşfi ve güvenlik farmakolojisinin klinik öncesi aşamalarında insanla ilgili bir model olarak hizmet etme sözü verirken, olgunlukları bilimsel toplulukta hala tartışmalıdır ve sürekli gelişme halindedir. Hibrit kontraktilite ve empedans/hücre dışı alan potansiyeli (EFP) teknolojisi sunarak endüstri standardı 96 kuyucuklu bir platforma önemli pro-olgunlaşma özellikleri ekliyoruz.
Empedans/EFP sistemi, hücresel işlevselliği gerçek zamanlı olarak izler. Kasılma hücrelerinin vuruş hızının yanı sıra, elektriksel empedans spektroskopisi okumaları, hücre yoğunluğu ve hücresel tek katmanın bütünlüğü gibi bileşiğin neden olduğu morfolojik değişiklikleri tespit eder. Hibrit hücre analiz sisteminin diğer bileşeninde, hücreler gerçek kalp dokusunun mekanik ortamını taklit eden biyo-uyumlu membranlar üzerinde kültürlenir. Bu fizyolojik ortam, hiPSC-CM'lerin in vitro olgunlaşmasını destekler ve izoproterenol, S-Bay K8644 veya omecamtiv mekarbil ile tedaviden sonra pozitif inotropik etkiler de dahil olmak üzere daha yetişkin benzeri kontraktil yanıtlara yol açar. Kasılma kuvvetinin genliği (mN /mm2) ve atma süresi gibi parametreler, elektrofizyolojik özellikler ve kalsiyum kullanımı üzerinde etkisi olan bileşiklerin aşağı akış etkilerini de ortaya koymaktadır.
Hibrit sistem, bütünsel hücre analizi için ideal bir araç sağlar ve insanla ilgili hücre bazlı testlerin mevcut perspektiflerinin ötesinde klinik öncesi kardiyak risk değerlendirmesine izin verir.

Kinaz inhibitörü erlotinibin hiPSC-CM'lerin kontraktilitesi üzerine etkileri Şekil 1'de gösterilmiştir. Hücreler 5 gün boyunca 10 nM ila 10 μM arasında değişen konsantrasyonlarla tedavi edildi ve günlük vuruş parametreleri kaydedildi. Nispeten düşük kardiyotoksisite riski olan bir EGFR (epidermal büyüme faktörü reseptörü) ve tirozin kinaz inhibitörü olan Erlotinib, sadece mikromolar aralıktaki konsantrasyonlarda hiPSC-CM'ler üzerinde küçük bir doz ve zamana bağlı etkiye sahipti. En düşük kon...

İnsan iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin kasılma fonksiyonlarındaki ve hücresel bütünlüğündeki değişikliklerin analizi, klinik olmayan ilaç gelişimi için büyük önem taşımaktadır. Hibrit bir 96 kuyucuklu hücre analiz sistemi, klinik aşamalara güvenli bir geçiş için gerekli olan güvenilir, insanla ilgili sonuçlar için her iki parametreyi de gerçek zamanlı ve fizyolojik bir şekilde ele alır.

Preklinik Kardiyak Risk Değerlendirmesi için İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerin Yapısal ve Kasılma Değişikliklerini Değerlendirmek için Hibrit Hücre Analiz Sistemi

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...

