Name: Hidrozoan Denizanası Cladonema pacificumdaki Kök Benzeri Hücreler için Floresan In Situ Hibridizasyon ve 5-Etinil-2-Deoksiüridin Etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Keşfedin, Cladonema pacificum denizanasında kök benzeri hücreleri floresan in situ hibridizasyon ve EdU etiketleme ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik, gelişim biyolojisi ve rejenerasyon çalışmalarında hücre çoğalmasını tek hücre düzeyinde analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma AMED tarafından JP22gm6110025 Hibe Numarası altında (YN'ye) ve JSPS KAKENHI Hibe Numarası 22H02762 (YN'ye) tarafından desteklenmiştir.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Prob sentezi
<ol><li>RNA ekstraksiyonu<ol><li>Yapay deniz suyunda (ASW) kültürlenmiş üç canlı Cladonema medusae'yi, ucu kesilmiş 3,1 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve mümkün olduğunca fazla ASW'yi çıkarın. NOT: ASW, mineral tuzların bir karışımını musluk suyunda klor nötrleştirici ile çözerek hazırlanır; nihai özgül ağırlık (S.G.) 1.018 veya bin başına parça (ppt) ~ 27'dir.</li>
		<li>RNaz aktivitesini inhibe etmek için 1,5 mL tüpleri sıvı azotta dondurun. 2-merkaptoetanolün (1 μL/100 μL lizis tamponu) eklendiği toplam RNA izolasyon kitinden 30 μL lizis tamponu ekleyin ve bir homojenizatör kullanarak lizis tamponundaki numuneleri homojenleştirin. NOT: Tamponun ve numunenin tüplerden taşmasını önlemek için, az miktarda lizis tamponu ile homojenizasyon önerilir.</li>
		<li>570 μL lizis tamponu ekleyin ve toplam RNA izolasyon kitinin protokolünü takiben toplam RNA'yı çıkarın (Şekil 1).</li>
		<li>Ekstrakte edilen RNA'nın konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>cDNA sentezi<ol><li>Bir kit kullanarak, medusadan ekstrakte edilen toplam RNA'yı bir şablon olarak kullanarak cDNA'yı sentezleyin (Şekil 1 ve Tablo 1).</li>
		<li>5 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Buz üzerinde hızla soğutun.</li>
		<li>Adım 1.2.1'den itibaren karışımla cDNA sentezi yapın (Tablo 1). Pipetleme ile iyice karıştırın ve 60 dakika boyunca 42 °C'de inkübe edin.</li>
		<li>5 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Buz üzerinde hızla soğutun.</li>
		<li>Sentezlenen cDNA'nın konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün ve kullanıma kadar -20 ° C'de veya altında saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR ürün sentezi<ol><li>Bir PCR şablonu oluşturmak için, Primer-BLAST kullanarak belirli astarı tasarlayın. Referans dizisini NCBI verilerinden veya RNA-seq verilerinden elde edin. NOT: Bu protokolde kullanılan astarlar için Malzeme Tablosuna bakınız.</li>
		<li>Hedef diziyi yükseltmek için, kısıtlama enzimlerinin kullanılmasını gerektirmeyen TA klonlaması yapın. 3' ucunda bir adenin eklendiği bir PCR ürünü elde etmek için aşağıdaki ayarları kullanın: 2 dakika boyunca 98 °C; 10 s için 98 °C'lik 35 döngü, 30 s için 55-60 °C, 1 dakika boyunca 72 °C. Reaksiyonlar için Taq DNA polimeraz kullanın (Tablo 1). NOT: PCR koşullarını belirlemek için, genellikle önerilen tavlama sıcaklığı ve uzatma süresini sağlayan kullanılacak DNA polimerazına eşlik eden protokolü izleyin.</li>
		<li>PCR ürününü %1'lik bir agaroz jelinden geçirin ve ilgilendiğiniz bandı kesin. PCR ürünlerini bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak kesilmiş jellerden çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligasyon<ol><li>Reaktifleri karıştırarak (Tablo 1) ve 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe ederek PCR ürününü vektöre 3' timin çıkıntıları ile bağlayın (Şekil 1). NOT: Vektör:PCR'nin moleküler oranı 1:>3 olmalıdır. pTA2 vektör boyutu yaklaşık 3 kb'dir. PCR ürünü (kesici uç) A (kb) ve B (ng/μL) ise, alınacak kesici ucun hacmi ([50 ng vektör × A kb kesici uç])/(3 kb vektör × [1/3 ]) = 50· Bir ng kesici uç. Kesici uç konsantrasyonu B ng / μL ise, alınan hacim 50 · A/B μL kesici uç.</li>
	</ol></li>
	<li>Dönüşüm ve kaplama<ol><li>Dönüşüm için, yetkin hücreleri buz üzerinde çözün ve her biri 20 μL alikotlara dağıtın. PCR ürününü içeren plazmidlerin 1 μL'sini (yetkili hücre hacminin% 5'inden az) ve 1 s için vorteksi ekleyin. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve daha sonra 45 s için 42 ° C'de ve 1 s için vortekste inkübe edin.</li>
		<li>Yetkili hücrelere 180 μL Süper Optimal et suyu ile Katabolit bastırma (SOC) ortamı (besleyici açıdan zengin bir bakteri kültürü ortamı) ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 30 dakika sonra, yetkin hücreleri ampisilin, 5-bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D-galakto-piranosid (X-gal) ve izopropil-β-d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) içeren bir agar plakasına yayın ve 12-16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin (Şekil 1). NOT: X-gal ve IPTG, mavi ve beyaz kolonileri seçmek için kullanılır.</li>
	</ol></li>
	<li>Sıvı kültür<ol><li>Plakadaki beyaz ve mavi kolonilerden beyaz bir koloni seçin. Ampisilin ile 3-5 mL LB ortamına ekleyin ve 37 ° C'de 12-16 saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin (Şekil 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Miniprep<ol><li>Plazmidi LB ortamından bir plazmid miniprep kullanarak çıkarın (Şekil 1).</li>
		<li>Plazmid konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün.</li>
	</ol></li>
