Name: Drosophila Mikrobiyomuna Uygulanan 96 Delikli Plaka Formatında Hızlı Koloni Oluşturma Birimi Sayımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Öğrenin, Drosophila bağırsak mikrobiyomunda koloni oluşturma birimi sayımı için otomatik görüntü analizi kullanarak hızlı ve verimli bir yöntem. Bu protokol, geleneksel yöntemlere göre yüz kat zaman avantajı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Kerwyn Casey Huang, Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper ve Ludington laboratuvarı üyeleri bu protokolün geliştirilmesi konusunda değerli girdiler sağladı. Finansman NSF IOS hibe 2032985, NIH hibe DP5OD017851, Kanada Carnegie Enstitüsü hibesi ve Carnegie Bilim Vakfı tarafından sağlandı.

1. Sinek kolonizasyonu
NOT: Bu yöntem, CFU'ların büyüme kaplaması ile kültürlenebilir bir bağırsak mikrobiyomu ile sineklerin kantitatif analizi için uygundur. Gnotobiyotik sineklerin yetiştirilmesi için ayrıntılı bir protokol daha önce yayınlanmıştır12.
<ol><li>Kommensal bir bakteri türü tarafından stabil kolonizasyon oluşturun.<ol><li>Taze bir bakteri kültürü, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yoluyla pelet hazırlayın ve PBS'deki hücre peletini 1.0'lık bir OD600'e geri koyun. Bu protokol için, Lactiplantibacillus plantarum (daha önce Lactobacillus plantarum olarak biliniyordu) bir gecede 2.0'lık bir OD600'e yetiştirildi.</li>
		<li>Bir sinek şişesinde yiyeceğin üzerine 100 μL pipet koyun (bkz. Eşit olarak yayın ve sıvının 15-30 dakika boyunca emmesine izin verin.</li>
		<li>Standart şişeden şişeye çevirme tekniğini kullanarak 20 mikropsuz sineği bu şişeye aktarın34. Her sinek, bakteri dozu35'in kabaca eşit miktarda yiyecektir. Alternatif olarak, mikropsuz yumurtalar eklenebilir.</li>
		<li>Sinekleri 3 gün boyunca günlük taze steril yiyeceklere aktarın. Tüm bunları bir biyogüvenlik kabininde yapın ve steril teknik kullanın (Şekil 1A-1).</li>
	</ol></li>
	<li>CFU yükünü ölçmeden önce, geçici bakterileri bağırsaktan temizlemek için sinekleri 4 saat boyunca steril agar suyu içeren bir şişeye aktarın. Agar-su şişeleri sinek için bir nem kaynağı sağlar, ancak yüzeydeki sinek veya bakteriler için besin sağlamaz. Standart gıdalarla aynı steril sinek şişelerinde hazırlanırlar, ancak sadece deiyonize su ve% 1.5 agar içerirler.</li>
</ol>2. Sineklerin 96 delikli bir PCR plakasında ayrı ayrı homojenleştirilmesi
<ol><li>Boncuk çırpıcı tabakları önceden hazırlayın.<ol><li>Boncuk ölçüm tepsisine 0,5 μm cam boncuk dökün ( Malzeme Tablosuna bakın) ( Ek Kodlama Dosyası 1 S1-boncuk-measurer.stl yardımıyla 3D yazdırılmıştır). Boncukları tepsiye tüm kuyucuklar dolu ve düz olacak şekilde yayın ve ardından fazla boncukları kurtarmak için konik bir tüpe fırçalayın.</li>
		<li>Yarı etekli bir PCR plakasını (bkz. Malzeme Tablosu) ölçüm tepsisine baş aşağı yerleştirin ve ölçüm tepsisindeki girintiye yerleştirerek kuyucuklarla hizalayın. Ardından, boncukları aktarmak için hızlıca ters çevirin.</li>
		<li>Fazla boncukları PCR plakası yüzeyinden çıkarın ve folyo ile örtün. Tüm kuyucukların boncuk içerdiğinden emin olmak için PCR plakasını kontrol edin. Tek bir kuyucuğa boncuk eklemek için gerekirse bir tartım kepçesi kullanın. Statik elektrik boncukların plaka yüzeylerine yapışmasına neden oluyorsa, ölçüm tepsisinin ve PCR plakasının arkasını %70 etanol ile silin veya püskürtün.</li>
		<li>Alüminyum folyo ile örtün. Birçok plaka bu şekilde hazırlanabilir ve daha sonra otoklavlanabilir ve daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Kullanıma hazır olduğunda, 96 kanallı pipettörü kullanarak her bir kuyucuğa 100 μL PBS ekleyin (bkz.</li>
	</ol></li>
	<li>Homojenizasyondan önce mikrop kolonize sinekleri (bkz. adım 1) %70 etanol ile yüzey sterilize edin.<ol><li>Sinekleri 5 s için% 100 CO2 ile uyuşturun. Anestezi altındaki sinekleri şişeden küçük bir huni kullanarak 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın (Şekil 1A-2). Bu çalışmada, tipik olarak tüp başına 25 sinek eklenmiştir.</li>
		<li>Hemen tüpe ~ 1 mL% 70 etanol püskürtün, tüpü kapatın ve 10 s boyunca ters çevirerek karıştırın. Daha sonra, etanolün bir P1000 pipetle aspire edilmesi, sineklerin aspire edilmemesine dikkat edin. Bir kez daha etanolle, ardından steril PBS ile iki kez tekrarlayın (Şekil 1A-3).</li>
	</ol></li>
	<li>Son PBS yıkamasından sonra, tüpü kapatın ve kapak tarafı aşağıdayken, sineklerin kapağa girmesi için tezgaha birkaç kez sertçe dokunun.</li>
	<li>Tüpü açın ve forseps kullanarak sinekleri kuyucuklara dağıtın (Şekil 1A-4). Her kuyucuğa bir sinek yerleştirin (Şekil 1A-5). Sinekleri anestezi altında tutmak için yükleme sırasında plakayı buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Termal Bond ısı sızdırmazlık folyosu kullanarak plakayı kapatın (bkz.<ol><li>İlk olarak, kuyucuklara yakın olan başıboş boncukları çıkarın, çünkü bunlar folyo contasında sızıntıya neden olabilir. Folyonun donuk tarafının plakaya ve parlak tarafının ısı sızdırmazlık maddesine doğru yukarı doğru yönlendirildiğinden emin olun. Isı sızdırmazlık maddesini (bakınız Malzeme Tablosu) 5 sn boyunca sıkıca bastırın (Şekil 1A-6). Folyoyu sabitlemek için el aplikatörü ile yakın (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Kötü sızdırmazlık, numune kaybının bir nedenidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Plakayı plaka çalkalayıcıya sabitleyin. 5 dakika homojenize edin (Şekil 1A-7). Sızdırmazlık folyosundan sıvıyı çıkarmak için boncuk plakasını bir mini plaka iplikçisinde 30 sn aşağı doğru döndürün (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Sinek homojenatı damlacıklarının kuyucuklardan dışarı sıçramaması için plakayı tutarken folyoyu çıkarın.</li>
</ol>3. Sinek homojenatının seri seyreltilmesi ve CFU plakalarına lekelenmesi
<ol><li>Biyogüvenlik kabinine dört dikdörtgen MRS agar büyüme plakası yerleştirin (bakınız Malzeme Tablosu) ve kapaklarını çıkarın. Bu protokolde L. plantarum'un büyümesi için MRS agar kullanılmıştır. Bu plakaları en az 10 dakika kurumaya bırakın (taze dökülmüşse veya depodan soğuksa 20 dakika). NOT: Plakalar ıslaksa, 96 delikli plakadan gelen damlacıklar birlikte akacak ve sayıları mahvedecektir.</li>
	<li>96 kanallı pipetleyici kullanarak steril 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL PBS ekleyerek üç seyreltme plakası hazırlayın. 96 kanallı pipetleyiciye P20 uçlarından oluşan bir raf yerleştirin.</li>
	<li>Bölüm 2'de hazırlanan numune plakasından 11,1 μL homojenat aspire ederek 1:10 seyreltme yapın (Şekil 1A-8). Kuyuların dibinden ziyade kuyuların ortasından çektiğinizden emin olun, çünkü sinek homojenatı ve cam boncuklar pipetleri tıkar. Boncuklar batar ve sinek parçacıkları yüzer ve orta tabakayı çoğunlukla berrak bırakır.</li>
	<li>11.1 μL'yi, kuyucuk başına 100 μL steril PBS içeren ilk seyreltme plakasına dağıtın. Seyreltme plakasını plaka çalkalayıcıda 600 rpm'de 10 s tutun. Beş döngü boyunca yukarı ve aşağı pipetle çekerek tekrar karıştırın. İlk seyreltme plakasından ikinci seyreltme plakasına 11,1 μL aktarın ve sonraki iki seyreltme plakası için karıştırma adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Aşağıda açıklandığı gibi seyreltme serisi kaplama yapın.<ol><li>Büyüme plakalarını biyogüvenlik kabininden alın.</li>
		<li>En seyreltik plakadan başlayarak, 96 delikli pipettörü kullanarak her bir kuyucuktan 2 μL'yi agar plakalarına yerleştirin (Şekil 1A-9).<ol><li>Pipetleyici kafasını yavaşça plakanın üzerine indirin, agarın içine bıçaklamamaya dikkat edin. Plakayı dikkatlice inceleyin ve tüm lekelerin dağıtıldığından emin olun; değilse, uygun konuma manuel olarak 2 μL ekleyin. Sıvı lekelerin hızla agarın içine batırıldığını ve birlikte çalışmadığını kontrol edin.</li>
