Name: Farelerde Gürültüye Bağlı İşitme Kaybı için Değiştirilmiş Deneysel Koşullar ve İşitme Fonksiyonu ve Dış Tüylü Hücre Hasarının Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Öğrenin farelerde gürültüye bağlı işitme kaybı protokolünü ve ABR ile işitme eşik değişikliklerini değerlendirmeyi. Bu yöntem dış tüylü hücre hasarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tayvan Hükümeti Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (MOST) (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3) ve Mackay Tıp Fakültesi'nden (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03) okul içi araştırma hibelerine teşekkür ederiz.

Bu çalışmadaki hayvan deneyleri, Mackay Tıp Fakültesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Sekiz haftalık Erkek C57BL / 6J fareleri, Ulusal Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nden (New Taipei City, Tayvan) satın alındı. Tüm fareler, standart hayvan protokolüne uygun olarak yetiştirildi ve barındırıldı.
1. Farelerde NIHL indüksiyonu
<ol><li>Deney fareleri için kafesi hazırlayın<ol><li>Bunu yapmak için 14 cm × 17 cm × 24 cm boyutlarında bir fare kapanı kafesi kullanın. Dört parça oluklu plastik levhayı uygun boyutlarda kesin ve kafese sığacak şekilde (13 cm × 23 cm ve 13 cm × 16 cm).</li>
		<li>Farelerin ayaklarının ağ ızgarası tarafından kesilmesini önlemek için, parçalardan ikisini sırasıyla alta ve arka tarafa yerleştirin. Kafes içindeki boşluğu dörde bölmek için diğer iki parçayı birbirine dik olarak yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bu çalışmayı ses geçirmez bir kutuda gerçekleştirin. Kafesin önüne 8.5 cm bir hoparlör yerleştirin ve hem hoparlörü hem de kafesi ses geçirmez bir kutuya yerleştirin.</li>
	<li>CLIO uygulama yazılımını açın</li>
	<li>İmleci hoparlör simgesine getirin, ardından TwoSin'e tıklayın. Frekans 1 değerini 1000 Hz, Frekans 2 değerini 6000 Hz olarak girin ve değiştirin ve sesi çalmaya başlamak için Tamam'a tıklayın.</li>
	<li>Leq sekmesi altında, dBV'yi dBSPL olarak değiştirin. Yazılım arayüzünde saati ayarladıktan sonra, sesi çalmak için yeşil üçgen düğmesine tıklayın.</li>
	<li>Gürültü seviyesini kalibre etmek için hoparlörün önüne 8.5 cm mesafeden bir mikrofon yerleştirin (bkz. Ek Dosya 1). Gürültü seviyesini 125 dB SPL-A'ya ayarlayın ve gürültü seviyesinin yeterince kararlı olduğundan emin olmak için en az 3 dakika boyunca sürekli izleyin. Gürültüyü oluşturmak ve kontrol etmek için bir jeneratör, bir analizör ve bir amplifikatör kullanın. (Şekil 1) NOT: Operatörün işitme duyusuna zarar vermemek için bu adımı ses geçirmez bir kutuda yapın.</li>
	<li>Gürültüye maruz kalmak için dört erkek C57BL/6J fareyi kafese yerleştirin (her çeyrek için bir tane). Gürültüye maruz kalma sırasında fareleri her çeyrekte rastgele atayın. Gürültüye maruz kalma sırasında gürültü seviyesini izlemek için kafesin üstüne bir mikrofon yerleştirin (Şekil 2). NOT: Operatörün işitme duyusuna zarar vermemek için bu adımı ses geçirmez bir kutuda yapın.</li>
	<li>Fareleri, art arda 1 gün boyunca günde 6 saat boyunca sürekli olarak 6 kHz ve 5 kHz frekanslarında gürültüye maruz bırakın.</li>
	<li>ABR'yi ölçerek gürültüye maruz kaldıktan 1 gün sonra (yani 6. günde) farelerin işitme eşiklerini ölçün. Bu ABR ölçümlerini gürültüye maruz kaldıktan 1 hafta sonra (yani 13. günde) tekrarlayın. ABR ölçümlerinden sonra, ilgili tüm fareleri sakride edin ve koklealarını toplayın (Şekil 3).</li>
</ol>2. İşitme eşiğinin işitsel beyin sapı yanıtı (ABR) temelli değerlendirmesi
<ol><li>Küçük hayvanlar için özel olarak tasarlanmış ticari bir ABR test sistemi kullanın10.</li>