	<li>Diziyi okuyun.<ol><li>Plazmidin DNA dizisini okumak için, plazmidi Sanger dizilimi için gönderin ve ardından hedef dizinin uygun şekilde sentezlenip sentezlenmediğini doğrulamak ve hedef dizinin plazmidin içine hangi yönde yerleştirildiğini değerlendirmek için genom / transkriptom dizisi ile hizalamak için yazılım kullanın (5' ila 3' veya 3' ila 5'). NOT: Hedef dizi, 3' ucuna yakın RNA polimeraz bağlanma bölgesinden 5' ila 3' yönünde plazmid içine yerleştirilirse, in vitro transkripsiyon ile bir antisens probu üretilebilir. Hedef dizi ters 3' ila 5' yönünde yerleştirilirse, bir duyu probu (negatif kontrol) oluşturulabilir. pTA2 gibi vektörler kullanılıyorsa, amaca bağlı olarak iki transkripsiyon bağlama bölgesi kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>İn vitro transkripsiyon<ol><li>Plazmiddeki RNA polimeraz bağlanma bölgesinin dışındaki primerleri (örneğin, T7 / T3 bağlanma bölgeleri) kullanarak PCR yaparak oluşturulan plazmidden DNA şablonunu hazırlayın (Şekil 1). NOT: M13-20 ileri astar ve M13 ters astar gibi üniversal primerler, RNA polimeraz bağlanma bölgelerini içeren bir DNA şablonu hazırlamak için kullanılabilir.</li>
		<li>PCR amplifikasyonundan sonra bir jel / PCR ekstraksiyon kiti kullanarak şablonu saflaştırın.</li>
		<li>Aşağıda gösterilen reaktifleri karıştırın ve transkripsiyon reaksiyonunu 3 saat boyunca 37 ° C'de gerçekleştirin (Şekil 1 ve Tablo 1).</li>
		<li>1,5 μL DNaz ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>10 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve bir temizleme sütunu kullanarak probu transkripsiyon reaksiyon çözeltisinden arındırın.</li>
		<li>% 1'lik bir agaroz jeli üzerine 1 μL yükleyerek sentezlenmiş RNA'nın boyutunu kontrol edin ve bir spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu belirleyin. NOT: Sentezlenmiş RNA probları en az 100 ng/μL konsantrasyona sahip olmalıdır.</li>
		<li>−20 °C'de veya altında depolamak için 30 μL formamid ekleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. EdU kuruluşu ve tespiti
<ol><li>Cladonema medusae'yi (tüp başına 5-10 hayvan) 3,5 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak 1,5 mL'lik tüplere yerleştirin ve toplam 500 μL hacme kadar ASW ekleyin. 7,5 μL 10 mM EdU stok çözeltisi ekleyin ve numuneleri 22 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin (Şekil 2). EdU nihai konsantrasyonu 150 μM'dir. NOT: Üçüncü dal oluşumunu izlemek için 5-7 günlük medusae kullanın (Şekil 3A). Medusae'nin polipten ayrıldığı gün 1. gün olarak sayılır ve 5. günde, medusae tipik olarak ana dokunaçlarında üçüncü bir dal sergilemeye başlar.</li>
	<li>1 saat sonra, mümkün olduğunca çok EdU içeren ASW'yi çıkarın.</li>
	<li>Medusayı anestezik etmek için,H2 O'ya% 7 MgCl2ekleyin ve 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>H2 O'da% 7 MgCl 2'yi çıkarın ve medusae'yi ASW'de% 4 paraformaldehit (PFA) ile% 4 ° C'de gece boyunca (O.N.) sabitleyin (Şekil 2). NOT: EdU dahil edilmeden FISH yapılırken, numuneler anesteziden sonra EdU ile tedavi edilenlere benzer şekilde sabitlenebilir (adım 2.3-2.4).</li>
</ol>3. Floresan in situ hibridizasyon
<ol><li>Proteinaz tedavisi ve fiksasyon sonrası<ol><li>PFA'yı çıkarın ve numuneleri 3 x 10 dakika boyunca %0,1 Ara-20 (PBST) içeren PBS ile yıkayın. Yıkama başına 300-500 μL PBST kullanın. NOT: Bu adımdan hibridizasyonun sonuna kadar, deney eldiven ve maske takılarak RNase içermeyen bir ortamda gerçekleştirilmelidir. Bu adımdaki 1x PBS, DEPC ile arıtılmış su ile yapılmalıdır. Hibridizasyondan sonra, DEPC arıtımı olmadan su ile yapılan 1x PBS kullanılabilir. Bazı ISH ve FISH protokolleri, metanol adımlarını kullanarak numuneleri kurutur, bu da sabit numunelerin kullanıma kadar -20 ° C'de saklanmasını mümkün kılar. Gereksiz işlerden kaçınmak için, özellikle numuneler PBST'de birkaç güne kadar tutulabildiğinden, dehidrasyon işlemi bu protokolden çıkarılmıştır.</li>
		<li>Fiksasyondan sonra, numuneyi anti-DIG-POD antikoru O.N. inkübasyon adımı (adım 3.4.2) hariç, bir çalkalayıcı üzerindeki 1.5 mL tüplere yerleştirin. Yıkadıktan sonra, PBST'ye 10 mg / mL Proteinaz K stok çözeltisi ekleyin ve medusae'yi 10 dakika boyunca 37 ° C'de Proteinaz K (son konsantrasyon: 10 μg / mL) ile inkübe edin.</li>
		<li>Proteinaz K çözeltisini çıkarın ve numuneleri PBST ile 2 x 1 dakika yıkayın.</li>
		<li>Medusae'yi postfix etmek için, 1x PBS'ye% 4 PFA ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>PFA çözeltisini çıkarın ve numuneleri PBST ile 2 x 10 dakika yıkayın. NOT: Hedef gen düşük arka plan sinyaliyle yüksek oranda ifade edilirse, 3.1.2-3.1.5 adımları atlanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridizasyon<ol><li>PBST'yi çıkarın ve Hibridizasyon Arabelleği ekleyin (HB Arabelleği, Tablo 1). HB Buffer'daki numuneleri oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca inkübe edin. Başarılı bir hibridizasyon için yeterli hacim sağlayan 300-400 μL HB Arabelleği kullanın. NOT: HB Buffer, Wash Buffer 1 ve Wash Buffer 2, 20x SSC stoğu ile hazırlanmıştır. HB Arabelleği -20 °C'de veya altında depolanır ve kullanılmadan önce RT'ye getirilmelidir.</li>
		<li>HB Arabelleğini çıkarın ve yeni HB Arabelleği ekleyin. Bir hibridizasyon inkübatöründe en az 2 saat boyunca 55 ° C'de ön hibridize edin.</li>
		<li>HB Arabelleğini çıkarın ve adım 1.9.7'de depolanan probları içeren HB Arabelleği ile inkübe edin (son prob konsantrasyonu: HB Arabelleğinde 0,5-1 ng/μL). Bir hibridizasyon inkübatöründe 18-24 saat boyunca 55 °C'de hibridize edin (Şekil 2). NOT: FISH sinyal yoğunluğu ve özgüllüğü, hedef gen ekspresyonunun yanı sıra prob uzunluğu ve özgüllüğü nedeniyle değişebilir. Yoğunluğu arttırmak için hibridizasyon süresi (18-72 saat) ve sıcaklık (50-65 °C) gibi parametreler ayarlanabilir ve farklı problar test edilebilir. Spesifik olmayan sinyallerden kaçınmak için, Proteinaz K tedavisi (konsantrasyon ve süre) değiştirilebilir19.</li>
	</ol></li>
	<li>Prob çıkarma<ol><li>HB Arabelleği içeren probları çıkarın ve ardından Yıkama Arabelleği 1'i ekleyin (Tablo 1). Numuneleri Yıkama Tamponu 1 ile 55 °C'de 2 x 15 dakika boyunca yıkayın. 300-400 μL yıkama tamponu kullanın. NOT: HB Buffer içeren problar, yaklaşık on defaya kadar tekrar tekrar kullanılabilir. Atmak yerine, kullanılan HB Buffer içeren probları -20 ° C'de veya altında saklayın. Kullanmadan önce Yıkama Tamponu 1, Yıkama Tamponu 2, 2x SSC ve PBST'yi 55 °C'de önceden ısıtın.</li>