			<li>Lekeler birlikte çalışırsa, yeni bir dizi taze agar plakasını daha uzun süre kurutun ve lekelenmeyi tekrar yapın. Birden fazla plaka tipi varsa (örneğin, farklı ortamlar veya antibiyotiklerle), bunları da tespit edin. Kalan herhangi bir çözeltiyi seyreltme plakasına geri dağıtın ve bir sonraki yüksek konsantrasyona geçin. NOT: Seyreltmeleri tespit ederken, pipet uçlarının içeriğinin önceki seyreltmeden arındırıldığından emin olmak için bir sonraki seyreltmeyi beş kez karıştırın. Seyreltme plakaları, koloni sayımları35'i etkilemeden 4 ° C'de >8 saat saklanabilir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Kalan seyreltme plakaları için adım 3.5'te açıklandığı gibi kaplama işlemini tekrarlayın, orijinal homojenatı olan plakaya kadar en seyreltikten en konsantre olana ilerleyin.</li>
	<li>Tüm sıvı agar içine emildiğinde, plakaları ters çevirin ve inkübatöre yerleştirin (Şekil 1A-10). Drosophila'dan Lactiplantibacillus ve Acetobacter için MRS ortamında optimum sıcaklık 30 ° C'dir. Koloniler optimal boyuta ulaşana kadar kuluçkaya yatırın: koloniler onları açıkça görecek kadar büyüktür, ancak birbirlerinin büyümesine karışacak veya müdahale edecek kadar büyük değildir (optimal büyüklüğün nicelleştirilmesi için temsili sonuçlara bakınız). NOT: Optimal büyüme koşulları gerinime bağımlıdır ve ampirik olarak belirlenmelidir. Drosophila'dan Lactiplantibacillus için, MRS agar'da en uygun inkübasyon süresi 26 saat ila 30 saattir. Drosophila'dan Acetobacter için en uygun inkübasyon süresi, suşa bağlı olarak MRS'de 30 saat ila 48 saattir.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, gerekirse plakaları saymaya hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.</li>
</ol>4. CFU'ların nicelleştirilmesi
<ol><li>CFU'ları, plakaları fotoğraflayarak ve daha sonra aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi otomatik yazılım kullanarak kolonileri sayarak sayın. Plakalar 4 ° C'de depolanmışsa, önce oda sıcaklığına ulaşmalarına izin verin, böylece plakalarda parlama üreten yoğuşma olmaz.</li>
	<li>Plakaları mantıksal bir sırayla düzenleyin ve fotoğraf çekerken bu sırada tutun - dosyaları adlandırmayı kolaylaştırır. Tüm plakaları, A1 tüm plakalar için sol üst köşede olacak şekilde yönlendirin. Fotoğrafların karıştırılmamasını sağlamak için A1 köşesini benzersiz bir kimlikle etiketlemeniz önerilir. Her seyreltme serisini sırayla istifleyin.</li>
	<li>Plaka kapağını çıkarın ve plakayı A1 doğru köşeye yönlendirilmiş olarak sahneye yerleştirin. Bu tepsi plakalarının fotoğraflanması için optimize edilmiş ve floresan kolonileri görüntülemek için aydınlatma ve filtre seçenekleri içeren plaka fotoğraf kutusu (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2) için tasarımlar dahil edilmiştir.</li>
	<li>Plakaları görüntüleyin. Plakalar arasında tutarlı bir pozlama seviyesi elde etmek için fotoğraf makinesini manuel ayarlarla kullanın (bkz. Perspektif bozulmasını en aza indirmek için uzun bir odak uzaklığı ayarı önerilir. Kamera sarsıntısından kaynaklanan bulanıklığı en aza indirmek için uzaktan kumandalı bir deklanşör kullanarak fotoğrafı çekin.</li>
	<li>Görüntüleri bir bilgisayara aktarın ve deneme adı, ortam türü, seyreltme faktörü ve diğer ilgili ayrıntılar dahil olmak üzere yeniden adlandırın. Bazı işletim sistemlerinde (bkz. Malzeme Tablosu), Finder'da bir dizi dosyaya sağ tıklayarak kullanışlı bir toplu yeniden adlandırma özelliği vardır.</li>
</ol>5. Count-On-It paketini kullanarak otomatik koloni sayımı (Ek Dosya 3)
<ol><li>ImageJ için sağlanan Croptacular eklentisini (Ek Kodlama Dosyası 2) kullanarak görüntüleri kırpın. Bu eklenti, görüntüyü düzenli bir alt bölgeler dizisine bölmeye yardımcı olur (örneğin, 96 delikli bir plaka için 8 x 12). Alt bölgeler ayrı ayrı sayılacaktır. NOT: Circus adı verilen dairesel plakaları saymak için ayrı bir eklenti, Ek Kodlama Dosyası 3 Circus_.ijm'de açıklanmıştır.<ol><li>Niceleme için işlenecek görüntüleri bir klasörde düzenleyin. Plakaları ayırt eden dosya adlarını seçin, çünkü bu dosya adları her sayım kümesi için sütun başlıkları haline gelir. Bu klasörün içinde, "kırpılmış" ve "alındılar" adlı alt klasörler oluşturun.</li>
		<li>Croptacular'ı başlatın ve kırpmaya başlamak için Tamam'ı tıklatın. NOT: Varsayılan ayarlar görüntülenir ve genellikle yeterlidir. Görüntünün çözünürlüğüne, aydınlatmaya, spot boyutuna vb. bağlı olarak, temel parametrelerin ayarlanması yararlı olabilir.</li>
		<li>Görüntü zaten düzse, Boşluk tuşuna basmanız yeterlidir. Aksi takdirde, yatay hale gelmesi gereken bir kenar boyunca bir çizgi çizerek görüntüyü düzeltin. Görüntü hala düzleştirilmiş görünmüyorsa, çizgiyi gerektiği kadar yeniden çizin.</li>
		<li>Ardından, sayımın yapılacağı alanın bir sınır kutusunu çizin. Tüm noktalar hücrelerinin içinde olana kadar boyutu ve oranı ayarlayın. Kılavuzu yenilemek için imleci sınır kutusunun dışına sürükleyin. Izgara iyi göründüğünde, Boşluk tuşuna basın.</li>
		<li>Bir sonraki görüntünün otomatik olarak ilki ile aynı açıya döndüğünden emin olun; eklenti, tüm fotoğrafların aynı hizada olduğunu varsayar. Bu doğruysa, devam etmek için Boşluk tuşuna basın. Aksi takdirde, görüntüyü daha önce olduğu gibi düzeltin. Izgara ayrıca önceki görüntüyle aynı konumu hatırlar; gerekirse ayarlayın ve ardından Boşluk tuşuna basın.</li>
	</ol></li>
	<li>ImageJ için sağlanan Count-On-It: Gridiron eklentisini (Ek Kodlama Dosyası 4) kullanarak plakalardaki kolonileri numaralandırın. Eklentiyi yüklemek ve kullanmak için ayrıntılı talimatlar Ek Dosya 3'te bulunmaktadır.<ol><li>Count-On-It > Gridiron'u başlatın. Croptacular ile aynı ızgara ayarlarını kullanın. Kullanıcılar bir klasörün tamamını toplu hale getirebilir, tek bir görüntüyü analiz edebilir veya geçerli görüntüden başlayabilir.</li>
		<li>Eşiği bir üst ve bir alt piksel yoğunluğu değerine göre ayarlayın. Tüm kolonileri seçerken eşiği mümkün olduğunca sıkı hale getirin. İdeal olarak, seçilen koloniler arasında bir miktar boşluk olacaktır, ancak yazılım blobları bir dereceye kadar bölümlendirebilir. Eşik tatmin edici olduğunda "İşlem Gerekli" iletişim kutusunda Tamam'ı tıklayın.</li>
		<li>Sonuçları incelemek için, yakınlaştırın ve koloni sayımlarına daha yakından bakın. İptal'e tıklamak eklentiyi iptal eder. Devam etmek için Tamam'ı tıklatın.</li>
		<li>İlk görüntüde, örneğin minimum koloni boyutunu değiştirmek için ayarlar menüsüne devam etme veya geri dönme seçeneğinin verildiğinden emin olun. Toplu işleme devam etmek için Tamam'ı tıklatın. Ardından, makbuzları ve sonuç tablosunu saklamak için bir klasör seçin. "Alındılar" klasörünü kullanın veya yeni bir klasör oluşturun.</li>
		<li>İlk görüntüden sonra, sonraki görüntüler varsayılan olarak önceki ayarlarla aynı eşiğe gelir. Bu ayarları kullanmak veya ayarları yapmak için Tamam'ı tıklatın. Fotoğraflar tutarlıysa ve ayar doğruysa, "İşlem Gerekli" iletişim kutusunda Tamam'ı tıklayın. NOT: Toplu işlemdeki tüm görüntüler tamamlandıktan sonra, sonuçlar tablosu otomatik olarak makbuzlarla aynı klasöre kaydedilir.</li>
		<li>Yazılım tarafından üretilen sayım makbuzlarını gözden geçirin ve sayım hatalarını manuel olarak düzeltin. ImageJ eklentisi istatistiksel olarak doğrudur, ancak hatalar oluşur. Aykırı değerleri incelemek ve yanlış sayımları belirlemek için makbuzları kanıtlayın. Yazılım, CFU verilerini makbuzlarla aynı klasöre .csv dosyası olarak kaydeder.</li>
	</ol></li>
	<li>Kullanıcı tarafından tercih edilen yazılımı kullanarak verileri analiz edin.</li>
</ol>