	<li>Genel anestezi için farelere intraperitoneal olarak tiletamin ve zolazepam (40 mg / kg) ve ksilazin (9.3 mg / kg) karışımı enjekte edilir. NOT: ABR değerlendirmesi ~2 saat sürer. Fare anestezi altındayken kuruluğu önlemek için bir ısıtma yastığı ile termal destek sağladığınızdan ve göz merhemi uyguladığınızdan emin olun.</li>
	<li>Genel anestezi altında farede ABR'yi ölçün. İşitme eşiğini ölçmek için subdermal iğne elektrotlarını (12 mm) tepe noktasına, sol kulağın kulak kepçesinin arkasına ve kuyruğun yanına yerleştirin.</li>
	<li>Hayvanın sol kulağından 1 cm uzağa yerleştirilmiş bir hoparlör kullanarak akustik uyaranlar sunun.</li>
	<li>Akustik uyaranları kontrol etmek için bir osiloskop kullanın. Uyaranlar için Sinüs Dalgası'nı ve pencere ölçeği için 10 k'yi seçin. Akustik uyaranların istenen frekansını elde etmek için Frekans düğmesini çevirin.</li>
	<li>Fonksiyon üreteci üzerindeki AMLP düğmesini çevirerek uyaran yoğunluğunu ayarlayın. AMLP düğmesini kalibrasyondan hesaplanan uygun bir voltaja çevirerek istenen uyaran yoğunluğunu elde edin.</li>
	<li>ABR ölçümlerini, 10 dB adım boyutuyla 10 dB SPL'den 100 dB SPL'ye kadar bir dizi uyaran yoğunluğu altında toplayın. NOT: İşitme eşiğini ses geçirmez bir kutuda ölçün. Toplanan sinyalde fark edilebilir bir Dalga V'ye yol açabilecek minimum uyaran yoğunluğu seviyesinin ABR eşiği10,11 olduğu varsayılmıştır (Şekil 4). ABR sonrası değerlendirme, anesteziden iyileşene kadar hayvanı izleyin (~ 1 saat).</li>
</ol>3. Mikroskobik inceleme
<ol><li>Hasat edilen dokunun sabitlenmesi<ol><li>ABR ölçümlerinden sonra, mikroskobik inceleme için intraperitoneal olarak tiletamin ve zolazepam (100 mg/kg) ve ksilazin (23.25 mg/kg) karışımı enjekte edilerek fareyi sakrifiye edin.</li>
		<li>Kokleaları fareden toplayın ve 4 °C'de en az 8 saat boyunca fiksasyon için (iki koklea/mL) hemen %10 formaldehite (FA) daldırın.</li>
		<li>Fiksasyonun ardından, FA çözeltisini 4 ° C'de 3-4 gün boyunca kireç çözme için% 10 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile değiştirin. Ardından, kokleaların yeterince yumuşadığını doğrulamak için her bir kokleayı cımbızla kontrol edin.</li>
		<li>Kokleaları fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin ve spiral şekilli Corti (OC) organını (her biri kireçten arındırılmış koklea) üç bölüme ayırın - bazal dönüş, orta dönüş ve apikal dönüş - doku boyama için.</li>
		<li>Diseksiyon mikroskobu altında (büyütme: 8x-35x), dekalsifiye kokleaların kemik yapılarını (skala vestibuli, skala timpani ve modiolus) çıkarın ve OC dahil yumuşak dokuyu elde edin (kalınlık: yaklaşık 40 μm).</li>
	</ol></li>
	<li>Koklea immünofloresan boyama<ol><li>Bloke edici tamponun hazırlanması: PBS'de% 2 sığır serum albümini (BSA) ve% 0.2 Triton X-100 çözeltileri hazırlayın.</li>
		<li>Boyanacak dokuyu Petri kabından bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve dokuyu oda sıcaklığında (RT) 2 saat boyunca 0.1 mL bloke edici tampona daldırın.</li>
		<li>Myo7A primer antikor tamponunun hazırlanması: Bloke edici tampondaki Myo7A primer antikorunu 1:200 hacim oranında seyreltin.</li>
		<li>Mikrosantrifüj tüpündeki dokuyu RT'de 2 saat boyunca 100 μL Myo7A primer antikor tamponu ile tedavi edin.</li>
		<li>Dokuyu PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez durulayın.</li>
		<li>Myo7A sekonder antikoru (Myo7A-Rb-488) ve falloidin antikoru (falloidin-594) tamponunun hazırlanması: Bloke edici tamponda Myo7A sekonder antikoru (1:400) ve falloidin antikoru (1:200) seyreltin.</li>
		<li>Dokuyu RT'de 2 saat boyunca 100 μL Myo7A ikincil antikoru ve falloidin antikoru tamponu ile tedavi edin.</li>
		<li>Antikor + falloidin antikor tedavisinden sonra, dokuyu PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez durulayın.</li>
		<li>Durulanan dokuyu mikrosantrifüj tüpünden, kesik uçlu 1 mL'lik bir plastik transfer pipeti kullanarak PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın.</li>