		<li>Yıkama Tamponu 1'i çıkarın ve ardından Yıkama Tamponu 2'yi ekleyin (Tablo 1). Numuneleri Yıkama Tamponu 2 ile 55 °C'de 2 x 15 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Yıkama Arabelleği 2'yi çıkarın ve ardından 2x SSC ekleyin. Numuneleri 55 °C'de 2 x 15 dakika boyunca 2x SSC ile yıkayın.</li>
		<li>2x SSC'yi kaldırın ve önceden ısıtılmış PBST'yi ekleyin. Numuneleri RT'de PBST ile 1 x 15 dakika yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Anti-DIG antikor inkübasyonu<ol><li>PBST'yi kaldırın ve% 1 engelleme arabelleği ekleyin. Bir rocker üzerinde yavaşça sallanırken numuneleri RT'de en az 1 saat boyunca inkübe edin. NOT: %5 bloke edici tampon stoğunu seyrelterek %1 bloke edici tamponu taze olarak hazırlayın (Tablo 1). Bir sonraki antikor reaksiyonundan önce numuneleri kontrol edin, çünkü numune sallanmanın bir sonucu olarak kapağın arkasına veya duvara yapışma eğilimindedir.</li>
		<li>Bloke ettikten sonra,% 1 bloke edici tamponu çıkarın, anti-DIG-POD çözeltisi ekleyin (1:500,% 1 bloke edici tamponda) ve numuneleri 4 ° C'de inkübe edin (Şekil 2). NOT: Spesifik olmayan sinyallerin algılanmasını önlemek için kuluçka süresini 12-16 saat içinde tutmaya dikkat edin.</li>
	</ol></li>
	<li>DIG etiketli probun algılanması<ol><li>Anti-DIG-POD çözümünü kaldırın ve Tris-NaCl-Tween Arabelleği ekleyin (TNT, Tablo 1). Numuneleri TNT ile RT'de 3 x 10 dakika yıkayın. NOT: tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) tekniğinin kullanılması, yaban turpu peroksidaz etiketli reaktiflere (örneğin, anti-DIG-POD) karşı daha iyi çözünürlüklü bir görüntü sağlar.</li>
		<li>Aktif Cy5-tiramid çözeltisini yapmak için amplifikasyon seyreltici tamponunda floresan boya konjuge tiramid (Cy5-tiramid) stok çözeltisini (1:50) seyreltin (Şekil 2).</li>
		<li>Mümkün olduğunca çok TNT'yi çıkarın ve ardından aktif Cy5-tiramid çözeltisini ekleyin. Örnekleri karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Numuneleri karanlıkta 3 x 10 dakika boyunca PBST ile yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>EdU'nun Tespiti NOT: EdU kiti, dahil edilmiş EdU'yu floresan sinyaller olarak algılar (Şekil 2).<ol><li>EdU algılama kokteylini hazırlamak için, bileşenleri Tablo 1'de gösterildiği gibi karıştırın. Her numune için 100 μL EdU algılama kokteyli kullanın. NOT: 10x Reaksiyon Tamponu katkı maddesini ultra saf su ile seyrelterek 1x Reaksiyon Tamponu katkı maddesi hazırlayın.</li>
		<li>PBST'yi kaldırın ve ardından EdU algılama kokteylini ekleyin. 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya yatın.</li>
		<li>PBST ile karanlıkta 3 x 10 dakika yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA boyama<ol><li>Hoechst çözeltisini hazırlamak için PBST'de Hoechst 33342'yi (1:500) seyreltin. PBST'yi kaldırın ve Hoechst çözümünü ekleyin. Örnekleri karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin (Şekil 2).</li>
		<li>Numuneleri karanlıkta 3-4 x 10 dakika boyunca PBST ile yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaj<ol><li>Numunenin ezilmesini önlemek için cam kaydırağın üzerine bir banka açın. Cam slayda vinil bant uygulayın ve ortayı oyun.</li>
		<li>Medusae'yi, ucu kesilmiş 3,1 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak sürgülü camdaki bankaya aktarın. NOT: Dokunaçların üst üste binmesine izin vermemeye dikkat edin.</li>
		<li>Herhangi bir PBST'yi P200 pipetle çıkarın ve ardından montaj ortamı olarak yavaşça% 70 gliserol ekleyin (Şekil 2). NOT: Floresanın solmasını önlemek için% 70 gliserol yerine, solmaya karşı önleyici montaj ortamı kullanılabilir.</li>
		<li>Medusae üzerine forseps ile yavaşça bir örtü parçası yerleştirin ve kapak kaymasının yan tarafını şeffaf oje ile kapatın.</li>
		<li>Hemen mikroskopi gözlemi yapmamak için slaytları karanlıkta 4 ° C'de tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntüleme<ol><li>Görüntü elde etmek için lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın. Tek hücreli çözünürlük için, 40x yağlı lens veya daha yüksek büyütme için bir lens kullanın.</li>
		<li>Görüntü alımından sonra, ImageJ/FIJI yazılımını kullanarak görüntüleri açın ve çok noktalı araç20 ile EdU+ ve/veya Nanos1+ için pozitif olan hücreleri sayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Leclère, L., Röttinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+cnidarian+muscles%3A+Function%2C+anatomy%2C+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157(2017).</li>
<li>Bosch, T. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+the+basics%3A+Cnidarians+start+to+fire%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Back to the basics: Cnidarians start to fire.</a> Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).</li>
<li>Gold, D. A., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+dynamics+in+Cnidaria%3A+Are+there+unifying+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles.</a> Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).</li>
<li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%3A+Cnidaria%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria.</a> Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).</li>
<li>Leclère, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternally+localized+germ+plasm+mRNAs+and+germ+cell%2Fstem+cell+formation+in+the+cnidarian+Clytia%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia.</a> Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).</li>
<li>Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+underlie+oral+vs+aboral+regeneration+in+the+cnidarian+Hydractinia+echinata%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata.</a> eLife. 4, 05506(2015).</li>
<li>Sinigaglia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+regulation+in+a+regenerating+jellyfish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Pattern regulation in a regenerating jellyfish.</a> eLife. 9, 54868(2020).</li>