<ol><li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animals+in+a+bacterial+world%2C+a+new+imperative+for+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li>
<li>Shepherd, E. S., Deloache, W. C., Pruss, K. M., Whitaker, W. R., Sonnenburg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exclusive+metabolic+niche+enables+strain+engraftment+in+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota.</a> Nature. 557 (7705), 434-438 (2018).</li>
<li>Taur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+domination+and+the+risk+of+bacteremia+in+patients+undergoing+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> Clinical Infectious Diseases. 55 (7), 905-914 (2012).</li>
<li>Buffie, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+microbiome+reconstitution+restores+bile+acid+mediated+resistance+to+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile.</a> Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).</li>
<li>Vandeputte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variability+in+quantitative+human+gut+microbiome+profiles+and+implications+for+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Temporal variability in quantitative human gut microbiome profiles and implications for clinical research.</a> Nature Communications. 12 (1), 6740(2021).</li>
<li>D'hoe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+culturing%2C+modeling+and+transcriptomics+uncovers+complex+interactions+and+emergent+behavior+in+a+three-species+synthetic+gut+community%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated culturing, modeling and transcriptomics uncovers complex interactions and emergent behavior in a three-species synthetic gut community.</a> eLife. 7, 2892(2018).</li>
<li>Ludington, W. B., Ja, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for the gut microbiome.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008398(2020).</li>
<li>Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+communities+of+diverse+Drosophila+species%3A+Ecological+context+of+a+host-microbe+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Bacterial communities of diverse Drosophila species: Ecological context of a host-microbe model system.</a> PLoS Genetics. 7 (9), 1002272(2011).</li>
<li>Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M., Teixeira, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+establishes+a+species-specific+mutualistic+interaction+with+stable+gut-colonizing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005710(2018).</li>
<li>Adair, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+determinants+of+among-species+variation+in+microbiome+composition+in+drosophilid+flies%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Host determinants of among-species variation in microbiome composition in drosophilid flies.</a> The ISME Journal. 14, 217-229 (2019).</li>
<li>Koyle, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster+under+axenic+and+gnotobiotic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rearing the fruit fly Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54219(2016).</li>
<li>Lesperance, D. N. A., Broderick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiomes+as+modulators+of+Drosophila+melanogaster+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Microbiomes as modulators of Drosophila melanogaster homeostasis and disease.</a> Current Opinion in Insect Science. 39, 84-90 (2020).</li>
<li>Grenier, T., Leulier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+commensal+microbes+shape+the+physiology+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">How commensal microbes shape the physiology of Drosophila melanogaster.</a> Current Opinion in Insect Science. 41, 92-99 (2020).</li>
<li>Broderick, N. A., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-associated+microbes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster.</a> Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).</li>
<li>Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantitation+of+microbiota+abundance+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples.</a> Microbiome. 6 (1), 110(2018).</li>
<li>Téfit, M. A., Gillet, B., Joncour, P., Hughes, S., Leulier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+association+of+a+Drosophila-derived+microbiota+with+its+animal+partner+and+the+nutritional+environment+throughout+a+fly+population%27s+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stable association of a Drosophila-derived microbiota with its animal partner and the nutritional environment throughout a fly population's life cycle.</a> Journal of Insect Physiology. 106, 2-12 (2017).</li>
<li>Ryu, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+homeostasis+by+the+homeobox+gene+caudal+and+commensal-gut+mutualism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila.</a> Science. 319 (5864), 777-782 (2008).</li>
<li>Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., Van Hylckama Vlieg, J. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+fast+method+for+determining+colony+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A simple and fast method for determining colony forming units.</a> Letters in Applied Microbiology. 47 (4), 275-278 (2008).</li>
<li>Eckburg, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+the+human+intestinal+microbial+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diversity of the human intestinal microbial flora.</a> Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).</li>
<li>Newell, P. D., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+interactions+determine+the+impact+of+the+gut+microbiota+on+nutrient+allocation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (2), 788-796 (2013).</li>
<li>Costello, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+community+variation+in+human+body+habitats+across+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial community variation in human body habitats across space and time.</a> Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).</li>
<li>Fadrosh, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+dual-indexing+approach+for+multiplexed+16S+rRNA+gene+sequencing+on+the+Illumina+MiSeq+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform.</a> Microbiome. 2 (1), 6(2014).</li>
<li>Vega, N. M., Ludington, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+a+parts+list+to+assembly+instructions+and+an+operating+manual%3A+How+small+host+models+can+re-write+microbiome+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">From a parts list to assembly instructions and an operating manual: How small host models can re-write microbiome theory.</a> Current Opinion in Microbiology. 64, 146-151 (2021).</li>
<li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).</li>
<li>Sundarraman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+interactions+dampen+pairwise+competition+in+the+zebrafish+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome.</a> mBio. 11 (5), 1-15 (2020).</li>
<li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+animal+models+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Simple animal models for microbiome research.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 764-775 (2019).</li>
<li>Friedman, J., Higgins, L. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+structure+follows+simple+assembly+rules+in+microbial+microcosms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Community structure follows simple assembly rules in microbial microcosms.</a> Nature Ecology & Evolution. 1, 0109(2017).</li>
<li>Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiral+plate+method+for+bacterial+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spiral plate method for bacterial determination.</a> Applied Microbiology. 25 (2), 244-252 (1973).</li>
<li>Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., Pasha, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+single+plate-serial+dilution+spotting+%28SP-SDS%29+with+sample+anchoring+as+an+assured+method+for+bacterial+and+yeast+cfu+enumeration+and+single+colony+isolation+from+diverse+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples.</a> Biotechnology Reports. 8, 45-55 (2015).</li>
<li>Nuñez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cost+and+open+source+multi-fluorescence+imaging+system+for+teaching+and+research+in+biology+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering.</a> PLoS One. 12 (11), 0187163(2017).</li>
<li>Putman, M., Burton, R., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+to+automatically+count+bacterial+colony+forming+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simplified method to automatically count bacterial colony forming unit.</a> Journal of Immunological Methods. 302 (1-2), 99-102 (2005).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila.+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila. A Laboratory Handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).</li>
<li>Dodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+commensal+niche+regulates+stable+association+of+a+multispecies+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A gut commensal niche regulates stable association of a multispecies microbiota.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Obadia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+invasion+underlies+natural+gut+microbiome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Probabilistic invasion underlies natural gut microbiome stability.</a> Current Biology. 27 (13), 1999-2006 (2017).</li>
<li>Vega, N. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+assembly+produces+heterogeneous+communities+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine.</a> PLoS Biology. 15 (3), 2000633(2017).</li>