		<li>Mikroskobik incelemeye hazırlanmak için dokuyu açın, bir cam slayt üzerine yerleştirin ve tamamen kaplamak için dokuya 15 μL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) florormount ortamı ekleyin. Dokunun üzerine nazikçe bir cam lamel yerleştirin. Oje ile kapatmadan önce slaytı gece boyunca RT'de bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntü edinme<ol><li>Dik bir floresan mikroskobu ve görüntü alma yazılımı kullanarak 2D görüntüler elde edin.</li>
		<li>Mikroskobik incelemeyi gerçekleştirmeden önce, dokuyu görüş alanında ortalayın ve hassasiyeti ISO 100'e ayarlayın. Başlangıçta yazılımın Otomatik Mod düğmesine tıklayarak pozlama süresini ayarlayın ve ardından sinyal-gürültü oranını optimize etmek için Ayarla düğmesine tıklayarak manuel olarak ince ayar yapın.</li>
		<li>Floresan küpünü döndürerek floroforları uyarmak için gelen ışığın dalga boyunu ayarlayın. Farklı floresan etiketlerden kaynaklanan emisyonu işaretlemek için sahte renkler kullanıldı (mavi ışık: DAPI; yeşil ışık: Myo7A; kırmızı ışık: phalloidin).</li>
		<li>Doku örneğini tarayarak, görüntüleme verilerini .tif ve .jpg görüntü dosyaları olarak oluşturun ve toplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481">https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481</a> (2021).</li>
<li>Fernandez, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+synaptopathy+with+and+without+sensory+cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss.</a> Neuroscience. 427, 43-57 (2020).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+X-linked+inhibitor+of+apoptosis+protein+protects+against+noise-induced+hearing+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice.</a> Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).</li>
<li>Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+noise+exposure+on+auditory+brainstem+responses+and+number+of+presynaptic+ribbons+in+inner+hair+cells+of+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li>
<li>Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+stress+response+inhibition+provides+sex-dependent+protection+against+noise-induced+cochlear+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18063(2020).</li>
<li>Amanipour, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+mice%3A+Effects+of+high+and+low+levels+of+noise+trauma+in+CBA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).</li>
<li>Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+duffy+antigen+receptor+for+chemokines+ameliorated+cochlear+damage+from+noise+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173(2018).</li>
<li>Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+hearing%3A+a+summary+of+recent+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oto-laryngologica%22%5BJournal%5D)">Estrogen and hearing: a summary of recent investigations.</a> Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).</li>
<li>Tsai, S. C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intravenous+administration+of+skin-derived+mesenchymal+stem+cells+ameliorates+hearing+loss+and+preserves+cochlear+hair+cells+in+cisplatin-injected+mice%3A+SMSCs+ameliorate+hearing+loss+and+preserve+outer+hair+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice.</a> Hearing Research. 413, 108254(2022).</li>
<li>Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+restoration+in+a+deaf+animal+model+with+intravenous+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).</li>
<li>Yu, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+evaluation+of+ribbon+synapses+at+specific+frequency+regions+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59189(2019).</li>
</ol>