<li>David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+stem+cells+in+Hydra%3A+Multipotency+and+decision-making%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making.</a> The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).</li>
<li>Röttinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematostella+vectensis%2C+an+emerging+model+for+deciphering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+whole-body+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration.</a> Cells. 10 (10), 2692(2021).</li>
<li>Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clytia+hemisphaerica%3A+A+jellyfish+cousin+joins+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory.</a> Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).</li>
<li>Peron, S., Houliston, E., Leclère, L. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeron%2C+S+%22Handbook+of+Marine+Model+Organisms+in+Experimental+Biology%22">Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology</a>. Boutet, A., Shierwater, B. , CRC Press. Boca. Raton, FL. 129-147 (2021).</li>
<li>Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+progression+of+nematogenesis+from+stem+cells+through+differentiation+stages+in+the+tentacle+bulb+of+Clytia+hemisphaerica+%28Hydrozoa%2C+Cnidaria%29%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria).</a> Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).</li>
<li>Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+potential+of+jellyfish%3A+Cellular+mechanisms+and+molecular+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights.</a> Genes. 12 (5), 758(2021).</li>
<li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexibly+deployed+Pax+genes+in+eye+development+at+the+early+evolution+of+animals+demonstrated+by+studies+on+a+hydrozoan+jellyfish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).</li>
<li>Fujiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+pattern+and+morphogenesis+of+medusa+tentacles+in+the+jellyfish+Cladonema+pacificum+%28Hydrozoa%2C+Cnidaria%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Letters%22%5BJournal%5D)">Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria).</a> Zoological Letters. 5 (12), 13(2019).</li>
<li>Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+controls+body+size+growth%2C+tentacle+morphogenesis%2C+and+regeneration+in+hydrozoan+jellyfish+Cladonema+pacificum%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum.</a> PeerJ. 7, 7579(2019).</li>
<li>Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+accumulation+of+interstitial+cells+generates+the+branched+structure+of+Cladonema+medusa+tentacles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles.</a> Development. 148 (23), (2021).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Angerer, L. M., Angerer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+poly+A+%2B+RNA+in+sea+urchin+eggs+and+embryos+by+quantitative+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).</li>
<li>Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+survival+in+organotypic+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60353(2019).</li>
<li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+for+animal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The cellular basis for animal regeneration.</a> Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).</li>
<li>Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-size+regulation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Organ-size regulation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240(2015).</li>
<li>Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+safer%2C+urea-based+in+situ+hybridization+method+improves+detection+of+gene+expression+in+diverse+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species.</a> Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).</li>
<li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13 (1), 8(2013).</li>
<li>Flici, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+SoxB-Hdac2+crosstalk+regulates+neurogenesis+in+a+cnidarian%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian.</a> Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).</li>
<li>Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow-cycling+stem+cells+in+hydra+contribute+to+head+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration.</a> Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).</li>
<li>Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+is+necessary+for+the+regeneration+of+oral+structures+in+the+anthozoan+cnidarian+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Developmental Biology. 12 (1), 34(2012).</li>
<li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+developmental+disparity+in+the+tentacles+of+the+moon+jellyfish+Aurelia+sp.1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1.</a> PLoS One. 10 (8), 0134741(2015).</li>
<li>Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+supports+secondary+gastrulation+in+the+moon+jellyfish+Aurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia.</a> Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).</li>
<li>Cheng, L. -C., Alvarado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+BrdU+staining+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Planarian+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians.</a> Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Proliferasyon yapan hücreler ve kök hücreler morfogenez, büyüme ve rejenerasyon gibi çeşitli süreçlerde önemli hücresel kaynaklardır21,22. Bu yazıda kök hücre belirteci Nanos1'in Cladonema medusae'de FISH ve EdU etiketlemesi ile birlikte boyanması için bir yöntem açıklanmaktadır. EdU veya BrdU etiketlemesini kullanan önceki çalışmalar, proliferatif hücrelerin dokunaç ampulleri16,17'ye lokalize olduğunu,<sup cla...