<li>Jaime, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-throughput+WAFFL+system+for+treating+and+monitoring+individual+Drosophila+melanogaster+adults%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+internal+and+external+bacterial+load+during+Drosophila+aging+without+life-span+trade-off%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off.</a> Cell Metabolism. 6 (2), 144-152 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada sunulan ayrıntılı teknikler, bir CFU sayım deneyinde değerlendirilebilecek numune sayısında >100 kat artış sağlar. Bu teknik, bireysel sinekleri analiz etmek için 96 delikli plaka formatını kullanarak Drosophila 12,35,36'daki mikrobiyom deneyleri için mevcut yöntemleri ilerletmektedir. Ayrıca, daha verimli bir nokta kaplama yöntemi19,31 ve bir fotoğraf ve koloni sayma platformu ile otomatik bir iş akışı uygular. Bu yöntemin Drosophila için önemi, deneyleri 96 delikli plaka formatına standartlaştırmaktır, bu da CFU'ların yüksek verimli nicelleştirilmesini sağlamak için otomasyonla çok sayıda biyolojik kopyanın aynı anda kullanılmasını sağlar.
96 kuyucuklu platform, artan transfer sıklığının ve geçici bakterilerin "temizlenmesinin" hem ortalama bollukta hem de numuneler arasındaki varyasyonda önemli bir azalmaya neden olduğunu göstermektedir (Şekil 1B, C), bu gelişmiş protokolün sıkılığını göstermektedir. Ortak konut sineklerinin bir sınırlaması, bakterilerin sinekler arasında yatay transferidir. Önerilen bir çözüm, sinekleri ayrı ayrı Whole Animal Feeding Flat38 gibi 96 delikli bir plaka formatında tutmaktır.
Sinekler etanol içinde yıkandığında bakteri yükünde önemli bir azalma gözlenmemiş olsa da, bu sinekler sadece 3 gün boyunca dış bakterilerin varlığında tutulmuştur. Daha uzun süre muhafaza etmek, daha büyük bir bakteri yükünün39 birikmesine izin verebilir. Bu nedenle, etanolde yıkama hala tavsiye edilir.
Sineklerin 96 delikli plakaya aktarılması, iş akışını ayarlamak için kritik ilk adımdır (Şekil 1A). Sinekler yıkandıktan sonra, kuyucuklara birer birer dağıtılırlar. Bu aşamada, her bir kuyuda hangi koşulların mevcut olduğunu not etmek ve "sinek kayboldu" gibi notları eklemek için bir plaka çizelgesi yararlıdır. Homojenizasyon, bazı önemli uyarıları olan bir başka kritik adımdır. Bakteriler, bir sinek varlığında homojenizasyon işleminde hayatta kalırlar (Şekil 1D, E) ve muhtemelen bu prensip, bakteriler sineğin bağırsağının içindeyken de geçerlidir. Bununla birlikte, bakteriler sadece boncuk çırpıcı plakalarda homojenize edildiklerinde de öldürülürler, bu da homojenizasyonun belirli durumlarda bakteri hücrelerini öldürebileceğini gösterir; bu, örneğin disseke edilmiş bağırsakları homojenize ediyorsa önemli olabilecek bir sınırlamadır. Özellikle, homojenleştirme sırasında CFU'ların kaybı, numunedeki CFU'ların sayısına bağlıdır ve kuyu başına ~ 105 CFU kullanıldığında kayıp minimumdur. CFU'ların daha fazla korunması, homojenizasyonun yarıya kadar durdurulması ve plakanın buz üzerinde soğutulmasıyla sağlanabilir.
Homojenizasyon, bilinen sayıda CFU'nun mikropsuz bir sinekle karıştırıldığı kontrol deneylerine dayanan bu protokolde 5 dakika boyunca gerçekleştirildi ve bu, sinek bakterileri için ampirik olarak çalıştı. Daha az dövülme, pipetlemeye müdahale eden daha büyük sinek parçalarının bulunmasına neden olurken, ~ 10 dakikalık önemli ölçüde daha uzun homojenizasyon süreleri CFU sayımlarını daha değişken hale getirdi. Konik plaka kuyularının daha küçük hacimli ve açılı şeklinin, silindirik 2 mL tüplere kıyasla boncuk çırpma verimliliğini azalttığı gözlenmiştir. Bu genel yaklaşımda, hangi bakteri suşlarının, hangi boncuk çırpma kabının, hangi boncukların ve hangi sinek genotipinin kullanıldığı da dahil olmak üzere birçok varyasyon mümkündür. Bireysel kullanıcı vakalarının, yaklaşımlarını oluşturmak için olumlu kontroller kullanmaları gerekir.
Nokta kaplama yöntemi belirli bir şekilde kullanıldı: PBS'deki L. plantarum WF'nin 1: 2 seyreltmesi MRS plakalarına tespit edildi ve 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edildi (daha küçük koloni boyutları oluşturmak için daha kısa inkübasyon süreleri uygulanabilir). Bu yöntem, başta boncuk çırpıcı ve hem seyreltme serisi hem de spot kaplama için gerekli olan 96 kanallı pipettör (Şekil 2A) olmak üzere ekipmana önceden yatırım yapılmasını gerektirir. Bununla birlikte, oluklu pimlere sahip 96 delikli bir plaka çoğaltıcı da dahil olmak üzere daha ucuz seçenekler mevcuttur. Seyreltme serisi, CFU sayım sonuçlarının doğruluğunu etkileyen kritik bir adımdır. Arıza modları açısından, pipet uçlarını sinek parçaları veya cam boncuklarla tıkamak ve pipet uçlarının pipetleyiciye düzgün bir şekilde yapışmaması veya başka bir nedenle arızalanması mümkündür. Tüm bu sorunlar, etkilenen kuyuların eksik sayılmasına neden olur ve izlenmelidir. Seyreltme serisinin her adımında yeterli karıştırma da çok önemlidir. Her seyreltme, plakayı bir plaka çalkalayıcıya koyarak veya 15-20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, uçları durulamaya da yarayan iyice karıştırılmalıdır. En seyreltilmiş plakadan en az seyreltilmiş plakaya kadar tespit edilerek, uçlar tüm seyreltme serisi için yeniden kullanılabilir. 1:2 seyreltmelerde, sayım, büyüklük sırasına yayılan 2-25 kolonilik bir aralıkta doğrudur (Şekil 2C). Bu nedenle, 1:10 seyreltmeler zamandan ve malzemelerden tasarruf sağlar. Yararlanılabilecek bir diğer değişken, daha küçük koloniler üretmek için ayarlanabilen ve böylece bitişik kolonilerin birleşmesini önleyerek sayılabilir noktaların aralığını artırabilen kuluçka süresidir.
Plakanın kaliteli bir fotoğrafı, CFU'ların analiz edildiği ve süresiz olarak arşivlenebildiği ham kaynak verileri haline geldiği için önemlidir. FluoroBox, agar yüzeyindeki parlamayı en aza indiren eşit ışık yoğunluğuna sahip plakaların fotoğraflarını üretmek için tasarlanmıştır. Ek olarak, tasarım tek renkli LED ışıkları ve renkli fotoğraf filtreleri kullanarak floresan kolonilerini seçici olarak fotoğraflayabilmektedir (Şekil 3A). Kontrollü aydınlatma ve kamera ayarlarına sahip FluoroBox gibi bir kurulumun oluşturulması, otomatik analiz için önemli olan CFU görüntülerinin tekrarlanabilirliğini büyük ölçüde artırabilir. Koloni morfolojileri, floresan yoğunluğu ve zamanın veya yoğunluğun koloni büyümesi üzerindeki etkileri, fotoğraflar kullanılarak analiz edilebilecek özelliklerden sadece birkaçıdır. Fotoğraf kutusu, floresan bakteri kullanılmıyorsa renk filtreleri ve tek renkli ışıklar olmadan oluşturulabilir, bu da maliyeti ve karmaşıklığı azaltır. Bir laboratuvar tarafından farklı bir florofor kullanılıyorsa, burada önerilenlerin yerine farklı uyarma ışıkları ve emisyon filtreleri kullanılabilir. Bir uygulama kullanılarak WiFi üzerinden bir tablete bağlanan bir kamera, hem titremeyi önlemek için otomatik deklanşör özelliği hem de veri aktarımı kolaylığı için kullanışlıdır. Görüntüler tablete ve ardından kablosuz dosya aktarım yazılımı kullanılarak bir dizüstü bilgisayara aktarılabilir. Bu özelliklere sahip önerilen kameralar Malzeme Tablosunda belirtilmiştir.
Count-On-It, ImageJ ile yazılmış bir eklentidir. Otomatik CFU sayma yazılımı, plaka görüntüsünü tek tip 96 kuyucuklu bir ızgaraya böler, her ızgara hücresindeki kolonileri sayar ve sonuçları basit bir elektronik tabloda toplar. Plakadaki ve fotoğraftaki spot ızgaranın konumunda her zaman farklılıklar olduğundan, kullanıcı Croptacular eklentisini kullanarak ızgarayı fotoğrafa manuel olarak uydurmalıdır. Bu aynı zamanda parlama olan plaka kenarına yakın alanları dışlamaya yardımcı olur. Eşiği ayarlamak, görüntüden en doğru CFU sayısını elde etmenin anahtarıdır. Eşik çok yüksek ayarlanırsa, koloniler birleşir; Eşik çok düşük ayarlanırsa, koloniler hariç tutulacaktır. Eşik ayarlandıktan sonra, makro kenarları yumuşatmak ve örtüşmeyi azaltmak için gauss bulanıklığı uygular, havza filtresi çakışan kolonileri böler ve parçacıkları analiz ederek bloblar sayılır. 
Bazen, kolonilerin yoğunluğu belirli bir noktada çok yüksektir. Count-On-It bununla başa çıkmanın bir yolunu sunar. Kısmen birleşmiş kolonilere sahip bir ızgara hücresindeki kolonilerin sayısını tahmin etmek için, önce dairesel bir blobun tüm plakadan ortalama alanı Cortalama olarak alınır. Ardından, blob A 1'in alanı, dairesel bir blob A1/Cort'unun ortalama alanına bölünür. Bu sayı en yakın tamsayıya yuvarlanır ve bu, bir blobda kaç koloni olduğuna ilişkin tahmindir. Bu işlev, eşiğin sayım sonuçlarını etkileyebilmesinin bir nedenidir: birleştirilmiş blob alanına karşı göreli ortalama koloni alanı, eşiğin birleştirilmiş blobları nasıl etkilediğine bağlı olarak farklı olacaktır.
Sunulan yöntemlerin çeşitli sınırlamaları vardır. Bunlar, sıvı medyayı 96 delikli plakalardan doğru bir şekilde dağıtmak için ekipman ihtiyacını içerir. 96 kanallı pipetör veya oluklu çoğaltıcı pim aracı olan bu ekipmanın elde edilmesi binlerce dolara mal olabilir. Daha ucuz alternatifler var ama daha az doğru. Count-On-It aracılığıyla otomatik sayma da bazı sınırlamalar sunar. Örneğin, karma bir popülasyondaki iki koloni türü yalnızca boyuta göre sınırlandırılmışsa, blob sayımı kolonileri doğru türe atayamaz. Bu durumda, blob içeren noktaların sayımlardan çıkarılması gerekir. Kolonilerin morfolojiye dayalı olarak daha da farklılaşması, şu anda uygulanmayan yöntemin değerli bir uzantısı olacaktır. Suşa özgü besinler ve antibiyotikler de dahil olmak üzere seçici ortamların kullanılması, karmaşık görüntü analizi ihtiyacını basitleştirir.
Meyve sineği deneylerinin 96 kuyucuklu plakalarda sürdürülmesi, tek bir deneyde test edilebilecek numune sayısını ve koşullarını çoğaltır ve Drosophila-bakteri ilişkisi fenotiplerinde yüksek verimli taramaları kolaylaştırabilir. Bu yöntemin, karmaşık karışımlardaki birçok bakteri suşunu ayırt etmek için seçici ortam kullanılarak genişletilebileceğini öngörüyoruz. Yöntem, sinek mikrobiyomunun incelenmesiyle sınırlı değildir. CFU'ların nicelleştirilmesi, içme suyundaki koliform sayımlarından patojenlerin tanımlanmasına kadar mikrobiyolojinin birçok uygulamasında yaygındır. Burada sunulan CFU kaplama sistemi, yüksek verimli ekranların yanı sıra sonuçların otomatik olarak alınması, işlenmesi, depolanması ve teslim edilmesini sağlar.

