Biyolojik Bariyerlerin Daha İyi Penetrasyonu için Siklik Hücre Nüfuz Eden Peptitlerin Yapımı

Kanser tedavisi için ciddi bir engel, fizyolojik engeller nedeniyle terapötiklerin daha derin tümör hücrelerine sınırlı erişimidir. Bu nedenle, biyolojik engelleri tedavi edebilen yeni moleküler taşıyıcıların geliştirilmesi, ilaç dağıtım verimliliğini artırmak için şiddetle arzu edilmektedir. Bu prosedürün amacı, hücreden hücreye penetrasyonu artırmak için siklik hücre penetran peptitleri sentezlemektir.

Bu yöntemin avantajı, peptid siklizasyonunun, herhangi bir metal katalizör gerektirmeden sistein ve reçine ile ikame reaksiyonları yoluyla kolayca elde edilebilmesidir. Aromatik çapraz bağların dahil edilmesi, peptitlerin hidrofilik laktam veya triazol çapraz bağlarına kıyasla genel hidrofobikliğini arttırır, böylece geçirgenliklerini arttırır. Başlamak için, manuel peptit sentez aparatını duman davlumbazına monte edin.

Üç yönlü durdurucuları vakum manifolduna yerleştirin ve azota bağlayın. Kullanılmayan girişleri kapattığınızdan emin olun. Üç yönlü tapalara 10 mililitrelik bir polipropilen kolon takın ve reaksiyon karışımını veya çözücüleri bir lastik pipet ampulü veya bir atık tutucu vakum kullanarak polipropilen kolondan boşaltın.

Reçineyi peptit sentezine hazırlamak için, gerekli reçine miktarına 4 ila 5 mililitre DMF ekleyin ve reçineyi yeterince şişirmek için 30 dakika boyunca hafif azot köpüren polipropilen kolona aktarın. DMF'yi boşaltın ve reçineye 4 ila 5 mililitre% 50 morfolin / DMF ekleyin. N-terminal Fmoc grubunu çıkarmak için azotu 30 dakika boyunca hafifçe kabarcıklandırın ve ardından karışımı boşaltın.

Kolona 4 ila 5 mililitre DMF ekleyerek ve her seferinde en az 1 dakika azotla köpürterek reçineyi üç kez iyice yıkayın. Aynı şekilde, reçineyi üç kez diklorometan ve üç kez DMF ile yıkayın. Daha sonra, 648.8 miligram Fmoc ve PBF korumalı arginin ve 372.6 miligram HATU'yu bir santrifüj tüpünde 5 mililitre DMF içinde çözün.

Bağlantı reaksiyonunu aktive etmek için 348.4 mikrolitre DIPEA ekleyin ve reaksiyon karışımını reçine ile polipropilen kolona aktarın. Karışımı 1 ila 2 saat boyunca azot köpürmesiyle hafifçe çalkalayın ve ardından kaplin reaksiyonunu bir kez tekrarlayın. Reaksiyon karışımını boşaltın ve reçineyi sırayla DMF, diklorometan ve tekrar DMF ile her seferinde en az 1 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Fmoc koruyucu grubu çıkarın ve bir sonraki amino asidi çiftleştirmeye devam etmeden önce daha önce gösterilen prosedürü izleyerek reçineyi yıkayın. Daha sonra, amino asit kuplajında gösterilen aynı işlemi kullanarak beta-alanini FITC etiketlemesi için bir ara parça olarak birleştirin ve daha sonra reçine üzerindeki peptitlerin FITC etiketlemesini gerçekleştirmek için karanlıktaki polipropilen kolona FITC, DIPEA ve DMF karışımı ekleyin. Reaksiyon neredeyse 8 saat sürecekti.

Lineer peptidin siklizasyonunu gerçekleştirmek için, tritil koruyucu sistein grubunu seçici olarak çıkarmak için polipropilen kolona 2 dakika boyunca trifloroasetik asit, triizopropilsilan ve diklorometan karışımı ekleyin. Karışımı boşaltın ve tritil koruyucu grubu tamamen çıkarmak için sarımsı çözelti renksiz hale gelene kadar prosedürü tekrarlayın. Reçinenin DMF ve diklorometan ile en az üç kez sıralı yıkamalarını yapın ve 4, 4'bis-bromometil-bifenil'i DPEA ile DMF'de çözün.

Çözeltiyi sütuna ekleyin ve 4 saat boyunca reaksiyona sürün. Reçineyi her biri beş dakika boyunca iki kez 4 ila 5 mililitre metanol ile yıkayın ve sürekli bir azot akışıyla kurutun. Sistein içeren peptitler için, reçineyi trifloroasetik asit, triizopropilsilan ve su veya trifloroasetik asit, triizopropilsilan 1, 2-etanditiol ve sudan oluşan etkili bir bölünme kokteyli ile tedavi edin.

Peptide bağlı reçineyi peptidi bölmek için 2 ila 3 saat boyunca tedavi edin ve ardından trifloroasetik asidi bir azot akışıyla dikkatlice çıkarın. Ham peptitleri elde etmek için, ham peptitleri çökeltmek için parçalanmış peptit preparatına 4 ila 5 mililitre dietil eter ekleyin ve 4 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice atın ve peptidi etkili bir duman davlumbazında 3 dakika boyunca havayla kurutun.

Küçük ölçekli ham peptidi 800 mikrolitre asetonitril içinde çözün ve daha sonra ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi kullanarak analiz edin. Bir doku kültürü plakası eki ile 12 delikli bir odada 2 mililitre DMEM içinde 100.000 HeLa hücresini aşılayın ve% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir inkübatörde 24 saat boyunca inkübe edin. Ortamı çıkarın ve 1 saat boyunca FBS'siz DMEM'de 1 mililitre 10 mikromolar FITC-R8 veya FITC-sR8-4 ile odalardaki hücreleri inkübe edin.

Bundan sonra, peptitleri içeren ortamı çıkarın ve hücreleri 1 mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Odalara 1 mililitre taze FBS içermeyen DMEM ekleyin ve daha sonra odadaki HeLa hücrelerini doku kültürü plakası eki ile birlikte inkübe edin, HeLa hücreleri 2 saat boyunca alttaki yuvarlak kapak kaymaları üzerinde tutun. HeLa hücrelerini yuvarlak kapaklara 15 dakika boyunca% 2.5 glutaraldehit ile sabitleyin ve ardından hücreleri 15 dakika boyunca DAPI ile lekeleyin.

Son olarak, bir floresan mikroskobu altında kapaklardaki HeLa hücrelerini gözlemleyin. FITC etiketli lineer R8 peptid ve FITC etiketli zımbalanmış R8 peptid sentezinin şematik bir diyagramı burada sunulmaktadır. Lineer R8 peptidinin HPLC ve MS spektrumları ve zımbalanmış R8 peptidi bu şekilde gösterilmiştir.

Zımbalanmış peptidin tutma süresi, doğrusal analogunkinden önemli ölçüde daha uzundu, bu da hidrofobik çapraz bağ ile siklizasyondan sonra peptidin genel hidrofobikliğinin arttığını gösteriyordu. Bu grafik görüntü,% 25 FBS varlığında doğrusal peptidin ve zımbalanmış peptidin stabilitesini temsil eder. Siklik R8, FBS ile 4 saat boyunca inkübasyondan sonra% 77.3 oranında bozulmadan kalırken, doğrusal muadili çoğunlukla bozulmuştur, bu da siklik R8 peptidinin proteolitik stabilitesinin arttığını düşündürmektedir.

Burada 3 mikromolar FITC etiketli lineer R8 peptid ve FITC etiketli zımbalanmış R8 peptid ile 1 saatlik inkübasyondan sonra HeLa hücrelerinin ve 4T1 hücrelerinin canlı hücre floresan mikroskopi görüntüleri gösterilmektedir. Aromatik çapraz bağlı siklik R8 ile tedavi edilen hücrelerin, lineer muadilleriyle tedavi edilenlerden daha yüksek hücre içi floresan sergilediği görülebilir. Akım sitometri analizi ile de benzer sonuçlar elde edilmiştir.

Siklik R8'in gelişmiş hücreden hücreye penetrasyon sağlayıp sağlamadığını daha fazla araştırmak için, peptitlerin bariyer geçirgenliğini bir hücre katmanından diğerine simüle etmek için transwell modelleri kullanıldı. Döngüsel R8, hücre içi floresandaki önemli bir artışla gösterildiği gibi, doğrusal R8 peptidinden daha yüksek bariyer penetrasyonu açıkça sergiledi. Sistein ve reçinenin trityl grubunun tamamen deproteksiyonu, bir sonraki siklizasyon adımı için önemlidir.

Ayrıca, döngüselleştirme verimliliği, sterik etkilerden dolayı peptitlerin spesifik dizilerine ve uzunluklarına da bağlıdır. Böyle bir durumda, daha düşük yükleme kapasitesine sahip bir reçine kullanılması veya peptitlerin çözelti fazında seyreltik konsantrasyonlar altında çevrimleştirilmesi yararlı olacaktır. Bu siklik peptitler, doğrusal muadillerine kıyasla gelişmiş bir hücreden hücreye geçirgenlik göstermiştir.

Biyolojik engelleri aşmak için büyük umut vaat ettiklerine ve ilaç dağıtımı alanında daha ileri uygulamalar için bir moleküler için kullanılacağına inanıyoruz.