Cnidaria, sinir ve kasları olan hayvanları içeren temel olarak dallanan bir metazoan filum olarak kabul edilir ve onları hayvan gelişiminin ve fizyolojisinin evrimini anlamak için benzersiz bir konuma yerleştirir 1,2. Cnidarians iki ana gruba ayrılır: Anthozoa (örneğin, deniz anemonları, mercanlar) sadece planula larvalarına ve sapsız polip aşamalarına sahipken, Medusozoa (Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa ve Cubozoa üyeleri) tipik olarak serbest yüzme medusae veya denizanası ile planula larvaları ve polipleri şeklini alır. Cnidarians genellikle yüksek rejeneratif kapasite sergiler ve altta yatan hücresel mekanizmaları, özellikle yetişkin kök hücrelere ve proliferatif hücrelere sahip olmaları, çok dikkat çekmiştir 3,4. Başlangıçta Hydra'da tanımlanan hidrozoan kök hücreler, ektodermal epitel hücreleri arasındaki interstisyel boşluklarda bulunur ve genellikle interstisyel hücreler veya i-hücreleri3 olarak adlandırılır.
Hidrozoan i-hücreleri, çok yönlülük, yaygın olarak korunan kök hücre belirteçlerinin ekspresyonu (örneğin, Nanolar, Piwi, Vasa) ve göç potansiyeli 3,5,6,7,8 gibi ortak özellikleri paylaşır. Fonksiyonel kök hücreler olarak, i-hücreler hidrozoan hayvanların gelişimine, fizyolojisine ve çevresel tepkilerine yoğun bir şekilde katılır ve bu da yüksek rejeneratif kapasitelerini ve plastisitelerini kanıtlar3. I-hücrelerine benzer kök hücreler, hidrozoanların dışında, yerleşik model türü Nematostella'da bile tanımlanmamış olsa da, proliferatif hücreler hala somatik dokunun ve germ hattı9'un bakımı ve yenilenmesinde rol oynamaktadır. Cnidarian gelişimi ve rejenerasyonu ile ilgili çalışmalar ağırlıklı olarak Hydra, Hydractinia ve Nematostella gibi polip tipi hayvanlar üzerinde yapıldığından, denizanası türlerinde kök hücrelerin hücresel dinamikleri ve işlevleri büyük ölçüde ele alınmamıştır.
Akdeniz ve Kuzey Amerika da dahil olmak üzere dünya çapında farklı habitatlara sahip kozmopolit bir denizanası türü olan hidrozoan denizanası Clytia hemisphaerica , çeşitli gelişimsel ve evrimsel çalışmalarda deneysel bir model hayvan olarak kullanılmıştır10. Küçük boyutu, kolay kullanımı ve büyük yumurtaları ile Clytia , laboratuar bakımı için ve yakın zamanda kurulan transgenez ve nakavt yöntemleri11 gibi genetik araçların tanıtılması için uygundur ve denizanası biyolojisinin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların ayrıntılı analizi için fırsat yaratır. Clytia medusa dokunaçlarında, i-hücreleri ampul adı verilen proksimal bölgede lokalize olur ve nematoblastlar gibi progenitörler, nematositler12 de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerine farklılaşırken distal uca göç eder.
Denizanasının oral organı olan Clytia manubriumunun yenilenmesi sırasında, gonadlarda bulunan Nanos1 + i-hücreleri, hasara yanıt olarak manubriumun kaybolduğu bölgeye göç eder ve manubrium7'nin yenilenmesine katılır. Bu bulgular, Clytia'daki i-hücrelerinin aynı zamanda morfogenez ve rejenerasyonda rol oynayan fonksiyonel kök hücreler gibi davrandığı fikrini desteklemektedir. Bununla birlikte, i-hücrelerinin özelliklerinin Hydra ve Hydractinia 3 gibi temsili polip tipi hayvanlar arasında farklılık gösterdiği göz önüne alındığında, kök hücrelerin özelliklerinin ve işlevlerinin denizanası türleri arasında çeşitlendirilmesi mümkündür. Ayrıca, Clytia hariç, diğer denizanaları için deneysel teknikler sınırlandırılmıştır ve proliferatif hücrelerin ve kök hücrelerin ayrıntılı dinamikleri bilinmemektedir13.
Hidrozoan denizanası Cladonema pacificum, su pompası veya filtreleme sistemi olmadan laboratuvar ortamında tutulabilen yeni bir model organizmadır. Cladonema medusa, Cladonematidae ailesinde ortak bir özellik olan dallanmış dokunaçlara ve ampul14'ün yakınındaki ektodermal tabakada ocellus adı verilen bir fotoreseptör organına sahiptir. Dokunaç dallanma süreci, dokunaçların adaksiyal tarafı boyunca görünen yeni bir dallanma bölgesinde meydana gelir. Zamanla, dokunaçlar uzamaya ve dallanmaya devam eder, eski dallar uç15'e doğru itilir. Ek olarak, Cladonema dokunaçları amputasyondan sonra birkaç gün içinde yenilenebilir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, Cladonema16,17'de dokunaç dallanmasında ve rejenerasyonunda çoğalan hücrelerin ve kök benzeri hücrelerin rolünü ortaya koymuştur. Bununla birlikte, geleneksel in situ hibridizasyon (ISH), Cladonema'daki gen ekspresyonunu görselleştirmek için kullanılırken, düşük çözünürlüğü nedeniyle, kök hücre dinamiklerini hücresel düzeyde ayrıntılı olarak gözlemlemek şu anda zordur.
Bu yazıda Cladonema'daki kök benzeri hücrelerin FISH ile görselleştirilmesi ve hücre proliferasyonunun bir belirteci olan EdU ile birlikte boyanması için bir yöntem açıklanmaktadır18. Bir kök hücre belirteciolan 5,17 olan Nanos1'in ekspresyon paternini, tek hücre düzeyinde kök benzeri hücre dağılımının tanımlanmasına izin veren FISH tarafından görselleştiriyoruz. Ek olarak, Nanos1 ekspresyonunun EdU etiketlemesi ile birlikte boyanması, aktif olarak çoğalan kök benzeri hücrelerin ayırt edilmesini mümkün kılar. Hem kök benzeri hücreleri hem de proliferatif hücreleri izlemek için kullanılan bu yöntem, dokunaç dallanması, doku homeostazı ve Cladonema'da organ rejenerasyonu dahil olmak üzere çok çeşitli araştırma alanlarına uygulanabilir ve benzer bir yaklaşım diğer denizanası türlerine de uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Wako</td><td>137-06862</td><td></td></tr><tr><td>3.1 mL transfer pipeti</td><td>Thermo Scientific</td><td>233-20S</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-kloro-3-indolil-&beta;-D-galaktopiranosid (X-Gal)</td><td>Wako</td><td>029-15043</td><td></td></tr><tr><td>anti-DIG-POD</td><td>Roche</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Nanos1 ileri astar</td><td></td><td></td><td>5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Nanos1 ters astar</td><td></td><td></td><td>5'-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Piwi ileri astar</td><td></td><td></td><td>5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Piwi ters astar</td><td></td><td></td><td>5'- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3'</td></tr><tr><td>Görüntüleme için Click-iT EdU Hücre Proliferasyon Kiti, Alexa Fluor 488 boya</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>C10337</td><td>EdU kiti</td></tr><tr><td>Coroline off</td><td>GEX Co. ltd</td><td>N / A</td><td>klor nötrleştirici</td></tr><tr><td>DIG Nükleik Asit Tespit Kiti Bloke Reaktifi</td><td>Roche</td><td>11175041910</td><td>bloke edici tampon&nbsp;</td></tr><tr><td>DIG RNA etiketleme karışımı&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>ECOS yetkili hücre DH5 ve alfa;</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-06233</td><td>yetkili hücre</td></tr><tr><td>Hızlı gen Jel / PCR Ekstraksiyon kiti</td><td>Hızlı gen</td><td>FG-91302</td><td>jel ekstraksiyon kiti</td></tr><tr><td>Hızlı gen plazmid mini kiti</td><td>Hızlı gen</td><td>FG-90502</td><td>plazmid miniprep</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Wako&nbsp;</td><td>068-00426</td><td></td></tr><tr><td>Domuz SIGMA-ALDRICH'ten heparin sodyum tuzu</td><td>&nbsp;</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil-&beta;-D(-)-tiyokalaktopiranosit (IPTG)</td><td>Wako</td><td>096-05143</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Invitrogen</td><td>22700-025</td><td>agar plakası</td></tr><tr><td>LB Et Suyu Baz</td><td>İnvitrojen</td><td>12780-052</td><td>LB orta</td></tr><tr><td>Maleik asit</td><td>Wako</td><td>134-00495</td><td></td></tr><tr><td>mini Hızlı döndürme RNA sütunları</td><td>Roche</td><td>11814427001</td><td>temizleme sütunu</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako&nbsp;</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Wi-Fi ile NanoDrop OneC Mikro Hacimli UV-Vis Spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>spektrofotometre</td></tr><tr><td>Polioksietilen (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td><td>Wako&nbsp;</td><td>166-21115</td><td></td></tr><tr><td>PowerMasher 2</td><td>nippe&nbsp;</td><td>891300</td><td>homojenizatör</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Nacarai Tesque&nbsp;</td><td>29442-14</td><td></td></tr><tr><td>RNase İnhibitörü</td><td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kiti</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>74004</td><td>toplam RNA izolasyon kiti</td></tr><tr><td>RQ1 RNaz İçermeyen Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Tuzlu Sodyum Sitrat Tamponu 20x toz (20x SSC)</td><td>TaKaRa</td><td>T9172</td><td></td></tr><tr><td>SEA LIFE</td><td>Marin Tech</td><td>N/A</td><td>mineral tuzları</td></tr><tr><td>karışımı T3 RNA polimeraz&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimeraz&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>TAITEC HB-100</td><td>TAITEC</td><td>0040534-000</td><td>Hibridizasyon eksüvatörü</td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>Taq DNA polimeraz</td></tr><tr><td>TaKaRa PrimeScript 2 1st iplikçik cDNA Sentez Kiti</td><td>TaKaRa</td><td>6210A</td><td>cDNA sentez kiti</td></tr><tr><td>Hedef Klon</td><td>TOYOBO&nbsp;</td><td>TAK101</td><td>pTA2 Vektör</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>TSA Plus Siyanin 5</td><td>AKOYA Biosciences</td><td>NEL745001KT</td><td>tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) tekniği</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>lazer taramalı konfokal mikroskop</td></tr></tbody></table>