Bağırsak mikrobiyotası ve hayvan konakçısı arasındaki ilişki, mikrobiyomun suş bileşiminin konakçı fizyolojisi için önemli olduğunu gösteren biyolojik çalışmaların1 giderek daha ön saflarında yer almaktadır 2,3,4. Keşif hızı, yüksek doğal bireyler arası varyasyon ve kolonileştirici bakterilerin yüksek çeşitliliği gibi kafa karıştırıcı faktörlerle sınırlandırılmıştır 5,6,7. Meyve sineği, Drosophila melanogaster, doğal olarak düşük çeşitlilikli mikrobiyomu, kullanım kolaylığı ve sağlam konakçı genetiği 8,9,10,11 nedeniyle umut verici bir model olarak ortaya çıkmıştır. Sinekler mikropsuz hale getirilebilir ve tanımlanmış bir mikrobiyota12 ile yeniden ilişkilendirilebilir ve floranın sinek fizyolojik özelliklerini etkilediği gösterilmiştir13,14. Doğuştan gelen flora, hepsi kültürlenebilen sınırlı bir bakteri kümesinden oluşur ve bunların yakın akrabaları da Lactobacilli, Proteobacteria ve Enterococci15 dahil olmak üzere memeli bağırsağına endojen olur.
Mikrobiyomun konakçı özellikleri üzerindeki etkisini incelemek, mikrobiyomun hem hangi türlerin mevcut olduğu hem de mutlak bollukları açısından ölçülmesini gerektirir16. Sinek mikrobiyomunu analiz etmenin baskın yolları, koloni oluşturan birim (CFU)sayıları 17, 16S rRNA gen amplikon dizilimi9 ve 16S rRNA geninin qPCR'si18'dir. CFU sayıları pahalı reaktifler olmadan elde edilebilir ve bakteri hücrelerinin yaşayabilirliğini doğrular19. qPCR dahil olmak üzere 16S teknikleri, mikropların taksonomik kimliklerinin, büyüme gereksinimlerine veya koloni morfolojilerine bakılmaksızın tespit edilebilmesi açısından avantajlara sahiptir20.
Deneylerin, bilinen bakterilerin (gnotobiyotik sinekler) tanımlanmış bir mikrobiyomuna sahip sinekleri kullandığı durumlarda, CFU sayımlarının dizileme21'e göre belirli avantajları vardır. Dizileme pahalıdır, DNA ekstraksiyonu, PCR tabanlı kütüphane hazırlığı ve göreceli bolluklar elde etmek için yüksek verimli dizileme gerektirir22. Yüksek maliyet nedeniyle, numune başına fiyatı23 azaltmak için yüksek verimli sıralama yöntemlerinin tipik olarak toplu olarak gerçekleştirilmesi gerekir. Mutlak bolluk elde etmek için qPCR gibi diğer yöntemler gereklidir16. Buna karşılık, CFU sayımları hızlı ve ucuzdur ve mutlak sayıda canlı hücre verir. Drosophila8 ve solucan, Caenorhabditis elegans25,26 ve gnotobiyotik olarak yetiştirilen larva zebra balığı, Danio rerio dahil olmak üzere diğer küçük mikrobiyom modelleri 24, bilinen büyüme özelliklerine sahip sınırlı bir bakteri yelpazesine sahiptir28. Bu durumlarda, özellikle gnotobiyotik hayvanlarda, CFU sayımı, çok türlü bağırsak topluluklarındaki tüm bakteri türlerini ayırt edebilir21,27,29. Daha yüksek verimli CFU sayım yöntemleri, mikrobiyomun bileşimini ölçmenin maliyet etkinliğini ve hızını daha da artıracak ve diğer birçok mikrobiyoloji deneyine uygulanabilecektir.
CFU'ların agar bazlı büyüme ortamı üzerindeki bakteriyel süspansiyonun seri seyreltme kaplaması ile sayılması, mikrobiyoloji alanında standart bir yöntemdir. Plakalarda yetişen koloniler daha sonra manuel olarak sayılır. Seyreltmeler, araştırmacının sayılabilir bir koloni yoğunluğu seçmesine izin verir (örneğin, plaka başına ~ 100 CFU), yani koloniler birbirine dönüşmez ve makul bir süre içinde sayılabilir. Çoğu mikrobiyolog, 140 yıl önce Robert Koch'un laboratuvarında geliştirilen aynı CFU sayma yöntemini kullanır ve birçok uygulama için bu yöntem hala yeterlidir. Bununla birlikte, çok sayıda numuneyi ölçmeye çalışırken bir sorun ortaya çıkar. Tek bir numune, sayılabilir CFU'lar elde etmek için numunenin 1 ila 10 seri seyreltilmesinin kaplanmasını gerektirebilir, bu nedenle birkaç düzineden fazla numuneyi içeren deneyler vergilendirici hale gelir. CFU numaralandırmasının verimliliğini artırmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Otomatik spiral kaplama, seri seyreltme ihtiyacını ortadan kaldırır30, CFU sayımı için yalnızca bir plaka gerekli hale getirir, ancak numunenin plakalanması süresini uzatır. Tek plakalı seri seyreltme lekelemesi (SP-SDS), numune başına daha az plakadan CFU tahminlerine olanak tanır31. Bu yöntemler, geleneksel yayılma kaplama yönteminde bir gelişmedir, ancak yine de bakteri numunelerinin tek başına işlenmesini ve kaplanmasını gerektirir ve bu nedenle yüksek verim için ideal değildir. Numunelerin 96 kuyucuklu plakalarda işlenmesi ve bu 96 numunenin dikdörtgen agar plakalar üzerinde nokta kaplaması, numunelerin verimini büyük ölçüde artırır19.
Mikrobiyomlar tipik olarak birden fazla suş ve türden oluşur. Türler genellikle koloni morfolojisi veya büyüme ortamı ile ayırt edilebilirken, floresan farklı bakteri türlerini ve büyüme özelliklerini daha da ayırt etmek için kullanılabilir32. Örneğin, aynı türün farklı genotipleri, genetik olarak kodlanmış farklı floresan proteinleri ile etiketlenebilir. Floresan içeren plaka görüntüleme yöntemleri, araştırmacıların CFU tabanlı tahlillerde bu genetik tekniklerden yararlanmalarını sağlar32. Floresanı yüksek verimli CFU sayma yöntemlerine dahil etmek, faydalarını daha da artıracaktır.
CFU'ları manuel olarak saymak, çok sayıda örnek olduğunda hantal hale gelir. CFU'ların otomatik sayımı, plakanın fotoğraflanması ve özel yazılım33 kullanılarak görüntünün işlenmesiyle gerçekleştirilebilir. Sieuwerts ve ark., geleneksel dijital fotoğrafçılık ve ImageJ yazılımı19'u kullanarak nokta kaplamanın gelişmiş kaplama verimliliğini otomatik koloni sayımı ile birleştirdi.
Belirli mikrop ve konakçı derneklerinin fenotiplerini taramak için yüksek verimli bir yöntem, mikrobiyom topluluğu derlemesi çalışmalarına ve konakçı sağlığı ve zindeliği üzerindeki etkiye yardımcı olacaktır. Drosophila mikrobiyomu çalışmaları için, yüksek verimli bir mikrobiyoloji platformu, sinek örneklerinin 96 kuyucuklu plaka formatında işlenmesini, bakteriyel lizis olmadan sinek lizisini, nokta kaplamanın verimliliğini, floresan kullanma ve çoklu floroforları ayırt etme yeteneğini, CFU plakalarının tekrarlanabilir görüntülenmesi için kontrollü bir ışık ortamını ve güvenilir bir otomatik koloni sayma yazılımını içerecektir. Bu makalede, gnotobiyotik sineklerde CFU'ların tahlili için optimize edilmiş, basit, hızlı ve otomatik olan bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, daha önce yayınlanmış yöntemlerin en iyisini birleştiren ve Drosophila'daki bağırsak mikrobiyomunu keşfetmek için optimize edilmiş yeni bir iş akışını özetlemektedir.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Boncuk çırpma ve nokta kaplama< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fly şişeleri</td><td>Genesee</td><td>32-121</td><td>otoklavlanabilir</td></tr><tr><td>Fly flakon tıpaları</td><td>Genesee</td><td>59-201</td><td>otoklavlanabilir</td></tr><tr><td>El Aplikatörü</td><td>3M</td><td>3M PA1</td><td></td></tr><tr><td>Isı Mühürleyen</td><td>Eppendorf</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Mini Boncuk Çırpıcı 96</td><td>BioSpec</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-BeadBeater Cam Değirmeni Boncukları, 0,5 mm</td><td>BioSpec&nbsp;</td><td></td><td></td>11079105</tr><tr><td>MPS 1000 Mini PCR Plaka Döndürücü</td><td>Labnet</td><td>LI-CF-P1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin BenchSmart 96 yarı otomatik pipetleyici</td><td>Mettler Toledo</td><td>30296705</td><td>VP Scientific TempPlate'den oluklu 96 kuyulu pim aleti de dahil olmak üzere daha ucuz seçenekler mevcuttur</td></tr><tr><td>yarı etekli 96 oyuklu PCR plakası, düz etekli, doğal</td><td>USA scientific</td><td>1402-9220</td><td>Isı yalıtım için polipropilen olmalıdır</td></tr><tr><td>Termal Bağ Isı Yalıtım Folyosu</td><td>4titude</td><td>4ti-0591</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Tepsi Plakası, 128 x 85 mm, Polistiren, Steril</td><td>SPL Yaşam Bilimleri</td><td>31001</td><td>Dikdörtgen agar plakaları yapmak için</td></tr><tr><td><güçlü>Fotoğraf kutusu yapısı</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ve frak14; "-20 X &frac12; &rdquo; Cıvatalar (X2)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07BP1WR3H</td><td>Kamera braketini takmak için. Marka önemli değil. Herhangi bir 1/4 "-20 1/2" cıvata çalışır.</td></tr><tr><td>&frac14; "-20 x & frak12; &rdquo; Bağlantı Somunu&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>UPC: 799862376780</td><td>AKA başlık somunu veya bağlantı cıvatası. Bu, lastik bantları plaka tutucuya takmak içindir. Marka önemli değil.</td></tr><tr><td>&frac14; "-20 x & frak34; &rdquo; cıvatalar (X3)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B003QZSZY4</td><td>Plaka tutucu için. Marka önemli değil.</td></tr><tr><td>1/8 inç x & frak12; &rdquo; yıkayıcı</td><td>Amazon</td><td>UPC: 611982484599</td><td>Kutunun dışındaki kapak somunları için yıkayıcı. Marka önemli değil. Akrilik ile karıştırmak için takmadan önce siyah boya püskürtün.</td></tr><tr><td><güçlü>18 Ölçer Tel< / güçlü> - İki İletkenli Güç Kablosu - <güçlü>18 AWG Güç Kablosu ve 10ft< / güçlü</td><td>>Superbrightleds.com</td><td>WP18-2</td><td></td></tr><tr><td>22-10 AWG Kırmızı Tel Somun - WN-R2210 ve <güçlü>Miktar 4< / güçlü></td><td>Superbrightleds.com</td><td>WN-R2210</td><td></td></tr><tr><td>22-18 AWG 3/16in Dişi İtmeli Konnektör - 22-18 AWG ve <güçlü> Miktar 3</güçlü></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SCFP-2218</td><td></td></tr><tr><td>4" Lehimsiz Kelepçeli Jumper Konnektörü - 8mm Tek Renkli LED Şerit Işıklar - <güçlü>Miktar 3</güçlü></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-2</td><td></td></tr><tr><td>4" Lehimsiz Kelepçeli Pigtail Adaptör - 8mm Tek Renkli LED Şerit Işıklar &ndash; <güçlü>Miktar 3</güçlü></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>6" çekmece kolu</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07Z331P99</td><td>Herhangi bir çekmece kolu çalışmalıdır.</td></tr><tr><td>6 inç Çekmece kızakları</td><td>Btibpse</td><td>UPC: 712243424979</td><td>Çekmece sürgülerindeki yavaş kapanan lastik tıpaları kesin.</td></tr><tr><td>8-32 x ve frak12; &rdquo; Kapak Somunları (x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B00HYLZB98</td><td>Çekmece sürgü cıvatalarını kutunun dışına takar. Marka önemli değil. Naylon akriliğe zarar vermez. Akrilik ile karıştırmak için takmadan önce siyah boya püskürtün.</td></tr><tr><td>8-32 x ve frak12; &rdquo; Naylon Cıvatalar (x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07KX9T7NF</td><td>Çekmece kızaklarını takmak için. Marka önemli değil. Spesifikasyonları karşılayan herhangi bir cıvata veya makine vidası çalışır. Naylon akriliğe zarar vermez ve cıvatayı somunla aynı hizada kesmenize izin verir. Akrilik ile karıştırmak için takmadan önce siyah boya püskürtün.</td></tr><tr><td>Akrilik Tutkal</td><td>SCIGRIP</td><td>Ean: 7844908489337</td><td>SCIGRIP Weld-On # 4 Yapışkanlı, Pint ve İğneli Kaynaklı Aplikatör Şişesi</td></tr><tr><td>Siyah Kablo Bağları - 10 Paket - 4 İnç Uzun&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>CT-B04-10</td><td></td></tr><tr><td>Kamera L-Braketi</td><td>WLPREOE, Vikerer, Markasız</td><td>ASIN: B09X46YKQZ</td><td>Kamera, L'nin "dışında" olacak şekilde braket, amaçlanan konfigürasyonundan "ters çevrilmelidir". Bazı braketler iki parça halinde gelir ve bu alternatif konfigürasyona izin verir, bazıları izin vermez, çevrilebilen bir brakete ihtiyacınız olacaktır. Ayrıca bağlantı için 1/4" deliklere sahip olmalıdır. WLPREOE, Vikerer, Markasız. Örnek olarak verilen Amazon Seri Kimlik Numarası.</td></tr><tr><td>Tethering seçeneği için Canon T serisi kamera VEYA</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon, vb.</td><td>1894C002</td><td>Canon Ti serisi fotoğraf makineleri iyi bir seçenektir ve bir bilgisayara bağlanabilir. 18-55 mm standart kit lensi ile kullanın. Kullanılan seçenekler Canon T5'ten T7'ye (mevcut model) önerilir.</td></tr><tr><td>Özel Uzunluk Tek Renkli LED Şerit Işık - Eco Serisi Şerit Işık - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Mavi - 2 metre</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BBLU-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Özel Uzunluk Tek Renkli LED Şerit Işık - Eco Serisi Şerit Işık - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Yeşil & 2 metre</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BGRE-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Özel Uzunluk Tek Renkli LED Şerit Işığı - Eco Serisi Bant Işığı - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Doğal Beyaz 4000K &ndash; 2 metre&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-A40K80-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>&frac14 ile matkap; ", 1/8" matkap uçları</td><td>Siyah & Decker</td> <td>& lrm; BDCDD12PK</td><td>Marka önemli değil.</td></tr><tr><td>Düz Siyah Sprey Boya,&nbsp; 2X Ultra Mat</td><td>Rustoleum</td><td>331182</td><td>Her şeyin içini DÜZ siyaha boyayın. Marka önemli değil.</td></tr><tr><td>Lazer Kesim Akrilik Duvarlar</td><td>Büyük Mavi Testere</td><td>www.bigbluesaw.com</td><td>Ekteki PDF'yi kullanın, kamera için istenen delik dışında üst parçadaki tüm kesikleri silin&nbsp;</td></tr><tr><td>Mean Well LED Anahtarlamalı Güç Kaynağı - LPV Serisi 20-100W Tek Çıkışlı LED Güç Kaynağı - 24V DC - 20 Watt&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>LPV-20-24</td><td></td></tr><tr><td>Panasonic ZS100 bir telefona, tablete veya bilgisayara wifi bağlantısı için</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon vb.</td><td>DMC-ZS100K</td><td>Panasonic kameralar, veri aktarımı ve uzaktan deklanşör seçenekleri için bir bilgisayara kablosuz olarak bağlanabilir. Kullanılan seçenekler iyidir.</td></tr><tr><td>Hızlı Bırakma Plakası</td><td>Neewer Alüminyum 50mm Hızlı Çıkarma Plakası QR Kelepçe 3/8 inç, 1/4 inç</td><td>ASIN: B07417F21D</td> Renk <td>filtrelerini değiştirmek için kameranın kolayca çıkarılabilmesi için bunu brakete ekleyin. Örnek olarak verilen Amazon Seri Kimlik Numarası.</td></tr><tr><td>Lastik Bantlar, Çeşitli boyutlar</td><td>BAZIC Products</td><td>Alliance Rubber 26649</td><td>Lastik bantlar plaka tutucusuna gider. Marka önemli değil.</td></tr><tr><td>Vida / Yapışkanlı Kablo Bağı Montaj Tabanları - 3/4 inç taban ve <güçlü> Miktar 4< / güçlü ></td><td>Superbrightleds.com</td><td>CTMB-20</td><td></td></tr><tr><td>SPST Yuvarlak Rocker Anahtarı - LED yok & ndash <güçlü > Miktar 3< / güçlü ></td><td>Superbrightleds.com</td><td>RRS-SP</td><td></td></tr><tr><td>Tiffen 29 Filtre (Kırmızı) 72 mm & nbsp;</td><td>Tiffen</td><td>72R29</td><td></td></tr><tr><td>Tiffen 58 Filtre (Yeşil) 72 mm</td><td>Tiffen</td><td>7258</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>https://imagej.net/downloads</td><td>N/A</td><td>Ücretsiz. Sadece alıntı: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., &hellip; Cardona, A. (2012). Fiji: biyolojik görüntü analizi için açık kaynaklı bir platform. Doğa Yöntemleri, 9(7), 676&ndash;682. doi:10.1038/nmeth.2019</td></tr><tr><td>MacOSX</td><td>Apple</td><td>N/A</td><td>Count-on-it'te düzenlemeyi ve analiz etmeyi kolaylaştırmak için bir grup fotoğrafı yeniden adlandırmak için Finder'da kullanışlı bir toplu yeniden adlandırma özelliğine sahiptir.</td></tr><tr><td>Unix</td><td>BSD</td><td>Yok</td><td>64 bit</td></tr><tr><td>Windows</td><td>Microsoft</td><td>Yok</td><td>64 bit</td></tr></tbody></table>

