Preklinik Kardiyak Risk Değerlendirmesi için İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerin Yapısal ve Kasılma Değişikliklerini Değerlendirmek için Hibrit Hücre Analiz Sistemi

Yöntem, yeni ilaç adaylarının klinik aşamalara güvenli bir şekilde geçişi için gerçek insan temelli verileri kullanarak klinik öncesi kardiyak güvenlik ve toksisite ile ilgili soruyu cevaplamaya yardımcı olabilir. Bir dizi farklı in-vitro ve in-vivo teknik kullanmak yerine, bu hibrid sistemin temel avantajı, insan iPC kaynaklı kardiyomiyosit, elektrofizyolojik ve canlılık parametrelerinin eşzamanlı olarak değerlendirilmesi ve fizyolojik koşullar altında kontraktil özelliklerin analizidir. Bu yöntem, kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik, yapısal ve kontraktil değişikliklerini ve aynı anda 69 kuyunun test edilmesine izin veren daha yüksek bir verim sistemini kapsadığı için ilaç keşfi için uygulanabilir.

Plaka kaplamaya başlamak için, kontraktilite modülünde ölçüm yapılana kadar kasılma plakasının alt kısmını ek olarak verilen membran koruması ile örtülü bırakın. Kardiyomiyositlerin tohumlanması için, steril bir santrifüj tüpünde 2.75 mililitre EHS jel kullanıma hazır çözelti ve kalsiyum ve magnezyum içeren 8.25 mililitre DPBS aktararak seyreltilmiş bir EHS jel kaplama çözeltisi hazırlayın. Sonra çözeltiyi karıştırın.

Membran korumasını kasılma plakasından çıkarın. Hazırlanan kaplama çözeltisini laboratuvar otomasyon robotundaki steril bir reaktif rezervuarına aktarın. Programı kullanın, laboratuvar otomasyon robotu ile 100 mikrolitre ekleyin ve kuyu başına 100 mikrolitre kaplama çözeltisi ekleyin.

Ardından kapağı tekrar 96 delikli plakaya yerleştirin ve 37 santigrat derecede üç saat kuluçkaya yatırın. Hücreleri çözdükten ve saydıktan sonra, hücreleri önerilen kaplama ortamındaki hücreleri hücre üreticisinin talimatlarına göre ayarlayın, böylece 96 delikli bir plakanın tamamını tohumlamak için 11 mililitre başına 11 ila 10 ila altıncı hücreler elde edilir. EHS jel çözeltisini laboratuvar otomasyon robotu ile kuyulardan çıkarmak için 100 mikrolitre çıkarma programını kullanın.

Daha sonra, 11 mililitre hücre süspansiyonunu laboratuvar otomasyon robotuna yerleştirilmiş steril bir reaktif rezervuarına aktarın ve hücreleri kuyu başına 100 mikrolitre süspansiyonla tohumlayın. Programı kullanarak, hücreler 100 mikrolitre ekler. Hücre tohumlamasından hemen sonra, esnek 96 delikli plakayı nem kontrollü inkübatöre 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte aktarın ve hücrelerin gece boyunca yerleşmesine izin verin.

50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde her plakaya 37 santigrat dereceye kadar ilave edilecek 22 mililitre kardiyomiyosit bakım maddesini ısıtın. Plakaları tohumladıktan 18 ila 24 saat sonra, taze ortamı steril bir reaktif rezervuarına aktarın ve laboratuvar otomasyon robotunun yanında bırakın. Ardından programla orta kaldırma işlemini gerçekleştirin, 100 mikrolitreyi çıkarın.

Daha sonra taze ortamı içeren reaktif rezervuarını laboratuvar otomasyon robotuna yerleştirin ve programla birlikte kuyucuk başına 200 mikrolitre taze ortam dağıtın, 100 mikrolitre ekleyin. Kuyu başına 200 mikrolitreye ulaşmak için bu adımı iki kez uygulayın. Orta değişimden hemen sonra, plakayı inkübatöre aktarın.