hidrozoan denizanası cladonema pacificum'daki kök benzeri hücreler için floresan in situ hibridizasyon ve 5-etinil-2'-deoksiüridin etiketleme

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Deniz anemonları, mercanlar ve denizanası da dahil olmak üzere Cnidarian'lar, sapsız poliplerde ve serbest yüzme medusalarında ortaya çıkan çeşitli morfoloji ve yaşam tarzları sergilerler. Hydra ve Nematostella gibi yerleşik modellerde örneklendiği gibi, kök hücreler ve / veya proliferatif hücreler cnidarian poliplerin gelişimine ve yenilenmesine katkıda bulunur. Bununla birlikte, çoğu denizanasında, özellikle medusa aşamasında, altta yatan hücresel mekanizmalar büyük ölçüde belirsizdir ve bu nedenle, spesifik hücre tiplerini tanımlamak için sağlam bir yöntem geliştirmek kritik öneme sahiptir. Bu yazıda, hidrozoan denizanası Cladonema pacificum'daki kök benzeri çoğalan hücreleri görselleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Cladonema medusae, yetişkin evreleri boyunca sürekli büyüyen ve rejeneratif kapasiteyi koruyan dallanmış dokunaçlara sahiptir ve çoğalan ve / veya kök benzeri hücreler tarafından düzenlenen hücresel mekanizmaları incelemek için eşsiz bir platform sağlar. Bir kök hücre belirteci kullanan tam montajlı floresan in situ hibridizasyon (FISH), kök benzeri hücrelerin tespit edilmesine izin verirken, bir S faz belirteci olan 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ile nabız etiketlemesi, çoğalan hücrelerin tanımlanmasını sağlar. Hem FISH hem de EdU etiketlemesini birleştirerek, sabit hayvanlar üzerinde aktif olarak çoğalan kök benzeri hücreleri tespit edebiliriz ve bu teknik, model olmayan denizanası türleri de dahil olmak üzere diğer hayvanlara geniş çapta uygulanabilir.