drosophila mikrobiyomuna uygulanan 96 delikli plaka formatında hızlı koloni oluşturma birimi sayımı

Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome

Hayvanların bağırsakları, konakçı gelişimini, sağlığını ve davranışını etkileyen kommensal mikroplar tarafından kolonize edilir. Kolonizasyonun hassas bir şekilde ölçülmesi, hem mikrobiyal bileşimi doğrulamak hem de etkilerini incelemek için konakçı ve mikrop arasındaki karmaşık etkileşimleri incelemek için gereklidir. Düşük doğal mikrobiyal çeşitliliğe sahip olan ve tanımlanmış mikrobiyal bileşimi ile arkadan arkaya ekonomik olan Drosophila melanogaster, bağırsak mikrobiyomunu incelemek için model bir organizma olarak ortaya çıkmıştır. Bireysel bir organizmanın mikrobiyomunu analiz etmek, hangi mikrobiyal türlerin mevcut olduğunun tanımlanmasını ve mutlak bolluklarının ölçülmesini gerektirir. Bu makale, çok sayıda bireysel sinek mikrobiyomunun analizi için bir yöntem sunmaktadır. Sinekler 96 delikli plakalar halinde hazırlanır ve aynı anda çok sayıda numunenin işlenmesini sağlar. Mikrobiyal bolluk, bir dizi noktada tek bir agar plakası üzerinde 96 tam sinek homojenatının kaplanması ve daha sonra her bir noktada yetişen koloni oluşturma birimlerinin (CFU'lar) sayılmasıyla ölçülür. Bu kaplama sistemi, plakaların fotoğraflanmasını, floresan kolonilerin farklılaştırılmasını ve bir ImageJ eklentisi kullanılarak kolonilerin otomatik olarak sayılmasını içeren otomatik bir CFU niceleme platformu ile eşleştirilmiştir. Avantajları, (i) bu yöntemin tedaviler arasındaki farklılıkları tespit edecek kadar hassas olması, (ii) nokta kaplama yönteminin geleneksel kaplama yöntemleri kadar doğru olması ve (iii) otomatik sayım işleminin manuel sayımdan daha doğru ve hızlı olmasıdır. Burada sunulan iş akışı, CFU'ların çok sayıda replikasyonda yüksek verimli nicelleştirilmesini sağlar ve in vitro ve diğer küçük hayvan modelleri de dahil olmak üzere diğer mikrobiyoloji çalışma sistemlerine uygulanabilir.