İfşa edilecek çıkar çatışması yok.

NIHL iki türe ayrılabilir: işitme eşiğinin zamansal kaymasını gösteren geçici NIHL ve kalıcı bir işitme eşiği kayması ile öne çıkan kalıcı NIHL. 6. günde (gürültüye maruz kaldıktan 1 gün sonra) gözlemlediğimiz işitme kaybının bu iki tipin bir kombinasyonu olduğuna inanılmaktadır. Bu durumda, işitme eşiği, işitme kaybının zamansal bileşeni nedeniyle zaman içinde kademeli bir iyileşme gösterecektir. Ön deneysel çalışmalarımızda, aynı kurulum ve hayvanlarla elde edilen sonuçlar, 2 günlük gürültüye maruz kalmanın ...

Dünya çapında yaklaşık 1,3 milyar insan gürültüye maruz kalma nedeniyle işitme kaybından muzdariptir1. Bu çalışmada, gürültüye bağlı işitme kaybını (NIHL) indüklemek ve doğrulamak için adım adım net bir süreç oluşturmayı amaçladık. NIHL, tüy hücrelerinin (HC'ler) ve spiral ganglion nöronlarının (SGN'ler) dejenerasyonu/yıkımı, HC stereosilialarındaki hasar ve/veya koklear iç HC'ler ile SGN'ler arasındaki sinapsların kaybından kaynaklanır. Bu tür anormallikler, NIHL'nin yanı sıra kulak çınlamasına ve konuşma algısında bozulmaya (özellikle karmaşık bir akustik ortamda) da neden olabilir. Sosyal, psikolojik ve bilişsel işlevler bu fizyolojik eksikliklerden sırayla etkilenebilir 2,3,4,5,6.
Farelere dayalı NIHL ile ilgili klinik öncesi çalışmalarda, en popüler fare suşları CBA/CaJ 2,3,6,7 ve C57BL/6 4,5,8'dir. Ayrıca erkek 3,4,7 fareler, östrojenin işitme üzerinde koruyucu bir etkisi olduğu için dişi farelerden daha yaygın olarak kullanılır. Bu nedenle, bu çalışmada sadece erkek fareler kullandık9. Literatüre baktıktan sonra uygulanan gürültünün frekansları olarak 1 kHz ve 6 kHz'i seçtik. Uygulanan gürültünün yoğunluğu 115 dB SPL-A (kafesi çevreleyen) ile 125 dB SPL-A (kafesin merkezinde) arasındaydı. Deney farelerini günde 6 saat boyunca sürekli olarak gürültüye maruz bıraktıktan sonra, art arda 5 gün boyunca, işitme eşiğinde optimum bir artış, deney farelerinde optimum ölçüde NIHL üretildiğini gösterdi. Hayvanlarla ilgilenme, deney düzeneğini oluşturma ve gürültüyü indükleme işlemlerinin tümü, sağlanan protokolde adım adım açıkça açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 1/4" CCP Serbest Alan Standart Mikrofon Seti</td><td>GRAS</td><td>428158</td><td>Gürültüye maruz kalma için</td></tr><tr><td>Amplifikatör Giriş Modülü, AMI100D</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>İşitsel beyin sapı yanıtı için</td></tr><tr><td>Biyo-amplifikatör, BIO100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>İşitsel beyin sapı yanıtı için</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>SIGMA</td><td>A9647</td><td>İmmünofloresan boyama</td></tr><tr><td>Cellsens yazılımı</td><td>Olympus yaşam bilimleri</td><td></td><td>Görüntü elde etme</td></tr><tr><td>Oluklu plastik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td>İmmünofloresan boyama</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>SIGMA</td><td>E5134</td><td>Dekalsifikasyon</td></tr><tr><td>Uyarılmış Tepki Amplifikatörü, ERS100C</td><td>İşitsel beyin sapı yanıtı</td><td></td> için BIOPAC <td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>APLHA F030410</td><td></td><td>Koklear Yüksek Performanslı</td></tr><tr><td>Veri Toplama Sisteminin Sabitlenmesi, MP160</td><td>İşitsel beyin sapı yanıtı için</td><td>BIOPAC</td><td></td></tr><tr><td>Modüler Uzatma Kablosu, MEC110C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>İşitsel beyin sapı yanıtı için</td></tr><tr><td>Myo7A birincil antikoru</td><td>Proteus</td><td>25-6790</td><td>İmmünofloresan boyama</td></tr><tr><td>Myo7A ikincil antikoru</td><td>Jackson immünoresearch</td><td>711-545-152</td><td>İmmünofloresan boyama</td></tr><tr><td>İğne Elektrodu, Unipolar 12 mmTp, EL452</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>İşitsel beyin sapı yanıtı</td></tr><tr><td>için phalloidin antikoru</td><td>Alexa Fluor</td><td>A12381</td><td>İmmünofloresan boyama</td></tr><tr><td>fosfat tamponlu salin</td><td>SIGMA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan tuzağı kafesi</td><td></td><td></td><td>14 cm x 17 cm x 24 cm</td></tr><tr><td>ROMPUN- ksilazin enjeksiyonu, solüsyonu&nbsp;</td><td>Bayer HealthCare, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ses yükseltici, MT-1000</td><td>unika</td><td></td><td>Gürültüye maruz kalma için</td></tr><tr><td>Ses üreteci/analizörü/çeşitli, FW-02</td><td>CLIO</td><td>620300719</td><td>Gürültüye maruz kalma için</td></tr><tr><td>Ses geçirmez oda</td><td>IEA Elektro-Akustik Teknolojisi</td><td></td><td>Gürültüye maruz kalma ve ABR</td></tr><tr><td>Hoparlör&nbsp;</td><td>IEA Elektro-Akustik Teknolojisi</td><td></td><td>Gürültüye maruz kalma için</td></tr><tr><td>Stimülatör Modülü, STM100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>İşitsel beyin sapı yanıtı için</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td>İmmünofloresan</td></tr><tr><td>boyama Tüplü Telefon Seti, OUT101</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>İşitsel beyin sapı yanıtı için</td></tr><tr><td>Dik Mikroskop, BX53</td><td>Olympus</td><td></td><td>Görüntü elde etme</td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