Kladonoma dokunaçları, morfogenez ve rejenerasyonun hücresel süreçlerini incelemek için bir model olarak kullanılmıştır15,16,17. Tentacle yapısı, kök benzeri hücrelerin veya i-hücrelerinin, dokunaç ampulü adı verilen proksimal bölgede bulunduğu ve ampulün distal bölgesinin arkasına adaksiyal taraf boyunca sırayla yeni dalların eklendiği bir epitel tüpünden oluşur (Şekil 3A)<sup class="xref"...

Burada, denizanası Cladonema'daki kök benzeri çoğalan hücreleri görselleştirmek için bir protokol açıklıyoruz. Bir kök hücre belirteci ile tam montajlı floresan in situ hibridizasyon, kök benzeri hücrelerin tespit edilmesine izin verir ve 5-etinil-2'-deoksiüridin etiketlemesi, çoğalan hücrelerin tanımlanmasını sağlar. Birlikte, aktif olarak çoğalan kök benzeri hücreler tespit edilebilir.

Hidrozoan Denizanası Cladonema pacificum'daki Kök Benzeri Hücreler için Floresan In Situ Hibridizasyon ve 5-Etinil-2'-Deoksiüridin Etiketleme

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Nanos1 ekspresyonunun EdU etiketleme ile birlikte boyanması, aktif olarak çoğalan kök benzeri hücrelerin ayırt edilmesini mümkün kılar. Denizanası Cladonema'da kök benzeri hücrelerin tek hücre seviyesinde dağılımını tanımlayabiliriz. Kök benzeri hücreleri ve çoğalan hücreleri aynı denizanası örneğinde görselleştirebiliriz, bu da çoğalan ve çoğalmayan kök benzeri hücrelerin tespit edilmesini sağlayarak kök hücre heterojenliğinin anlaşılmasına yol açar.Kök hücreleri içeren hayvan modellerini kullanarak gelişimsel biyoloji ve rejenerasyon çalışmaları. Hidrozoon denizanası Cladonema pacificum, herhangi bir özel sistem olmadan laboratuvar ortamında tutulabilen, gelişmekte olan bir model organizmadır. Cladonema medusae dallanmış dokunaçlara sahiptir.Dallanma, dokunacın adaksial tarafı boyunca yeni bir bölgede meydana gelir. Zamanla, dokunaçlar uzamaya ve dallanmaya devam eder, eski dallar uca doğru itilir. Dokunaçlar ayrıca amputasyondan sonraki birkaç gün içinde yenilenebilir.Küçük boyutlu, kolay kullanımı ve yetişkin kök hücrelerin veya kök benzeri hücrelerin varlığı, Cladonema'yı kök hücrelerin farklı süreçlerdeki rolünü araştırmak için iyi bir sistem haline getirir. Başlamak için, Cladonema medusae'yi 3,5 mililitrelik bir transfer pipeti kullanarak 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin ve toplam 500 mikrolitre hacme kadar ASW ekleyin. 7,5 mikrolitre 10 milimolar EdU stok çözeltisi ekleyin ve numuneleri 22 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin.Bir saat bekleyin ve mümkün olduğunca EdU içeren ASW'yi çıkarın. Medusae'yi anestezi altına aldıktan sonra, beş dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Medusae'yi ASW'de% 4 paraformaldehit ile gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin.Proteinaz tedavisi ve fiksasyon sonrası için, paraformaldehiti çıkarın ve numuneleri% 0.1 içeren PBS ile yıkayınHer biri 10 dakika boyunca 20 üç kez ara. PBST'yi çıkarın ve hibridizasyon arabelleğini ekleyin. Hibridizasyon tamponundaki numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.Hibridizasyon tamponunu çıkarın ve yeni hibridizasyon tamponunu ekleyin. Bir hibridizasyon inkübatöründe en az iki saat boyunca 55 santigrat derecede ön hibridize edin. Hibridizasyon tamponunu çıkarın ve probları içeren hibridizasyon tamponu ile inkübe edin.Bir hibridizasyon inkübatöründe 18 ila 24 saat boyunca 55 santigrat derecede hibridize edin. Ardından, prob çıkarma işlemine devam edin. Probları içeren hibridizasyon tamponunu çıkarmakla başlayın ve ardından yıkama tamponu ekleyin.Numuneleri 55 santigrat derecede 15 dakika boyunca iki kez yıkama tamponu ile yıkayın. Yıkama tamponu birini çıkarın ve ikinci yıkama tamponunu ekleyin. Numuneleri 55 santigrat derecede 15 dakika boyunca iki kez yıkama tamponu ile yıkayın.İki yıkama tamponunu çıkarın ve ardından 2X SSC ekleyin. Numuneleri 2X SSC ile 55 santigrat derecede 15 dakika boyunca iki kez yıkayın. 2X SSC'yi kaldırın ve önceden ısıtılmış PBST'yi ekleyin.Numuneleri oda sıcaklığında PBST ile 15 dakika yıkayın. Anti-DIG antikor inkübasyonu için, PBST'yi çıkararak başlayın ve% 1 bloke edici tampon ekleyin. Bir rocker üzerinde yavaşça sallanırken numuneleri oda sıcaklığında en az bir saat boyunca inkübe edin.Engelledikten sonra,% 1 engelleme arabelleğini çıkarın. Anti-DIG-POD çözeltisi ekleyin ve numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. DIG etiketli probu tespit etmek için, anti-DIG-POD çözeltisini çıkarın ve tris sodyum klorür Ara tamponu ekleyin.Numuneleri tris sodyum klorür Ara tamponu ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Aktif Cy5 tiramid çözeltisini yapmak için floresan boya konjuge tiramid stok çözeltisini amplifikasyon seyreltici tamponunda seyreltin. Mümkün olduğunca çok tris sodyum klorür Ara tamponunu çıkarın ve ardından aktif Cy5 tiramid çözeltisini ekleyin.Örnekleri karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin. Numuneleri karanlıkta 10 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın. EdU algılama kokteylini hazırlamak için bileşenleri karıştırın.PBST'yi kaldırın ve ardından EdU algılama kokteylini ekleyin. Numuneyi karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. PBST ile karanlıkta 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.DNA boyama için, Hoechst çözeltisini hazırlamak için PBST'de Hoechst'i seyreltin. PBST'yi kaldırın ve Hoechst çözümünü ekleyin. Örnekleri karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.Numuneleri karanlıkta 10 dakika boyunca PBST ile üç ila dört kez yıkayın. Montaj için daha sonra, ucu kesilmiş bir transfer pipeti kullanarak medusae'yi slayt camındaki bankaya aktarın. Medusae üzerine forseps ile yavaşça bir örtü parçası yerleştirin ve kapak kaymasının yan tarafını şeffaf oje ile kapatın.Nanos1 ekspresyonu ve EdU pozitif hücrelerin birlikte etiketlenmesi, dokunaçtaki kök benzeri hücrelerin ve proliferatif hücrelerin uzamsal modelini ortaya çıkardı. EdU pozitif hücreler dokunaç ampulü boyunca daha yaygın olarak dağılırken, dokunaç ampulünde ve yeni dallanma bölgesinde daha lokal olarak biriken Nanos1 pozitif hücreler, kök benzeri hücrelerin ve çoğalan hücrelerin farklı dağılımlarının gelişimsel zamanlamaya ve farklı aşamalara bağlı olarak tespit edildiğini göstermektedir. EdU ve Nanos1'un birlikte etiketlenmesi, hücrelerin% 19.79'unda gözlendi ve bu hücrelerin aktif olarak çoğalan bir kök hücre popülasyonu olduğunu düşündürdü.İlginç bir şekilde, hücrelerin% 14.46'sının, ampulün ortasında ve yeni dallanma bölgesinde EdU pozitif Nanos1 negatif olduğu bulundu ve bu da kök benzeri olmayan proliferatif hücrelerin varlığını düşündürdü. Buna karşılık, hücrelerin% 26.32'sinin, ampulün tabanında ve yeni dallanma bölgesinde EdU negatif Nanos1 pozitif olduğu gözlendi; bu, yavaş döngülü veya sessiz bir kök hücre popülasyonunun varlığını gösteriyordu. Kısa inkübasyon süresine sahip EdU nabız etiketlemesi, kök benzeri hücreler ve kök benzeri olmayan hücreler arasında sadece proliferatif hücrelerin tespit edilmesini sağlar.EdU için kuluçka süresini değiştirirken ve uzun süreli kovalama deneylerini birleştirirken, yavaş döngülü kök hücreler veya soy ve farklılaşmış hücreler de dahil olmak üzere diğer hücre tipleri işaretlenebilir.