Bu yöntem, koloni oluşturma birimlerine (CFU'lar) plaka oluşturmak için 96 kuyucuklu bir plaka formatı kullanarak mikrobiyal bolluğu ölçer ve tüm sinek homojenat numunelerinde Drosophila mikrobiyomuna uygulanır. CFU'lar, burada sağlanan otomatik bir görüntü analiz yazılımı ile sayılır.

Drosophila Mikrobiyomuna Uygulanan 96 Delikli Plaka Formatında Hızlı Koloni Oluşturma Birimi Sayımı

The intestines of animals are colonized by commensal microbes, which impact host development, health, and behavior. Precise quantification of colonization ...

Koloni oluşturan birimleri veya CFU'ları saymak, mikrobiyolojide standart bir tekniktir, ancak yavaştır ve çok sayıda agar plakası gerektirir. Tekniğimiz, her iki zaman agar plakasında geleneksel CFU sayma yöntemlerine göre yüz kat avantaj sağlar. Küçük hayvan modellerinin, özellikle meyve sineklerinin bağırsak mikrobiyomunu ölçmek için metodolojiyi uyguladık.Bu protokol, gnotobiyotik sineklerdeki CFU'ları ölçmenin basit, hızlı ve otomatik bir yoludur. Bu protokol, CFU'ların fotoğrafını çekmek için DIY tarafından üretilen enstrümantasyon ve bunları saymayı otomatikleştirmek için özel yazılım içeren bir iş akışı sağlar. Bu protokol, daha verimli kaplama ve CFU sayma yöntemlerinin yararlı olabileceği herhangi bir mikrobiyoloji deneyinde kullanılabilir.Sinekleri verimli bir şekilde kullanmak ve plakaları tespit etmek manuel el becerisi gerektirir, bu nedenle bu uygulanmalıdır. Otomatik sayım yazılımını kullanmak, eşik hakkında karar vermeyi gerektirir, bu nedenle makbuzlar, deneyiniz için en iyi parametreleri belirlemek için manuel sayımlarla karşılaştırılmalıdır Prosedürü göstermek, tekniği geliştiren laboratuvarımdan bir araştırmacı olan Ren Dodge olacaktır. Başlamak için, boncuk ölçüm tepsisine 0,5 mikron cam boncuk dökün.Boncukları tepsiye yayın, böylece tüm kuyucuklar dolu ve düzleşir. Ardından, fazla boncukları konik bir tüpe fırçalayın. Şimdi, yarı etekli bir PCR plakasını ölçüm tepsisine baş aşağı yerleştirin ve ölçüm tepsisindeki girintiye yerleştirerek kuyucuklarla hizalayın.Ardından, boncukları aktarmak için hızlıca ters çevirin. PCR plaka yüzeyinden fazla boncukları çıkarın. Tüm kuyuların boncuk içerdiğinden emin olun.Gerekirse, tek bir kuyucuğa boncuk eklemek için bir tartım kepçesi kullanın. Ardından, plakayı alüminyum folyo ve otoklav ile örtün. Plakayı kullanmadan önce, 96 kanallı pipetleyiciyi kullanarak sinekleri eklemeden hemen önce her bir kuyucuğa 100 mikrolitre PBS ekleyin.Anestezi altındaki sinekleri yüzey sterilize etmek için, sinekleri şişeden küçük bir huni kullanarak 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hemen tüpe bir mililitre% 70 etanol püskürtün, tüpü kapatın ve 10 saniye boyunca ters çevirerek karıştırın. Daha sonra, herhangi bir sineği aspire etmekten kaçınırken etanolün bir P-1000 pipeti ile aspire edilmesini sağlayın.Son PBS yıkamasından sonra, tüpü kapatın ve sineklerin kapağa girmesi için kapak tarafı aşağı bakacak şekilde tezgaha birkaç kez sert bir şekilde dokunun. Tüpü açtıktan sonra, forseps kullanarak sinekleri kuyucuklara dağıtın ve her kuyucuğa bir sinek yerleştirin. Yükleme sırasında plakayı buz üzerinde tutarak sinekleri anestezi altında tutun.Kuyucuklara yakın başıboş boncukları çıkarın, çünkü bunlar folyo contasını kırabilir ve sızıntıya neden olabilir. Sızdırmazlık folyonun donuk tarafının plaka üzerinde aşağı doğru yönlendirildiğinden ve parlak tarafın ısı sızdırmazlık elemanına doğru baktığından emin olun. Isı sızdırmazlık maddesini beş saniye boyunca sıkıca bastırın ve folyoyu sabitlemek için el aplikatörü ile yakın.Sinekleri beş dakika boyunca homojenize edin. Sineklerin tamamen homojenize edildiğinden ve çözeltinin renklendiğinden emin olun. Sızdırmazlık folyosundan sıvıyı çıkarmak için, boncuk plakasını 350 G'de mini bir plaka eğirici içinde 30 saniye boyunca döndürün.Sinek homojenatı damlacıklarının sıçramasını önlemek için plakayı tutarken folyoyu çıkarın.Üç dikdörtgen MRS agar büyüme plakasını, kapakları açık olarak biyogüvenlik kabinine en az 10 dakika kuruması için yerleştirin. 96 kanallı bir pipetleyici kullanarak steril 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre PBS ekleyerek iki seyreltme plakası hazırlayın. 96 kanallı pipetleyiciye P-20 uçlarından oluşan bir raf yerleştirin.Numune plakasından 11,1 mikrolitre homojenat aspire ederek 1:10 seyreltme yapın. Şimdi, kuyucuk başına 100 mikrolitre steril PBS içeren ilk seyreltme plakasına dağıtın. Seyreltme plakasını plaka çalkalayıcıda 600 RPM'de 10 saniye boyunca tutun.En az 10 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek tekrar karıştırın. İlk seyreltme plakasından ikinci seyreltme plakasına 11,1 mikrolitre aktarın ve daha fazla seyreltme için karıştırma adımlarını tekrarlayın. Plakaları tespit etmek için, her bir kuyucuktan iki mikrolitreyi 96 kanallı pipetleyiciye yükleyin.Pipetleyici kafasını yavaşça plakanın üzerine indirin, agarın içine bıçaklanmaktan kaçının ve tüm lekelerin dağıtıldığından emin olun. Ardından, sıvı lekelerin hızla agarın içine batırıldığını ve birlikte çalışmadığını kontrol edin. Kalan seyreltme plakaları için kaplama işlemini makalede açıklandığı gibi tekrarlayın.Sıvı agar içine tamamen emildikten sonra, plakaları ters çevirin ve koloniler optimal boyuta ulaşana kadar inkübe edin. Plakaları mantıklı bir şekilde düzenleyin ve fotoğraf çekerken belirli bir sırada tutun. Onları yönlendirin, böylece A1 tüm plakalar için sol üst köşede olur.Plaka kapağını çıkardıktan sonra, plakayı A1 doğru köşeye yönlendirilmiş olarak sahneye yerleştirin. Plakaları görüntüleyin. Görüntüleri bir bilgisayara aktarın ve deneme adı, ortam türü, seyreltme faktörü ve diğer ilgili ayrıntılar dahil olmak üzere yeniden adlandırın.Niceleme için işlenecek görüntüleri bir klasörde düzenleyin. Plakaları ayırt eden dosya adları, çıktı elektronik tablosundaki her sayım kümesi için sütun başlıkları haline gelir. Klasörde Kırpılmış ve Alındılar adlı alt klasörler oluşturun.Bu klasörler çıktı dosyalarını alır. Şimdi ImageJ'den Croptacular eklentisini başlatın ve kırpmaya başlamak için Tamam'ı tıklayın. Kaynak klasörü seçmek için bir iletişim kutusu açılacaktır.Tamam'ı tıklatın. Kaynak klasörü seçin ve Aç'ı tıklatın. Ardından, hedef dizini seçmek için iletişim kutusunda Tamam'ı tıklatın. Hedef klasörü seçin ve Aç tuşuna basın.Görüntü zaten düzse, Boşluk tuşuna basmanız yeterlidir. Aksi takdirde, yatay hale gelmesi gereken bir kenar boyunca bir çizgi çizerek görüntüyü düzeltin. Görüntü düz görünmüyorsa çizgiyi gerektiği kadar yeniden çizin.Ardından, sayım alanı için bir sınır kutusu çizin ve tüm noktalar hücrelerinin içinde olana kadar boyutunu ve oranını ayarlayın. Kılavuzu yenilemek için imleci sınır kutusunun dışına sürükleyin. Izgara iyi göründüğünde, Boşluk tuşuna basın.Eklenti tüm fotoğrafların aynı şekilde hizalanacağını varsaydığından, bir sonraki görüntünün otomatik olarak ilki ile aynı açıya döndüğünden emin olun. Bu doğruysa, devam etmek için Boşluk tuşuna basın. Aksi takdirde, görüntüyü daha önce olduğu gibi düzeltin.Izgara ayrıca önceki görüntüyle aynı konumu da hatırlar. Gerekirse ayarlayın ve Boşluk tuşuna basın. Count-On-It'i başlatın ve Gridiron'u seçin.Eşik koloni yoğunluğunu bir üst ve bir alt piksel yoğunluğu değerine göre ayarlayın. Tüm kolonileri seçerken eşiği mümkün olduğunca sıkı hale getirin. Eşik tatmin edici olduğunda Gerekli Eylem iletişim kutusunda Tamam'ı tıklayın, ardından devam etmek için Tamam'ı tıklayın.İlk görüntüde, devam etme veya ayarlar menüsüne geri dönme seçeneği verilmiştir. Toplu işleme devam etmek için Tamam'ı tıklatın. Ardından, makbuzları ve sonuç tablosunu saklamak için bir klasör seçin. Daha önce oluşturulan Alındılar klasörünü kullanın.İlk görüntüden sonra, aşağıdaki görüntüler varsayılan olarak önceki ayarlarla aynı eşiğe ulaşacaktır. Bu ayarları kullanmak veya ayarları yapmak için Tamam'ı tıklatın. Yazılım tarafından üretilen sayım makbuzlarını gözden geçirin ve sayım hatalarını manuel olarak düzeltin.ImageJ eklentisi istatistiksel olarak doğrudur, ancak hatalar oluşur. Aykırı değerleri incelemek ve yanlış sayımları belirlemek için makbuzları kanıtlayın. Yazılım, CFU verilerini makbuzlarla aynı klasöre CSV dosyası olarak kaydeder.Lactobacillus plantarum ile kolonize edilen sinekler için, günlük olarak steril gıdaya aktarılan, günlük olarak transfer edilen, analizden dört saat önce steril yiyeceklerde tutulan veya günlük olarak transfer edilen ve analizden dört saat önce steril agar üzerinde tutulan sinekler için bakterilerde, aşılamadan sonra steril gıdaya asla aktarılmayan sineklere kıyasla önemli bir azalma olmuştur. Benzer sonuçlar, transfer edilen, transfer sonrası ve temizlenen sineklerin CFU'larda önemli bir azalma gösterdiği, ancak yıkamanın ölçülebilir bir etkiye sahip olmadığı, CFU'lardaki azalmanın bakterilerin kütikülden ziyade bağırsaktan temizlenmesinden kaynaklandığını düşündüren Acetobacter endonezya ile beslenen sineklerde de gözlenmiştir. Nokta başına 2 ila 25 koloni bulunan noktalardaki CFU sayısı, geleneksel yönteme kıyasla hiçbir fark göstermedi.Ortalama 35 koloni olan lekeler, kontrol yayılma plakalarından daha düşük CFU'lar gösterdi. Bu azalma, yoğun noktalarda üst üste binen kolonilerden kaynaklanıyor olabilir. Plaka fotoğraflarında, koloni yoğunluğu arka plandan% 300 daha yüksekti.Lactobacillus plantarum mCherry-pozitif koloniler, mCherry-negatif kolonilerden% 1.000 daha yüksek kırmızı yoğunluk gösterdi. Acetobacter indonesiensis GFP-pozitif koloniler, GFP-negatif kolonilerden% 200 daha yüksek yeşil yoğunluk gösterdi. ImageJ için Count-On-It eklentisi, plaka fotoğraflarından CFU sayımını otomatikleştirir.Koloniler, manuel sayımla karşılaştırılabilir sayımlarla doğru bir şekilde tespit edilir. Sayım makbuzları, yanlış sayımları tanımlamak için kullanılabilir. Değişen boyut eşikleri ve floresan dalga boyları, farklı koloni morfolojilerinin ayrı ayrı sayılmasını sağlar.Boncuk boncuklanmadan önce plakanın iyi kapatıldığından emin olmak önemlidir. Ölçümlerinizi kalibre etmek için pozitif kontroller tasarlamak da önemlidir. Bu tekniği, karışık bakteri topluluklarını incelememize izin veren 96 kuyucuklu plakalardaki in vitro bakteri popülasyonlarını incelemek için de kullanıyoruz.Bu teknik, bağırsak kolonizasyonunu ve kolonizasyondaki biyolojik varyasyonu ölçmek için yüksek verimli tarama yaklaşımlarına izin verir.