farelerde gürültüye bağlı İşitme kaybı için değiştirilmiş deneysel koşullar ve İşitme fonksiyonu ve dış tüylü hücre hasarının değerlendirilmesi

Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage

Gürültüye bağlı işitme kaybının (NIHL) bir hayvan modeli, patologlar, terapistler, farmakologlar ve işitme araştırmacıları için NIHL mekanizmasını tam olarak anlamak ve ardından ilgili tedavi stratejilerini optimize etmek için yararlıdır. Bu çalışma, NIHL'nin bir fare modelini geliştirmek için geliştirilmiş bir protokol oluşturmayı amaçlamaktadır. Bu çalışmada erkek C57BL/6J fareler kullanıldı. Anestezi uygulanmamış fareler, art arda 5 gün boyunca günde 6 saat boyunca sürekli olarak yüksek seslere (1 ve 6 kHz, aynı anda 115-125 dB SPL-A'da sunulur) maruz bırakıldı. İşitsel fonksiyon, gürültüye maruz kaldıktan 1 gün ve 1 hafta sonra, işitsel beyin sapı yanıtı (ABR) kullanılarak değerlendirildi. ABR ölçümünden sonra fareler sakrifiye edildi ve immünofloresan boyama için Corti organları toplandı. İşitsel beyin sapı yanıtı (ABR) ölçümlerinden gürültüye maruz kaldıktan 1 gün sonra önemli işitme kaybı gözlendi. 1 hafta sonra, deney farelerinin işitme eşikleri ~ 80 dB SPL'ye düştü, bu da kontrol farelerinden (~ 40 dB SPL) önemli ölçüde daha yüksek bir seviyeydi. İmmünofloresan görüntüleme sonuçlarından, dış saç hücrelerinin (OHC'ler) hasar gördüğü gösterilmiştir. Özetle, erkek C57BL / 6J fareleri kullanarak bir NIHL modeli oluşturduk. Saf tonlu gürültü üretmek ve iletmek için yeni ve basit bir cihaz geliştirildi ve ardından kullanıldı. İşitme eşiklerinin kantitatif ölçümleri ve OHC hasarının morfolojik olarak doğrulanması, uygulanan gürültünün beklenen işitme kaybını başarılı bir şekilde indüklediğini göstermiştir.

ABR işitme eşiğinde bir değişiklik Farelerin işitme eşiği, gürültüye maruz kaldıktan 1 gün veya 1 hafta sonra ton patlaması ABR kullanılarak ölçüldü. Test edilen her üç frekansta da işitme eşiğinde önemli bir artış gözlenmiştir (12 kHz: 84.29 ± 2.77 dB SPL; 24 kHz: 91.43 ± 0.92 dB SPL; 32 kHz: 98.57 ± 1.43 dB SPL) gürültüye maruz kaldıktan 1 gün sonra (yani 6. gün). Kısmi işitme iyileşmesi, gürültüye maruz kaldıktan 1 hafta sonra (yani 13. gün) meydana geldi, ancak işitme eşikleri hala tüm...

Burada, gürültüye bağlı işitme kaybının (NIHL) bir fare modeli için bir protokol sunuyoruz. NIHL'yi teşvik etmek için oluklu plastik, bir fare kapanı kafesi ve bir hoparlör kullanarak yeni ve basit bir cihaz geliştirdik. İşitme fonksiyonunu değerlendirmek için sırasıyla işitsel beyin sapı yanıtı ve immünofloresan görüntüleme ve dış tüylü hücre hasarı kullanıldı.