fluorescent-situ-hybridization-5-ethynyl-2-deoxyuridine-labeling-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Bu protokol, Flüoresans gerçekleştirmek için deneysel bir işlem...

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Biz Branchiostoma lanceolatum ve döllenmemiş oosit içine burada mRNA enjeksiyonundan sonra floresan proteinleri sağlam ve verimli bir ifade rapor. Bu bazal kordalısı içinde mikroenjeksiyon tekniği gelişimi, gelişmekte olan bu model sistemde teknik yenilikleri geniş kapsamlı vivo görüntüleme ve gen-spesifik manipülasyonlar dahil önünü açacak.

Floresan protein ifadesindeki Branchiostoma lanceolatum Döllenmemiş Oositlerinin içine mRNA Enjeksiyon

Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Işık levha bazlı floresan mikroskobu ile böcek embriyonlarından morfojenezini Görüntüleme tekniğin durumu haline gelmiştir. Bu protokol ana hatlarıyla ve Tribolium castaneum embriyolar için uygun üç montaj teknikleri karşılaştırır, canlı görüntüleme için uygun iki yeni ısmarlama transjenik çizgileri sunar, önemli bir kalite kontrol anlatılır ve mevcut deney sınırlamaları gösterir.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

Bu iletişim kuralı, parafin içinde gömülü ve cam slaytlar kesitli yetişkin mercan örnekleri in situ hibridizasyon gerçekleştirileceği hedeftir. Bu bir RNA Anti-anlamda prob dokulara parafin katıştırılmış uzamsal ifade görselleştirmek için kullanılan bir nitel yöntemidir.

Situ Parafin gömülü yetişkin mercan örnekleri için hibridizasyon teknikleri

Floresan kalsiyum görüntülemeile in situ hibridizasyonunu birleştiren ve deneycinin kalsiyum aktivitesi modellerini tek hücreli düzeyde gen ekspresyonu profilleriyle ilişkilendirmesine olanak tanıyan iki parçalı bir protokol salıyoruz.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Keşfedin, Cladonema pacificum denizanasında kök benzeri hücreleri floresan in situ hibridizasyon ve EdU etiketleme ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik, gelişim biyolojisi ve rejenerasyon çalışmalarında hücre çoğalmasını tek hücre düzeyinde analiz etmenizi sağlar.

Hidrozoan Denizanası Cladonema pacificumdaki Kök Benzeri Hücreler için Floresan In Situ Hibridizasyon ve 5-Etinil-2-Deoksiüridin Etiketleme (Video) | JoVE Journal

Hidrozoan Denizanası Cladonema pacificum'daki Kök Benzeri Hücreler için Floresan In Situ Hibridizasyon ve 5-Etinil-2'-Deoksiüridin Etiketleme

Daha fazla video keşfet