Peptit-Poloksamin Nanopartikülleri Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde In vitro Transkribe mRNA'nın Verimli Transfeksiyonu

Peptit-poloksamin nanopartikülleri potansiyel pulmoner mRNA dağıtım sistemlerinden biridir. Protokolümüz, peptid-poloksamin nanopartiküllerini daha yüksek verimlilik ve verimlilikle yapar ve bu da mukozal mRNA aşısının geliştirilmesini kolaylaştırır. Tekniğin gerektirdiği malzemeler düşük maliyetlidir ve protokol kısa sürede tamamlanabilir.

Peptit-poloksamin nanopartikülleri, verimli mRNA transfeksiyonuna aracılık etme yeteneğine sahiptir. Peptit-poloksamin nanopartikülleri, insan bronşiyal epitel hücrelerinde başarılı mRNA transfeksiyonu sergiledi ve bu da mukozal COVID-19 aşıları, akciğer kanserlerinin tedavisi ve kistik fibroz gen tedavisi için ek uygulamaları içeriyor. Bireyin deneyleri yapmaya başlamadan önce ilgili bir alanda, protokolde ve birçok teknikte bazı temel bilgilere sahip olmasını bekliyorum.

Metridia lusiferazın açık okuma çerçevesini sentezledikten ve pUC57 vektörüne klonladıktan sonra, bir saat boyunca 37 santigrat derecede BamHI ve KpnI kullanarak doğrusallaştırılmış bir DNA şablonu hazırlayın. Makalede açıklandığı gibi bir T7 transkripsiyon kiti ve psödoüridin kullanarak mRNA sentezi için 20 mikrolitre hacimli bir reaksiyon hazırlayın. Bileşenleri iyice karıştırın ve üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, 50 mikrogram açılmamış IVT mRNA'nın ikincil yapısını, 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede ısıtarak çıkarın. IVT mRNA kapağı için Cap 1 kapak sistemini kullanın ve 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede S-adenosilmetiyonin ve 2'O-metiltransferazlar kullanarak 7-metilguanosin kapak yapısını değiştirerek Cap 1'i hazırlayın. Kapaklı IVT mRNA'nın konsantrasyonunu UV görünür bir spektrofotometre ile ölçün.

Bir RNA belirteci kullanarak,% 18 formaldehit içeren% 1 formaldehit denatüre edici agaroz jelinde kapaklı IVT mRNA'nın moleküler boyutunu analiz edin. T704'ü nükleaz içermeyen suda çözündürerek mililitre başına 10 miligram poloksamin 704 stok çözeltisi hazırlayın. Peptitin nükleaz içermeyen suda çözündürülmesini sağlayarak peptidin mililitre stok çözeltisi başına 2 miligram hazırlayın.

Hazırlanan çözeltiyi 4 santigrat derecede saklayın. IVT mRNA'yı buz üzerinde çözün. Tüpü açmadan önce, tüpü oda sıcaklığında üç saniye boyunca 300 kez G'de santrifüj edin ve IVT mRNA çözeltisini nükleaz içermeyen suyla seyreltin.

T704 çözeltisini mikrolitre konsantrasyon başına sekiz mikrograma ve sentetik peptit çözeltisini nükleaz içermeyen su ile sırasıyla mikrolitre konsantrasyon başına 0.555 mikrograma seyrelterek T704 ve sentetik peptit karışım çözeltisi hazırlayın. Daha fazla kullanmadan önce karışık çözeltiyi oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. IVT mRNA çözeltisini bir mililitrelik bir şırıngaya çekerek şırınga ucundaki hava boşluklarından veya kabarcıklardan kaçının.

Şırıngayı kartuşun bir tarafına döner bloğun yanına yerleştirin. Ardından, bir mililitrelik bir şırıngayı T704 ve sentetik peptit karışım çözeltisi ile doldurun ve şırınga ucundaki kabarcıkları veya hava boşluklarını giderin. Şırıngayı pompanın diğer girişine yerleştirin ve pompayı dakikada toplam 4 ila 10 mililitre akış hızına ayarlayın.