Farelerde Gürültüye Bağlı İşitme Kaybı için Değiştirilmiş Deneysel Koşullar ve İşitme Fonksiyonu ve Dış Tüylü Hücre Hasarının Değerlendirilmesi

An animal model of noise-induced hearing loss (NIHL) is useful for pathologists, therapists, pharmacologists, and hearing researchers to thoroughly ...

Gürültüye bağlı işitme kaybı ile ilgili çalışmalar yapılmış olmasına rağmen, hiçbiri yöntemi bu kadar ayrıntılı olarak kaydetmemiştir ve bu da bunu önemli bir prosedür haline getirmektedir. Bu yöntem, farelerde gürültüye bağlı işitme kaybına etkili bir şekilde neden oldu ve ABR ile işitme eşiğindeki gerçek değişiklikleri gözlemledi. Gürültüye bağlı işitme kaybının bir hayvan modeli, bilim adamlarının gürültüye bağlı işitme kaybının mekanizmasını tam olarak anlamaları ve ardından ilgili tedavi stratejilerini optimize etmeleri için yararlıdır.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan çok yetenekli bir öğrenci olan Dian-Shiue Lee olacak. Kafesi deney farelerine hazırlamak için bir fare kapanı kafesi kullanın ve dört parça oluklu plastik levhayı uygun boyutlarda keserek kafese sığdırın. Farelerin ayaklarının ağ ızgarası tarafından kesilmesini önlemek için, parçalardan ikisini sırasıyla alta ve arka tarafa yerleştirin.Kafes içindeki boşluğu dörde bölmek için diğer iki parçayı birbirine dik olarak yerleştirin CLIO uygulama yazılımını açın. İmleci hoparlör simgesine getirin ve TwoSin'e tıklayın. Frekans 1 değerini 1.000 hertz, Frekans 2 ila 6.000 hertz değerini girin ve değiştirin ve sesi çalmaya başlamak için Tamam'a tıklayın.Leq sekmesi altında, dBV'yi dBSPL olarak değiştirin. Yazılım arayüzünde saati ayarladıktan sonra, sesi çalmak için yeşil üçgen düğmesine tıklayın. Gürültü seviyesini kalibre etmek için hoparlörün önüne 8.5 santimetre mesafeye bir mikrofon yerleştirin.Gürültü seviyesini 125 desibel SPL-A'ya ayarlayın ve gürültü seviyesinin yeterince stabilize edildiğinden emin olmak için en az üç dakika boyunca sürekli izleyin. Gürültüyü oluşturmak ve kontrol etmek için bir jeneratör, bir analizör ve bir amplifikatör kullanın. Gürültüye maruz kalmak için her çeyrek için bir tane olmak üzere dört erkek C57 siyah 6J fareyi kafese yerleştirin.Gürültüye maruz kalma sırasında fareleri her çeyreğe rastgele atayın. Gürültüye maruz kalma sırasında gürültü seviyesini izlemek için kafesin üstüne bir mikrofon yerleştirin. Kafesi hoparlörün önüne ses geçirmez bir kutunun içine yerleştirin ve hoparlörün kafesten 8.5 santimetre uzağa yerleştirildiğinden emin olun.Fareleri, art arda beş gün boyunca, günde altı saat boyunca sürekli olarak bir kilohertz ve altı kilohertz frekanslarında gürültüye maruz bırakın. ABR'yi ölçerek farelerin 6. ve 13. günlerdeki işitme eşiklerini ölçün. ABR ölçümleri için küçük hayvanlar için özel olarak tasarlanmış ticari bir ABR test sistemi kullanın ve hayvanı genel anestezi altında tutun.İşitme eşiğini ölçmek için 12 milimetre subdermal iğne elektrotlarını sol kulağın kulak kepçesinin arkasındaki tepe noktasına ve kuyruğun yakınına yerleştirin. Hoparlörü hayvanın sol kulağından bir santimetre uzağa yerleştirdikten sonra, hoparlörü kullanarak akustik uyaranlar sunun. Uyaranlar için Sinüs Dalgası'nı ve pencere ölçeği için 10 k'yi seçin.Akustik uyaranların istenen frekansını elde etmek için frekans düğmesini çevirin. Fonksiyon üreteci üzerindeki AMLP düğmesini çevirerek uyaran yoğunluğunu ayarlayın. AMLP düğmesini kalibrasyondan hesaplanan uygun bir voltaja çevirerek istenen uyaran yoğunluğunu elde edin.ABR ölçümlerini, 10 desibel adım boyutuyla 10 ila 100 desibel SPL arasında bir dizi uyaran yoğunluğu altında toplayın. ABR eşiği olarak fark edilebilir bir Dalga V'ye yol açabilecek minimum uyaran yoğunluğu seviyesini işaretleyin. ABR ölçümlerinden sonra fareleri kurban edin ve ötenazi yapılan farelerden kokleaları toplayın.Dokuları topladıktan hemen sonra, fiksasyon için% 10 formaldehite batırın ve dört santigrat derecede en az sekiz saat dinlendirin. Metinde açıklandığı gibi kireç çözme için EDTA kullanın. Kokleaları PBS ile dolu bir Petri kabına yerleştirin.Doku boyama için, Corti'nin veya OC'nin spiral şeklindeki organını üç bölüme ayırın: bazal dönüş, orta dönüş ve apikal dönüş. 8x ila 35x büyütme oranlarında diseksiyon mikroskobu altında, dekalsifiye kokleaların skala vestibuli, skala timpani ve modiolus içeren kemik yapılarını çıkarın ve OC dahil yumuşak dokuları elde edin. Gürültüye maruz kaldıktan bir gün sonra 12 kilohertz, 24 kilohertz ve 32 kilohertz'de işitme eşiğinde önemli bir artış gözlendi. Kısmi işitme iyileşmesi, gürültüye maruz kaldıktan bir hafta sonra meydana geldi, ancak işitme eşikleri, kontrol gruplarına kıyasla tüm frekanslarda hala 30 desibelden fazla yükseldi.Bu çalışmada yüksek frekanslarda işitme daha fazla zarar görmüştür. Hem 6. hem de 13. günlerde kontrol ve deney grupları arasında işitme eşiğinde 12 kilohertz ve 32 kilohertz'de anlamlı bir fark gözlendi. NIHL farelerinden elde edilen mikroskobik görüntülerde, kontrol farelerinden elde edilenlere kıyasla sürekli olarak dış saç hücrelerinin kaybı gözlendi.Görüntülerin tamamında iç saç hücreleri sağlam kalırken, OC'nin bazal ve orta dönüşlerindeki dış saç hücreleri ciddi şekilde hasar gördü. Buna karşılık, apikal dönüşteki dış saç hücreleri neredeyse sağlamdı. Bu protokoldeki en önemli adım gürültüye maruz kalma, ABI ölçümü, kokleanın toplanmasıdır.Bu prosedür, çeşitli ses türleri kullanılarak farklı frekanslarda gürültüye maruz kalmanın işitme kaybı üzerindeki etkisini araştırmak için uygulanabilir.