Bileşik ilavesine kadar her gün orta bir değişim gerçekleştirin. Bileşik eklemeden dört ila altı saat önce, 22 mililitre taze ve sıcak tahlil tamponunu steril bir reaktif rezervuarına aktararak ve laboratuvar otomasyon robotunun yanında bırakarak son bir ortam değişikliği gerçekleştirin. Orta değişimden hemen sonra esnek plakayı inkübatöre geri aktarın.

Temel ölçümden bir saat önce plakayı ilgili ölçüm cihazına aktarın. Kontrol yazılımında Edit Protocol'ü açın ve ilgili Measurement Mode, Flex Site veya Impedance EFP'yi seçin. Protokol numarasını kaydetmeden önce bir ölçümün süpürme süresini veya uzunluğunu 30 saniyeye ve tekrarlama aralığını 10 dakikaya kadar tanımlayın.

Ardından Protokolü Başlat'ı seçin ve istenen alanları doldurmaya devam edin. Parametreler ayarlandığında, Ölçümü başlat'ı seçin. Bileşik eklemeden kısa bir süre önce beş dakikalık aralıklarla en az üç temel ölçüm gerçekleştirin.

Esnek 96 delikli plakayı ölçüm cihazından çıkarmadan her bir kuyucuktan 50 mikrolitre tahlil tamponunu çıkarın, ardından ölçüm planına göre plakanın her bir kuyucuğuna dört kat konsantre bileşik çözeltinin 50 mikrolitresinin eklenmesiyle devam edin. Bileşik eklemeden sonra, bileşik plaka düzenini ve bileşik çözeltinin hacmini tanımlamak için reaktif işaretleyicisi ekle'yi seçin. Ardından Standart Ölçümle Devam Et'i seçin veya deneysel plana göre Ölçüm Serisi ile devam edin.

Temsili Analiz, kinaz inhibitörü Erlotinib'in insan iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin kontraktilitesi üzerindeki etkilerini göstermektedir. En düşük konsantrasyonda, Erlotinib genlikte istatistiksel olarak önemsiz bir azalmaya neden olurken, Erlotinib'in mikromolar konsantrasyonları zaman ve doza bağlı kardiyotoksik etkiler göstermiştir. Etkinin başlangıcı bir mikromolar Erlotinib ile 96 saatten itibaren görülürken, 10 mikromolar Erlotinib ile tedavi, bileşik ilavesinden 24 saat sonra önemli bir azalmaya neden oldu.

10 mikromolar Epirubisin uygulamasından sonra, hücreler 24 saat içinde atmayı bıraktı. Bir mikromolar Epirubisin uygulamasıyla, 24 saat sonra genlikte ciddi bir azalma ve ardından 48 saate kadar tam bir atım bırakma izledi. 100 nanomolar'da, vuruş genliğinde zamana bağlı bir azalma gözlendi.

En düşük 10 nanomolar konsantrasyonunda, genlik sürekli dalgalandı ve Epirubisin'in etkisinin sadece doza bağlı olduğunu doğruladı. 24 saat boyunca Doksorubisin ve Nifedipin ile tedavi, hücre canlılığını konsantrasyon ve zamana bağlı olarak azaltır. Artan Nifedipin konsantrasyonlarının uygulanması üzerine, hücreler üzerindeki alan potansiyel kayıtları, normalleştirilmiş alan süresinin konsantrasyona bağlı bir kısalmasını ortaya koymaktadır.

Kardiyak kontraktiliteye ilişkin nifedipin değerlendirmesi de 10 nanomolar ve 13 nanomolar konsantrasyon ile akut ölçüm üzerine konsantrasyona bağlı genlikte önemli bir azalma göstermiştir. Hücrelerin genellikle sıcaklık ve pH değişiklikleri gibi çevresel parametrelere ve özellikle büzülme plakalarında desteklenen mekanik simülasyona duyarlı olduklarını hatırlamak önemlidir.