Karıştırma cihazının akış yolunun sonuna karışık IVT mRNA / PP-sNp çözeltisini toplamak için on mililitrelik RNaz içermeyen bir konik tüp yerleştirin. Karıştırmayı başlatmak için pompayı çalıştırın ve parametrelerin doğru girildiğinden emin olun. Pompayı altı saniye çalıştırdıktan sonra, IVT mRNA / PP-sNp örneğini konik tüpten toplayın.

Transfeksiyondan 24 saat önce 96 delikli plakalarda insan bronşiyal epitel hücreleri ve dendritik hücre hattı. Hücreleri% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş bir kültür ortamında büyütün. Büyüme ortamını çıkardıktan sonra, kaplanmış hücreleri kuyu başına 0.2 mililitre PBS ile yıkayın.

Kaplanmış hücre kültürlerini içeren her bir kuyucuğa 170 mikrolitre serumsuz kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, her bir kuyucuğa akıllıca damlayan 0.4 mikrogram Metridia lusiferaz mRNA içeren 30 mikrolitre IVT mRNA / PP-sNp formülasyonu ekleyin. IVT mRNA / PP-sNp formülasyonu ile hücreleri, nemlendirilmiş% 5 karbondioksit ile zenginleştirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin.

Transfeksiyon ortamını aspire edin ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş 0.2 mililitre taze kültür ortamı ekleyin. Transfekte hücreleri daha önce gösterildiği gibi 24 saat boyunca inkübe edin ve her bir kuyucuktan tespit edilecek süpernatantları toplayın. Koelenterazine substratına PBS ekleyerek yeni bir tahlil çözeltisi hazırlayın.

Çözeltiyi 10 saniye boyunca vorteks yaparak iyice karıştırın. Toplanan süpernatantın 50 mikrolitresini 96 kuyucuklu bir plakaya ekleyin. Mikroplaka okuyucuyu 1.000 milisaniyelik bir okuma süresiyle ayarlayın ve her bir kuyucuğa manuel olarak veya otomatik enjeksiyonla 30 mikrolitre koelenterazine çözeltisi ekleyin.

Coelenterazine çözeltisini süpernatana ekledikten hemen sonra, lüminesans sinyalini ölçmek için Başlat'a tıklayın. Rekombinant plazmid, lineerleştirilmiş DNA şablonunu üretmek için izole edildi ve sindirildi. In vitro transkripsiyon, kapaklı ve kapaklı MetLuc mRNA üretti.

Metridia lusiferaz mRNA / PP-sNp ile transfekte edilen hücreler, ticari olarak temin edilebilen lipit bazlı transfeksiyon reaktifi, çıplak Metridia lusiferaz mRNA, PBS veya T7044 sentetik peptitler, insan bronşiyal epitel hücrelerinde karışık çözelti, 16 HBE ve dendritik hücre hattı DC2.4 Metridia lusiferaz mRNA / PP-sNp ile transfekte edilenlere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek lusiferaz ekspresyonu göstermiştir.PP-sNp dağıtım sisteminin LP'den daha yüksek lusiferaz ekspresyonu gösterdiğini düşündürmektedir. MetLuc mRNA'sını bozunmaya karşı korumak ve eksojen Metridia lusiferaz mRNA'nın transfeksiyon verimliliğini arttırmak için. Lütfen kapaksız Met-mRNA'nın sentetik yapısının başarıyla çıkarıldığından emin olun. Poloksamin nanopartiküllerini hazırlamak ve sıkıştırmak için Met-mRNA T704 ve peptid bileşiğini dikkatlice hesaplayın ve indirin.

Peptit-poloksamin nanopartiküllerinin morfolojisini gözlemlemek için transmisyon elektron mikroskobu yapılabilir. Bu teknik, araştırmacıların mukozal mRNA aşıları geliştirmelerine ve ilgili her hücre için gen terapisi formülasyonlarının yüksek verimli bir şekilde taranmasını sağlamalarına yardımcı olur.