modified-experimental-conditions-for-noise-induced-hearing-loss-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bozukluklar veya phantom algıları (subjektif tinnitus) işitme, işitme eşik gibi parametreleri işitme davranışsal belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir yöntem tarif edilmiştir. Bu akustik irkilme tepkisi öncesi nabız inhibisyonu kullanır ve kolay programlanabilir bir AD / DA çevirici ve bir piezo sensör kullanarak bir kişisel bilgisayara uygulanabilir.

Kemirgenler Davranış Odyometri için Düşük Maliyetli Kurulum

Bu videoda, fare kokleasının belirli bölgelerindeki şerit sinapslarını değerlendirmek için bir yöntem gösterilmektedir. Her koklear dönüşte farklı frekans bölgelerindeki fonksiyonel sinapsları tanımlamak için immün boyama ve konfokal görüntüleme tekniklerini kullanır.

Fare Kokleasının Belirli Frekans Bölgelerinde Şerit Sinapslarının Değerlendirilmesi

Kaynak: Lee, D. et. al., Farelerde Gürültüye Bağlı İşitme Kaybı için Değiştirilmiş Deneysel Koşullar ve İşitme Fonksiyonu ve Dış Tüylü Hücre Hasarının Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, farelerde gürültüye bağlı işitme kaybı prosedürünü göstermektedir. Yüksek sesli ses, iç kulaktaki tüy hücrelerine zarar verir ve işitme yollarını bozarak işitme bozukluğuna neden olur.

Uzun Süreli Yüksek Hacimli Sese Maruz Kalma Yoluyla Farelerde İşitme Kaybına Neden Olma 

Kaynak: Lee, D., et. al. Farelerde Gürültüye Bağlı İşitme Kaybı için Değiştirilmiş Deneysel Koşullar ve İşitme Fonksiyonunun ve Dış Tüylü Hücre Hasarının Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, bir farede işitsel beyin sapı tepkisinin (ABR) ölçümünü göstermektedir. Elektrotlar başın üzerine, kulağın arkasına ve anestezi uygulanmış bir farenin kuyruğunun yanına yerleştirilir. Çeşitli yoğunluklarda akustik uyaranlar verilir ve üretilen elektrik sinyalleri dalga formları olarak kaydedilir.