Yöntem, yeni ilaç adaylarının klinik aşamalara güvenli bir şekilde geçişi için gerçek insan temelli verileri kullanarak klinik öncesi kardiyak güvenlik ve toksisite ile ilgili soruyu cevaplamaya yardımcı olabilir. Bir dizi farklı in-vitro ve in-vivo teknik kullanmak yerine, bu hibrid sistemin temel avantajı, insan iPC kaynaklı kardiyomiyosit, elektrofizyolojik ve canlılık parametrelerinin eşzamanlı olarak değerlendirilmesi ve fizyolojik koşullar altında kontraktil özelliklerin analizidir. Bu yöntem, kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik, yapısal ve kontraktil değişikliklerini ve aynı anda 69 kuyunun test edilmesine izin veren daha yüksek bir verim sistemini kapsadığı için ilaç keşfi için uygulanabilir.Plaka kaplamaya başlamak için, kontraktilite modülünde ölçüm yapılana kadar kasılma plakasının alt kısmını ek olarak verilen membran koruması ile örtülü bırakın. Kardiyomiyositlerin tohumlanması için, steril bir santrifüj tüpünde 2.75 mililitre EHS jel kullanıma hazır çözelti ve kalsiyum ve magnezyum içeren 8.25 mililitre DPBS aktararak seyreltilmiş bir EHS jel kaplama çözeltisi hazırlayın. Sonra çözeltiyi karıştırın.Membran korumasını kasılma plakasından çıkarın. Hazırlanan kaplama çözeltisini laboratuvar otomasyon robotundaki steril bir reaktif rezervuarına aktarın. Programı kullanın, laboratuvar otomasyon robotu ile 100 mikrolitre ekleyin ve kuyu başına 100 mikrolitre kaplama çözeltisi ekleyin.Ardından kapağı tekrar 96 delikli plakaya yerleştirin ve 37 santigrat derecede üç saat kuluçkaya yatırın. Hücreleri çözdükten ve saydıktan sonra, hücreleri önerilen kaplama ortamındaki hücreleri hücre üreticisinin talimatlarına göre ayarlayın, böylece 96 delikli bir plakanın tamamını tohumlamak için 11 mililitre başına 11 ila 10 ila altıncı hücreler elde edilir. EHS jel çözeltisini laboratuvar otomasyon robotu ile kuyulardan çıkarmak için 100 mikrolitre çıkarma programını kullanın.Daha sonra, 11 mililitre hücre süspansiyonunu laboratuvar otomasyon robotuna yerleştirilmiş steril bir reaktif rezervuarına aktarın ve hücreleri kuyu başına 100 mikrolitre süspansiyonla tohumlayın. Programı kullanarak, hücreler 100 mikrolitre ekler. Hücre tohumlamasından hemen sonra, esnek 96 delikli plakayı nem kontrollü inkübatöre 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte aktarın ve hücrelerin gece boyunca yerleşmesine izin verin.50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde her plakaya 37 santigrat dereceye kadar ilave edilecek 22 mililitre kardiyomiyosit bakım maddesini ısıtın. Plakaları tohumladıktan 18 ila 24 saat sonra, taze ortamı steril bir reaktif rezervuarına aktarın ve laboratuvar otomasyon robotunun yanında bırakın. Ardından programla orta kaldırma işlemini gerçekleştirin, 100 mikrolitreyi çıkarın.Daha sonra taze ortamı içeren reaktif rezervuarını laboratuvar otomasyon robotuna yerleştirin ve programla birlikte kuyucuk başına 200 mikrolitre taze ortam dağıtın, 100 mikrolitre ekleyin. Kuyu başına 200 mikrolitreye ulaşmak için bu adımı iki kez uygulayın. Orta değişimden hemen sonra, plakayı inkübatöre aktarın.Bileşik ilavesine kadar her gün orta bir değişim gerçekleştirin. Bileşik eklemeden dört ila altı saat önce, 22 mililitre taze ve sıcak tahlil tamponunu steril bir reaktif rezervuarına aktararak ve laboratuvar otomasyon robotunun yanında bırakarak son bir ortam değişikliği gerçekleştirin. Orta değişimden hemen sonra esnek plakayı inkübatöre geri aktarın.Temel ölçümden bir saat önce plakayı ilgili ölçüm cihazına aktarın. Kontrol yazılımında Edit Protocol'ü açın ve ilgili Measurement Mode, Flex Site veya Impedance EFP'yi seçin. Protokol numarasını kaydetmeden önce bir ölçümün süpürme süresini veya uzunluğunu 30 saniyeye ve tekrarlama aralığını 10 dakikaya kadar tanımlayın.Ardından Protokolü Başlat'ı seçin ve istenen alanları doldurmaya devam edin. Parametreler ayarlandığında, Ölçümü başlat'ı seçin. Bileşik eklemeden kısa bir süre önce beş dakikalık aralıklarla en az üç temel ölçüm gerçekleştirin.Esnek 96 delikli plakayı ölçüm cihazından çıkarmadan her bir kuyucuktan 50 mikrolitre tahlil tamponunu çıkarın, ardından ölçüm planına göre plakanın her bir kuyucuğuna dört kat konsantre bileşik çözeltinin 50 mikrolitresinin eklenmesiyle devam edin. Bileşik eklemeden sonra, bileşik plaka düzenini ve bileşik çözeltinin hacmini tanımlamak için reaktif işaretleyicisi ekle'yi seçin. Ardından Standart Ölçümle Devam Et'i seçin veya deneysel plana göre Ölçüm Serisi ile devam edin.Temsili Analiz, kinaz inhibitörü Erlotinib'in insan iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin kontraktilitesi üzerindeki etkilerini göstermektedir. En düşük konsantrasyonda, Erlotinib genlikte istatistiksel olarak önemsiz bir azalmaya neden olurken, Erlotinib'in mikromolar konsantrasyonları zaman ve doza bağlı kardiyotoksik etkiler göstermiştir. Etkinin başlangıcı bir mikromolar Erlotinib ile 96 saatten itibaren görülürken, 10 mikromolar Erlotinib ile tedavi, bileşik ilavesinden 24 saat sonra önemli bir azalmaya neden oldu.10 mikromolar Epirubisin uygulamasından sonra, hücreler 24 saat içinde atmayı bıraktı. Bir mikromolar Epirubisin uygulamasıyla, 24 saat sonra genlikte ciddi bir azalma ve ardından 48 saate kadar tam bir atım bırakma izledi. 100 nanomolar'da, vuruş genliğinde zamana bağlı bir azalma gözlendi.En düşük 10 nanomolar konsantrasyonunda, genlik sürekli dalgalandı ve Epirubisin'in etkisinin sadece doza bağlı olduğunu doğruladı. 24 saat boyunca Doksorubisin ve Nifedipin ile tedavi, hücre canlılığını konsantrasyon ve zamana bağlı olarak azaltır. Artan Nifedipin konsantrasyonlarının uygulanması üzerine, hücreler üzerindeki alan potansiyel kayıtları, normalleştirilmiş alan süresinin konsantrasyona bağlı bir kısalmasını ortaya koymaktadır.Kardiyak kontraktiliteye ilişkin nifedipin değerlendirmesi de 10 nanomolar ve 13 nanomolar konsantrasyon ile akut ölçüm üzerine konsantrasyona bağlı genlikte önemli bir azalma göstermiştir. Hücrelerin genellikle sıcaklık ve pH değişiklikleri gibi çevresel parametrelere ve özellikle büzülme plakalarında desteklenen mekanik simülasyona duyarlı olduklarını hatırlamak önemlidir.

hybrid-cell-analysis-system-to-assess-structural-contractile-changes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSC) kardiyomiyositlerini -türevlenmiş dan Burada, insan mühendisliği kalp dokusu üretimini göstermektedir. Biz hERG kanalı inhibitörü e-4031 ile büzülme kuvveti ve kasılma biçimi örnek değişiklik analiz etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, kalp ilaç taraması için sağlamlık ve uygunluğu yüksek seviyesini gösterir.

Kardiyak İlaç güvenlik Taraması için insan mühendisliği kalp dokusunun Otomatik Büzülme Analizi

Kendiliğinden müteahhitlik insan kaynaklı pluripotent türetilmiş cardiomyocytes syncytia kök hücre insan kalp fizyolojisi ve farmakoloji yararlı modelleri vardır. Burada frekans yenerek, bir Ca duyarlı floresan boya ve ısı kontrollü görüntüleme çok iyi plaka okuyucu kullanarak eksojen bileşikler etkilerini ölçmek için bir yüksek-den geçerek tarama sistemi mevcut.

384-şey plakaları ısı kontrollü bir Ca duyarlı floresan boya ile ölçülen insan IPSC türetilmiş Cardiomyocyte Syncytia kasılmalar

Burada sürekli olarak sağlam insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler üretmek ve işlevlerini karakterize etmek için bir yöntem tanımlamak ve doğrulamak. Bu teknikler sinyal yolları içine mekanistik anlayış geliştirilmesinde yardımcı olabilir, büyük ölçekli ilaç tarama için bir platform sağlamak, ve güvenilir model kalp hastalıkları.

Ventriküler Benzeri HiPSC Türevi Kardiyomiyositlerin Ve Kalsiyum Kullanımı Karakterizasyonu için Yüksek Kaliteli Hücre Preparatlarının Üretimi

Bu protokol, preklinik ilaç testi için insan kardiyak dilimlerinin kesilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü açıklar ve bu dilimlerden aynı anda transmembran voltajı ve hücre içi kalsiyum sinyallerini kaydetmek için optik haritalamanın kullanımını ayrıntılarıyla açıklar.

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

İskemiye neden olan doku hasarının kantitatif değerlendirilmesi için bir yöntem le birlikte, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen kardiyomiyositler kullanılarak iskemik kalp hastalığı nın bir modelini saklı atıyoruz. Bu model ilaç tarama ve iskemik kalp hastalığı üzerinde daha fazla araştırma için yararlı bir platform sağlayabilir.

HiPSC Türetilmiş Kardiyomiyosit Kullanarak İskemik Kalp Hastalığı Modeli ve Kardiyomiyosit Kontraksiyonunun Video Tabanlı Karşılaştırılması

Uygun bir sarcomere ağının oluşumu iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin olgunlaşması için önemlidir. Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin yapısal olgunlaşmasının kantitatif değerlendirmesini sağlayan, kardiyak gelişimi teşvik eden kültür koşullarını iyileştirmek için süper çözünürlük temelli bir yaklaşım savuruyoruz.

Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerde α-Aktinin Ağının Analizi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için umut verici bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM'lerin kontraktilitesini ve elektrofizyolojisini ölçmek için bir protokol detaylandırıyoruz.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositler Üzerindeki Mikroelektrot Dizisi ve Yama Kelepçesi Kayıtlarının Teknik Uygulamaları

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite taraması için hayvanların kullanılmasına bir alternatif sunar. Preklinik toksisite taramasında hiPSC-CM'lerin yaygın olarak benimsenmesinin bir sınırlaması, hücrelerin olgunlaşmamış, fetal benzeri fenotipidir. Burada hiPSC-CM'lerin sağlam ve hızlı olgunlaşması için protokoller sunulmaktadır.

Olgun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit Monokatmanları Kullanılarak Yüksek Verimli Kardiyotoksisite Taraması

Burada, video tabanlı mikroskopi ile birlikte esnek bir substrat üzerine kaplanmış, 2D insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit (hiPSC-CM) monokatmanlarını kullanan non-invaziv bir kardiyak tıbbi cihaz kontraktilitesi değerlendirme yöntemini gösteriyoruz. Bu araç, kardiyak elektrofizyoloji cihazlarının kasılma özelliklerinin in vitro değerlendirilmesinde yararlı olacaktır.

2D İnsan Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kardiyak Kontraktilite Modülasyon Tedavisinin Değerlendirilmesi

Burada, optik tabanlı bir platform kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kontraktilite ve kalsiyum ölçümleri yapmak için yerleşik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu platform, araştırmacıların mutasyonların etkisini ve çeşitli uyaranlara verilen tepkiyi hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde incelemelerini sağlar.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kalsiyum ve kontraktilite parametrelerinin gerçek zamanlı ölçümleri

Öğrenin, insan iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin yapısal ve kasılma değişikliklerini değerlendirmek için hibrit hücre analiz sistemini. Bu yöntem, preklinik kardiyak güvenlik değerlendirmeleri için gerçek zamanlı, insan temelli veriler sağlar.

Preklinik Kardiyak Risk Değerlendirmesi için İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerin Yapısal ve Kasılma Değişikliklerini Değerlendirmek için Hibrit Hücre Analiz Sistemi (Video) | JoVE Journal

Preklinik Kardiyak Risk Değerlendirmesi için İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerin Yapısal ve Kasılma Değişikliklerini Değerlendirmek için Hibrit Hücre Analiz Sistemi

Daha fazla video keşfet