fast-colony-forming-unit-counting-96-well-plate-format-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Immün yanıt ve davranış arasındaki bağlantıyı anlamak için, lokomotor davranışları ölçmek için bir yöntem...

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

&gt;Drosophila mikrobiyotası hayvanın gelişimini, bağışıklığını ve fizyolojisini etkiler. Bu video, tüm vücut preparatlarından koloni oluşturan birimleri belirleyerek sineklerden bakteri miktarını belirlemek için bir yöntemi açıklamaktadır. Öne çıkan protokol, dört bakteri türü kullanılarak gnotobiyotik koşullar altında yetiştirilen sineklerle yapılan tekniği göstermektedir.

Koloni Oluşturan Birimlerin (CFU'lar) Sayımı: Sinek Cisimlerinden Bakterilerin Miktarının Belirlenmesi

Kaynak: Dodge, R., ve diğerleri. Drosophila mikrobiyomuna uygulanan 96 oyuklu plaka formatında hızlı koloni oluşturan birim sayımı. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, seri seyreltme ve kaplama yaklaşımı kullanılarak Drosophila sineklerinde bağırsakla ilişkili bakterilerin koloni oluşturan birimlerinin (CFU'lar) miktarının belirlenmesini göstermektedir. Bağırsak bakterileri içeren homojenize sinek örnekleri seri olarak seyreltilir, agar üzerine kaplanır ve koloni büyümesine izin vermek için inkübe...

Drosophila Sineklerinde Bağırsakla İlişkili Bakterilerin Koloni Oluşturan Birimlerinin Miktarının Belirlenmesi

Bu videoda, E. coli'yi  Drosophila melanogaster'in göğüs kafesine enjekte ettikten sonra E. coli bakteri yükünü ölçmek için bir teknik gösteriyoruz.

E. coli Enfeksiyonunu Takiben Drosophila melanogaster'de E. coli Bakteri Yükünün Ölçülmesi

Drosophila melanogaster, doğuştan gelen bağışıklık sistemlerini ve enfeksiyon ve hastalığın fizyolojik sonuçlarını incelemek için olağanüstü bir model organizmadır. Bu protokol, D. melanogaster'e sağlam ve kantitatif olarak tekrarlanabilir bakteriyel enfeksiyonların nasıl sağlanacağını ve daha sonra enfeksiyon şiddetinin nasıl ölçüleceğini ve konak immün yanıtının nasıl ölçüleceğini açıklar.

Sistemik Bakteriyel Enfeksiyon ve Bağışıklık Savunma FENOTİPİ içinde<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aksenik ve gnotobiyotik koşullarda Drosophila melanogaster yetiştirme için bir yöntem sunulmuştur. Fly embriyolar, sodyum hipoklorit dechorionated steril diyet aseptik transfer ve kapalı kaplarda yetiştirilir. Bakteri ile diyet ve embriyolar aşılamak gnotobiyotik dernekler yol açar ve bakteriyel varlığı tüm vücut Drosophila homojenatları kaplama ile teyit edilir.

Meyve Fly Yetiştirme<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Aksenik ve gnotobiyotik Koşullarında

Maya büyüme fenotipleri, mikrokolonlara dönüşen hareketsiz hücrelerin son derece paralel zaman atlamalı görüntülemesi ile tam olarak ölçülür. Aynı zamanda, stres toleransı, protein ekspresyasyonu ve protein lokalizasyonu izlenebilir, çevresel ve genetik farklılıkların yanı sıra izojenik hücreler arasındaki gen ekspresyon heterojenliğinin büyümeyi nasıl modüle ettiğini incelemek için entegre veri kümeleri üretilebilir.

Büyüme ve Gen İfadesinde Heterojenliği Ölçmek için Mikrokolonların Yüksek Verimli Canlı Görüntülemesi

Mikro plaka besleyici tahlili, Drosophila'dakisıvı gıda tüketimini ölçmek için ekonomik, yüksek verim yöntemi sunar. 3D baskılı bir cihaz, sineklerin barındırıldığı 96 kuyulu bir mikro plakayı, sineklerin bir izleyici boyası ile bir besleme çözeltisi tükettiği 1536 kuyulu bir mikro plakaya bağlar. Çözelti hacmi düşüşü spektrofotometrik olarak ölçülür.

Drosophila'da Tüketimin Nicelleştirilmesi için Yüksek Verimli Mikro Plaka Besleyici Tahlili

Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrobiyom etkileşimlerini yönlendiren moleküler belirleyicileri incelemek için güçlü bir modeldir. C. elegans fizyolojisinin temel yönleriyle birlikte bağırsak mikrobiyom kolonizasyonunun tek hayvan seviyelerinin profilini çıkaran yüksek verimli bir boru hattı sunuyoruz.

Caenorhabditis elegans Bağırsak Mikrobiyomunun Miktar Tayini ve Analizi için Akış Vermimetrisinin Uygulanması

Koloni oluşturan birimlerin (CFU) belirlenmesi, görünür koloniler oluşturması haftalar sürebilen Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere bakterilerin miktarını belirlemek için altın standart tekniktir. Burada, artan zaman verimliliği, azaltılmış laboratuvar alanı ve reaktif maliyeti ve orta ve yüksek verimli deneylere ölçeklenebilirlik ile CFU belirleme için bir mikro-CFU'yu açıklıyoruz.

Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi

Hücre hatları, konakçı hücrelerinin dışında kültürlenemeyen hücre içi organizmalar üzerinde yapılan çalışmalarda faydalıdır. Wolbachia ile enfekte olmuş hatlar birçok keşfi mümkün kılmış olsa da, bu hatlardaki heterojenlik değişken deneysel sonuçlara yol açabilir. Wolbachia ile enfekte JW18 hücrelerinden tek hücreli klonlar ve sürekli kültürler oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Wolbachia ile enfekte Drosophila melanogaster JW18 Hücre Hattından Monoklonal Kültürlerin Üretilmesi

Öğrenin, Drosophila bağırsak mikrobiyomunda koloni oluşturma birimi sayımı için otomatik görüntü analizi kullanarak hızlı ve verimli bir yöntem. Bu protokol, geleneksel yöntemlere göre yüz kat zaman avantajı sağlar.

Drosophila Mikrobiyomuna Uygulanan 96 Delikli Plaka Formatında Hızlı Koloni Oluşturma Birimi Sayımı

Daha fazla video keşfet