Farelerde İşitsel Beyin Sapı Tepkisinin Ölçülmesi

Açıklanan kulak sonrası cerrahi yaklaşım, kan kaybını ve hayvan ölümlerini en aza indirirken fare koklear skala timpanisine hızlı ve doğrudan iletim sağlar. Bu yöntem, yuvarlak pencere zarından doğum sonrası farelere moleküler, farmakolojik ve viral iletim kullanılarak koklear tedavi için kullanılabilir.

Yuvarlak Pencere Membran aracılığıyla Fare İç Kulak için virally ve Gen Teslimat Cerrahi Yöntemi

Hayvan modellerinin koklealarına ototoksik ajanlar eklemek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Sunulan, ototoksik ajanların yuvarlak pencere nişine verilmesi için cerrahi bir protokoldür. Prosedür güvenilirdir, hedefe yönelik intra-koklear lezyonlar oluşturur ve mikromimaride mekanik hasarı önler. Koklear kendi kendine onarım/rejenerasyon muayenesi mümkündür.

Koklear Hücre Dejenerasyonu Inducing için hızlı ve Güvenilir Teknik: Ototoksik Ajan Teslimat için Fare Yuvarlak pencere Yaklaşımı

İç kulağa lokal ilaç verilmesi için iki mikrocerrahi yaklaşım burada tanımlanmış ve işitme parametreleri, koklear sitomimari ve inflamatuar belirteçlerin ekspresyonu üzerindeki etkisi açısından karşılaştırılmıştır.

Fare İç Kulak Hedefli İlaç Dağıtım Yöntemleri Karşılaştırmalı İncelemesi: Bullostomy Karşı Transtimpanik Enjeksiyon

Koklear implant hayvan modelleri elektrik stimülasyonu ile kalıcı sensorinöral işitme kaybı tedavisinde teknolojik üsler bilgisine ilerletebilirsiniz. Bu çalışmada akut sağır edici ve fareler hem de işlevsel değerlendirme İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ile bir elektrot dizinin koklear implantasyon için cerrahi bir Protokolü sunar.

Koklear Implant ameliyatı ve elektriksel olarak uyarılmış işitsel beyin sapı yanıt kayıtları C57BL/6 farelerde

Bu yazıda normal farelerde morfolojik özellikleri ve kurdele sinüslerinin fonksiyonel durumunu değerlendirmek için deneysel bir protokol açıklanmaktadır. Bu model aynı zamanda gürültüye bağlı ve yaşa bağlı Cochlear synaptopathy-kısıtlanmış modeller için de uygundur. Önceki fare çalışmalarından gelen göreli sonuçlar da tartışılmaktadır.

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Beyin sapı uyarılmış reaksiyon odyometrisi klinik nörofizyolojide önemli bir araçtır. Günümüzde hem farmakolojik hem de genetik hayvan modellerini içeren temel bilim ve preklinik çalışmalarda beyin sapı uyarılmış yanıt Odyometri de uygulanır. Burada işitme beyin tepkileri yanıtlarının farelerde nasıl başarıyla kaydedilip analiz edileceğini ayrıntılı bir şekilde tarif ediyoruz.

Farelerde beyin sapı uyarılmış yanıt odyometrisi veri edinme ve Analizi

Bu makalede, yetişkin fare kokleae immünohistokimya için 10 mm yuvarlak kapak fişleri koklear epitel parçaları yapıştırmak için bir hücre ve doku yapıştırıcı kullanımı ve kireçlenme gerektiren değiştirilmiş bir koklear yüzey hazırlama yöntemi sunar.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Öğrenin farelerde gürültüye bağlı işitme kaybı protokolünü ve ABR ile işitme eşik değişikliklerini değerlendirmeyi. Bu yöntem dış tüylü hücre hasarını incelemek için kullanılır.

Farelerde Gürültüye Bağlı İşitme Kaybı için Değiştirilmiş Deneysel Koşullar ve İşitme Fonksiyonu ve Dış Tüylü Hücre Hasarının Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Farelerde Gürültüye Bağlı İşitme Kaybı için Değiştirilmiş Deneysel Koşullar ve İşitme Fonksiyonu ve Dış Tüylü Hücre Hasarının Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet