Name: Farelerde İntratimik Enjeksiyon için Minimal İnvaziv, Doğru ve Etkili Bir Teknik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Öğrenin, farelerde intratimik enjeksiyon için minimal invaziv, ultrason rehberliğiyle güvenli ve hassas bir yöntem. Yaşlı veya immün yetmez farelerde atrofik timüsler için idealdir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Raymond H. Thornton'a bu teknik üzerindeki anlayışlı ve kapsamlı erken çalışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI 1R37CA250661-01A1), Çocuk Lösemi Araştırma Derneği, Hackensack Meridyen Tıp Fakültesi ve HUMC Vakfı / Çocuk Kanseriyle Mücadele hibe desteği ile finanse edilmiştir.

Tüm prosedürler, Keşif ve İnovasyon Merkezi'ndeki (IACUC protokolü 290) hayvan bakımı kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, C57BL/6 fareler (dişi, 4-6 haftalık), C57BL/6 fareler (dişi, 6 aylık), J:NU dişi fareler, NOD scid gama (NSG) dişi fareler ve B6; CAG-luc, -GFP fareler sırasıyla genç fare modeli, yaşlı fare modeli, atimik çıplak model, immün yetmezlik modeli ve biyolüminesans hücre kaynağı olarak kullanılmıştır. Fareler ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Bu prosedür tipik olarak iki kişi gerektirecektir (biri enjeksiyonları gerçekleştirirken steril kalmak ve diğeri fareleri idare etmek için).
1. Hayvan hazırlığı
<ol><li>%3-%4 izofluran gazı kullanarak farelerde anesteziyi indükleyin ve burun konisi ve hassas kalibre edilmiş buharlaştırıcı ile uygulanan %1-%3 izofluran gazı kullanarak anesteziyi sürdürün (bkz.</li>
	<li>Arka pençe sıkışmasına yanıt vermeyerek uygun anestezik derinliği / bilinçsizliği onaylayın.</li>
	<li>Kürkü, farelerin ön göğüs bölgesinden, 1 dakikadan daha kısa bir süre boyunca ince bir tüy dökücü krem tabakası uygulayarak çıkarın. Kremayı gevşek kürkle birlikte tamamen çıkarmak için ıslak bir kağıt havlu kullanın. NOT: Çok fazla krem uygulamak göğüs bölgesi cildinin iltihaplanmasına neden olur.</li>
	<li>Her seferinde bir fareyi, sırtüstü olarak, küçük hayvan ultrason görüntüleme istasyonunun ısıtılmış platformuna yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) burun konisi yerinde olacak şekilde (Şekil 1).</li>
	<li>Fareyi arka ve ön ayaklarda tıbbi yapışkan bant ile sahneye sabitleyin (Şekil 1).</li>
	<li>Kornea kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.</li>
	<li>Kürksüz üst toraks derisini bir klorheksidin glukonat aplikatörü kullanarak dezenfekte edin (bkz.</li>
</ol>2. Ultrason makinesinin ve steril alanın hazırlanması
<ol><li>Mevcut en yüksek frekanslı lineer probu, tipik olarak görüntülenen hayvanın büyüklüğü için en yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip probu etkinleştirin. Başlangıç ekranından sonra ilgili düğmeye dokunarak probu etkinleştirin. NOT: Farelerle yapılan bu uygulama için, kullanılan prob özellikle fareler ve küçük sıçanlarla kullanılmak üzere tasarlanmıştır (bkz.</li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek görüntüleme ve enjeksiyon için ultrason ayarlarını optimize edin.<ol><li>Ekranın sağ tarafındaki dikey yönelimli kaydırıcıları ayarlayarak görüş alanının derinliğini hedef hayvan için uygun bir boyuta ayarlayın (Şekil 2). Maksimum derinlik ayarı, genç fareler için tipik olarak yaklaşık 6-8 mm olacaktır.</li>
		<li>Düğmeyi ekranın altındaki yatay çubuk boyunca kaydırarak gri tonlama kazancını ayarlayın (Şekil 2). Amaç, tipik bir "gri" görünümden biraz daha koyu bir görüntüyle başlamaktır.</li>
		<li>Odak bölgesini (ekranın sağındaki mavi ok, Şekil 2) beklenen timus seviyesine ayarlayın. Genç fareler için bu, 4 mm'lik bir derinlik civarında olacaktır.</li>
		<li>Görüntü yakalama isteniyorsa, görüntülerin yordam boyunca uygun şekilde kaydedilebildiğinden emin olmak için depo görüntüsünün işlevselliğini ve depo klibi düğmelerini sınayın. Bunu, ekranın sağ alt köşesindeki Klibi Kaydet düğmesine veya Dondur düğmesine ve ardından Görüntüyü Kaydet'e dokunarak gerçekleştirin (Şekil 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Dönüştürücü yüzeyine, ultrason makinesi tutucusunda veya bir asistanın elinde durarak, dik durumdayken az miktarda (~ 1 mL ) ultrason jeli uygulayın (bkz.</li>
	<li>Isıtmalı platformun yanında küçük bir steril alan hazırlayın. Bunun için en uygun konumlandırma genellikle platform ve ultrason makinesi arasındadır.<ol><li>Bu maddeleri steril alana boşaltın: steril bir prob kapağı, lastik bant, steril eldivenler ve steril ultrason jeli (bkz.</li>
		<li>Steril alan kurulduktan ve eşyalar yerleştirildikten sonra, steril eldivenleri giyin.</li>
		<li>Steril prob kapağını ultrason dönüştürücüsünün üzerine (ve başlangıçta proba yerleştirilen jelin üzerine) dikkatlice yerleştirin. Steriliteyi koruyun ve sadece steril kapağa dokunun, başka bir şeye değil. Steril lastik bandı yerinde tutmak için steril prob kapağının üzerine kaydırın. NOT: Hava odakları, boyutlarından bağımsız olarak, ultrason görüntülemeye müdahale edebilir. Bu nedenle, ultrason jelinin dönüştürücü ve steril prob kapağı arasına ve ultrason probu ile hayvan arasında havasız bir arayüz sağlamak için prob kapağının üstüne uygulanması önemlidir.</li>
		<li>Transdüserin üzerine ılımlı miktarda (2-3 mL) steril ultrason jeli yerleştirin. NOT: Kullanıcı artık anestezi uygulanmış bir fareyi görüntülemeye hazırdır.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Timüsün görüntülenmesi ve bulunması
<ol><li>Steriliteyi korurken, ultrason jel kaplı probu, ilk görüntüleme için farenin ön göğüs duvarının dezenfekte edilmiş kısmına dikey olarak yerleştirin.<ol><li>Ultrason görüntüsüne bakmak ve daha da optimize etmek için bir dakikanızı ayırın. Adım 2.2'ye geri dönün ve Şekil 3'ünkine benzer bir görünüm elde etmek için ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Farenin ön göğsünü enine düzlemde tarayın. Bunu, dönüştürücüyü dikey olarak tutarak ve boya fırçası benzeri veya "süpürme" hareketiyle boyundan karnına yukarı ve aşağı hareket ettirerek gerçekleştirin. NOT: Kalp, hızlı hareketi ve "odacıklı" görünümü nedeniyle göğüsteki en tanınabilir yapı olacaktır. Kalp lokalize olduğunda, bu timüsün görüntüsünü elde etmek için bir referans noktası olarak kullanılabilir.</li>
	<li>Kalp görüş alanında ortalanmışken, dönüştürücüyü hafifçe boyuna doğru süpürün. Kalbe göre daha üstün olan timusla genellikle karşılaşılır.</li>
	<li>Timüsü, orta hatta ortalanmış, aortun ön tarafında ve sternumun arkasında bulunan bilobed, piramidal, hipoekoik ("karanlık" veya "siyah" ekranda görünen) bir yapı olarak görselleştirin (Şekil 3A).</li>
	<li>Üst göğsün her iki tarafındaki iki yuvarlak eşleştirilmiş siyah (yani, "hipoekoik") yapıya dikkat edin. NOT: Bunlar bilateral venae kavalardır. Aort, iki venae kava arasındaki orta hatta benzer eğrisel hipoekoik bir yapıdır. Bunlar pulsatil hareketleriyle kolayca tanınabilir.</li>
</ol>4. Timus enjeksiyonu
<ol><li>Gerekirse, dönüştürücüye daha fazla (2-3 mL) steril ultrason jeli uygulayın. NOT: Dönüştürücü üzerindeki nispeten büyük miktarda steril jel (fare göğüs kafesinin boyutuna kıyasla), farenin göğüs duvarının etrafında bir "jel ped" görevi görecektir. Bu, görüş alanı içinde hava ile yapılan ultrason eserlerinin sayısını azaltacaktır.</li>
	<li>Ultrason probunu kullanarak, genellikle enjeksiyon için ideal hedef bölge olan timusun en geniş kısmını bulun. Seçilen konumda yatay bir iğne yörüngesi tahmin edin.<ol><li>Ana kan damarlarının (SVC'ler ve aort) bu bölgede nerede bulunduğuna dikkat edin. Enjeksiyon sırasında bunlardan kaçının.</li>
		<li>Kan damarları, adım 3.7'de açıklandığı gibi hipoekoik, pulsatil yapılar olacaktır. Emin değilseniz, damarlar içindeki akışı kontrol etmek için renkli Doppler modunu kullanın (Şekil 4A). Ekrandaki Renk (Color ) düğmesine dokunarak renkli Doppler modunu etkinleştirin.</li>
		<li>Ana kan damarlarından birinin (veya kalbin) beklenen iğne yörüngesi boyunca olması bekleniyorsa, yeni bir hedef alan seçin veya farklı bir yaklaşım / yörünge bulun.</li>
	</ol></li>
	<li>Transdüseri bir elinizde tutun ve diğer elinizde 10 μL enjekte edilen 30 G insülin iğnesini ( Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: Enjektör, deneysel tasarıma bağlı olarak değişecektir. Bu çalışmada fosfat tamponlu salin, tripan mavisi veya D-lusiferin (0.1 μg / 10 μL) kullanılmıştır.</li>
	<li>Enjeksiyon işlemine başlamak için, transdüseri yanal olarak hareket ettirin, böylece timus ultrason görüş alanında merkezden uzakta olur. Görüş alanının diğer tarafının çoğunlukla ultrason jelinden ve başka hiçbir şeyden oluşmadığından emin olun.</li>
	<li>İğnenin ucunu dönüştürücünün altındaki jele yerleştirin ve iğneyi cilt yüzeyine bitişik olarak görselleştirilene kadar yavaşça hareket ettirin (Şekil 4B).</li>
	<li>İğneyi ultrason altında sürekli görüntülerken, iğneyi kan damarlarından uzakta, perkütan bir yörünge ile timus bezine yerleştirin.<ol><li>İğne ucunu giriş bölgesine aykırı timik loba yerleştirmek için "çapraz timus" yatay yörüngesini kullanın. Bu, iğne yolu boyunca potansiyel sızıntıyı açıklar (Şekil 5A).</li>
	</ol></li>
	<li>İğne ucu timusun istenen kısmının içine girdikten sonra, sonografik görselleştirme kullanırken içeriği (10 μL tripan mavisi veya D-lusiferin, 0.1 μg / 10 μL gibi) 30 G şırıngadan hızlı bir şekilde enjekte edin.<ol><li>İğne yerleştirme ve enjeksiyon sırasında şırıngayı stabilize etmek için, şırıngayı başparmak ile üçüncü parmak arasında tutun ve şırınga pistonunu işaret parmağıyla kontrol edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Tüm içerikler yatırıldıktan sonra iğneyi çıkarın.</li>
</ol>5. Hayvanların enjeksiyon sonrası izlenmesi
<ol><li>Hayvanı boş bir kafese aktarın ve sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözlemleyin. NOT: Anesteziden tam iyileşmenin 2 dakika içinde gerçekleşmesi beklenmektedir.</li>
	<li>Sıkıntı, nefes darlığı veya kanama belirtileri için hayvanı 10 dakika daha izleyin. NOT: Enjeksiyon sonrası ağrı beklenmez ve tipik olarak enjeksiyon sonrası analjeziye gerek yoktur.</li>
	<li>Tamamen iyileştikten sonra ve enjeksiyon sonrası olaysız bir gözlem periyodunu takiben, enjekte edilen hayvanı diğer hayvanların şirketine iade edin.</li>
</ol>

<ol><li>Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+primary+lymphoid+organs+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Changes in primary lymphoid organs with aging.</a> Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).</li>
<li>Gruver, A. L., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%2C+leptin%2C+and+stress-induced+thymic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).</li>
<li>Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice%2C+dirty+mice%2C+and+men%3A+Using+mice+to+understand+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology.</a> Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).</li>
<li>Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+animal+models+in+biomedical+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals+Research%22%5BJournal%5D)">Role of animal models in biomedical research: a review.</a> Laboratory Animals Research. 38 (1), 18(2022).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+What+have+we+learned+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: What have we learned from mice.</a> Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).</li>
<li>Zlotoff, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+and+CCR9+together+recruit+hematopoietic+progenitors+to+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus.</a> Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).</li>
<li>Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+of+T-lymphocytes+induced+by+intrathymic+injection+of+a+thymic+epithelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line.</a> Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).</li>
<li>Schwarz, B. A., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+hematopoietic+progenitors+with+T+lineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential.</a> Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).</li>
<li>Marodon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+antigen-specific+tolerance+by+intrathymic+injection+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors.</a> Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).</li>
<li>Adjali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+correction+of+ZAP-70+immunodeficiency+by+intrathymic+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).</li>
<li>Tuckett, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided+intrathymic+injection+of+multipotent+stem+cells+supports+life-long+T+cell+immunity+and+facilitates+targeted+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy.</a> Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).</li>
<li>Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymic+injection+of+hematopoietic+progenitor+cells+establishes+functional+T+cell+development+in+a+mouse+model+of+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency.</a> Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109(2017).</li>
<li>Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+induced+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Surgeon%22%5BJournal%5D)">Surgery induced immunosuppression.</a> Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).</li>
<li>Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+method+for+intrathymic+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">An alternative method for intrathymic injections in mice.</a> Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).</li>
<li>Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-hand+ultrasound+guidance+permits+safe+and+efficient+minimally+invasive+intrathymic+injections+in+both+young+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).</li>
<li>Küker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+necropsy+reports+for+animal+health+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">The value of necropsy reports for animal health surveillance.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 191(2018).</li>
<li>Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+thymocyte+death+underlies+the+CD4%3ACD8+T-cell+ratio+in+the+adaptive+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).</li>
<li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intrathymic injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li>
<li>de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+intrathymic+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Refinement of intrathymic injection in mice.</a> Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Ultrason rehberliğinde serbest el enjeksiyonu, çalışma materyallerini timusa verimli ve aseptik bir şekilde iletmek için oldukça doğru bir tekniktir. Enjeksiyon bölgesinde cildin ilk sterilizasyonunu takiben, steril eldivenler, steril ultrason prob kapakları ve steril ultrason jeli kullanımı nedeniyle prosedür sırasında sterilite korunur. Kör perkütan yaklaşım 10,17'nin aksine veya farelerde intratimik enjeksiyonlar için yaygın olarak kullanılan yöntemler olan timus 1...

Timus, T hücresi gelişimi ve bağışıklığında önemli bir role sahiptir. Timik evrim, genetik bozukluklar, enfeksiyonlar ve kanser tedavilerinin neden olabileceği T hücre eksikliği, diğer faktörlerin yanı sıra, yüksek mortalite ve morbiditeye yol açmaktadır 1,2. Fare modelleri hem temel hem de translasyonel immünoloji araştırmalarında vazgeçilmezdir ve timik biyoloji ve T hücresi gelişimini incelemek ve ayrıca timik disfonksiyon ve T hücre eksikliğinden muzdarip olanlar için tedaviler geliştirmek için onlarca yıldır kullanılmaktadır 3,4,5.
Timik araştırmaların merkezi bir kısmı, fare modellerinde hücreler, genler veya proteinler gibi biyolojik materyallerin intratimik enjeksiyonu olmuştur 6,7,8,9,10,11,12. Konvansiyonel intratimik enjeksiyon yöntemleri, torakotomi ve ardından doğrudan görselleştirme altında intratimik enjeksiyon veya mediastenin içine "kör" perkütan enjeksiyon kullanır. Cerrahi yaklaşım, diğerlerinin yanı sıra pnömotoraks riskini önemli ölçüde artırır. Dahası, bu ameliyat sırasında artan stres immünsüpresyona neden olur, böylece potansiyel olarak immünolojik verilerden ödün verir13. Deneyimli araştırmacılar, bazı uygulamalardan sonra, kör enjeksiyon tekniğini uygulayabilirler, ancak bu yaklaşım daha az doğrudur ve bu nedenle deneysel konuları büyük bir timuslu genç farelerle sınırlar.
Ultrason rehberliğinin kullanımı, geleneksel intratimik enjeksiyon yaklaşımlarına kesin ve minimal invaziv bir alternatif olarak tanıtılmıştır14. Bununla birlikte, serbest el tekniği yerine entegre raylı sistem kullanıldığında bu prosedür çok zaman alıcıdır. Enjeksiyon montajı ile enjeksiyonların gerçekleştirilmesi, dikkatli görüntüleme optimizasyonu ve dönüştürücü standı ve montajı, X, Y ve Z konumlandırma sistemi gibi çeşitli ataşmanların yardımıyla dönüştürücünün konumlandırılmasını ve ayrıca mikro manipülasyon kontrollerinin ve ray sistemi uzantılarının yetkin bir şekilde çalışmasını gerektirir. Basit bir alternatif teknik olan ultrason rehberliğinde timik enjeksiyon, burada bir radyolog tarafından yukarıda açıklanan yöntemlere hem hızlı hem de doğru minimal invaziv bir alternatif olan serbest el yaklaşımı15 kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Daha da önemlisi, mevcut yaklaşım, enjeksiyon montajına ve entegre raylı sisteme ihtiyaç duymadan herhangi bir yüksek çözünürlüklü ultrason görüntüleme sistemi ile gerçekleştirilebilir. Özellikle çok sayıda farenin enjekte edilmesini gerektiren çalışmalar içinyararlıdır 11, her iki timik lobun enjeksiyonunu içeren deneyler için veya yaşlı, ışınlanmış veya bağışıklık sistemi baskılanmış farelerde küçük timüslerin doğru enjeksiyonuiçin 12.

<table><tbody><tr><td>Aquasonic 100 Ultrason Jeli</td><td>Parker Laboratuvarları (Fairfield, NJ, ABD)</td><td>01-01</td><td>Steril Ultrason İletim Jeli</td></tr><tr><td>B6; CAG-luc, -GFP fare</td><td>Jackson Laboratuvarı (Bar Harbor, ME, ABD)</td><td>025854</td><td>Biyolüminesans hücre kaynağı</td></tr><tr><td>BD İğneli İnsülin Şırıngaları</td><td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, ABD)</td><td>328431</td><td>Ultra ince iğne - 12,7 mm, 30 G</td></tr><tr><td>C57BL/6 fare - yaşlı</td><td>Jackson Laboratuvarı (Bar Harbor, ME, ABD)</td><td>000664</td><td>yaş 6 aylık; yaşlı model</td></tr><tr><td>C57BL/6 fare - genç</td><td>Jackson Laboratuvarı (Bar Harbor, ME, ABD)</td> <td>000664</td><td>yaş 4-6 haftalık; genç model</td></tr><tr><td>Chloraprep Tek adımlı 0.67 mL</td><td>CareFusion (El Paso, TX, ABD)</td><td>260449</td><td>klorheksidin glukonat aplikatörü</td></tr><tr><td>Curity Pamuk Uçlu Aplikatör</td><td>Kardinal Sağlık (Dublin, OH, ABD)</td><td>A5000-2</td><td>Steril, 6 "</td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Altın Biyoteknolojisi (St Louis, MO, ABD)</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Henry Schein (Melville, NY, ABD)</td><td>1182097</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina X5</td><td>PerkinElmer (Melville, NY, ABD)</td><td>n/a</td><td>İn vivo biyolüminesans görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>J:NU fare</td><td>Jackson Laboratuvarı (Bar Harbor, ME, ABD)</td><td>007850</td><td>Atimik çıplak model</td></tr><tr><td>Kendall Hipoalerjenik Kağıt Bant</td><td>Kardinal Sağlık (Dublin, OH, ABD)</td><td>1914C</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Cerrahi Nitril Eldivenler</td><td>Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, ABD)</td><td>56892</td><td>Steril Eldivenler</td></tr><tr><td>Nair Tüy Dökücü</td><td>Losyon Kilise ve Dwight (Trenton, NJ, ABD)</td><td>yok</td><td>Tüy dökücü ajan</td></tr><tr><td>NOD scid gama (NSG)</td><td>faresi Jackson Laboratuvarı (Bar Harbor, ME, ABD)</td><td>005557</td><td>İmmün yetmezlik modeli</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS), 1x</td><td>Corning (Corning, NY, ABD)</td><td>21-040- </td><td></td>CV</tr><tr><td>Puralube Vet</td><td>Merhem Med Vet International</td><td>PH-PURALUBE-VET</td><td>Göz merhemi</td></tr><tr><td>Kılıflar</td><td>Kılıflama Teknolojileri (Morgan Hill, CA, ABD)</td><td>10040</td><td>Steril Ultrason Probu</td></tr><tr><td>Sure-Seal İndüksiyon Odasını</td> Kapsar <td>Braintree Scientific (Braintree, MA, ABD)</td><td>EZ-17 85</td><td>Anestezi indüksiyon odası</td></tr><tr><td>Dönüştürücü MX550D</td><td>FUJIFILM VisualSonics ( Toronto, ON, Kanada)</td><td>n/a</td><td>Vevo 3100 görüntüleme probu (25-55 MHz, Merkez İletim: 40 MHz)</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi, PBS MP Biyomedikallerde %0,4 çözelti</td><td>(Solon, OH, ABD)</td><td>91691049</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 3100 Görüntüleme Sistemi</td><td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Kanada)</td><td>yok</td><td>Ultrason görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>Vevo 3100 Laboratuvar Yazılımı</td><td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Kanada)</td><td>yok</td><td>Görüntüleme ve analiz için Sürüm 3.2.7</td></tr><tr><td>Vevo Kompakt Çift Anestezi Sistemi</td><td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Kanada)</td><td>n/a</td><td>Masaüstü izofluran bazlı anestezi ünitesi</td></tr><tr><td>Vevo Görüntüleme İstasyonu</td><td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Kanada)</td><td>n/a</td><td>Prosedürel platform</td></tr></tbody></table>

farelerde İntratimik enjeksiyon için minimal İnvaziv, doğru ve etkili bir teknik

A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

Fare modellerinde intratimik enjeksiyon, genetik ve edinilmiş T hücre bozuklukları da dahil olmak üzere timik ve bağışıklık fonksiyonlarını incelemek için önemli bir tekniktir. Bu, reaktiflerin ve / veya hücrelerin canlı farelerin timusuna doğrudan birikmesi için yöntemler gerektirir. Geleneksel intratimik enjeksiyon yöntemleri, her ikisi de önemli sınırlamalara sahip olan göğüs cerrahisi veya minimal invaziv perkütan kör enjeksiyonları içerir. Ultra yüksek frekanslı ultrason görüntüleme cihazları, farelerde görüntü rehberliğinde perkütan enjeksiyonları mümkün kılarak perkütan enjeksiyon yaklaşımının enjeksiyon doğruluğunu büyük ölçüde artırmış ve daha küçük hedeflerin enjeksiyonunu sağlamıştır. Bununla birlikte, görüntü kılavuzlu enjeksiyonlar, entegre bir raylı sistemin kullanımına dayanır ve bu da bunu katı ve zaman alıcı bir prosedür haline getirir. Farelerde perkütan intratimik enjeksiyonlar için benzersiz, güvenli ve etkili bir yöntem burada sunulmakta ve enjeksiyonlar için raylı sisteme olan bağımlılığı ortadan kaldırmaktadır. Teknik, fare timusunu invaziv olmayan bir şekilde görüntülemek için yüksek çözünürlüklü bir mikro-ultrason ünitesi kullanmaya dayanır. Serbest el tekniği kullanarak, bir radyolog sonografik rehberlik altında doğrudan fare timusuna bir iğne ucu yerleştirebilir. Fareler görüntülemeden önce temizlenir ve anestezi altına alınır. Ultrason rehberliğindeki prosedürlerde usta deneyimli bir radyolog için, belirtilen tekniğin öğrenme süresi, tipik olarak bir seansta oldukça kısadır. Yöntem, fareler için düşük morbidite ve mortalite oranına sahiptir ve perkütan enjeksiyon için mevcut mekanik destekli tekniklerden çok daha hızlıdır. Araştırmacının, hayvan üzerinde minimum stresle her büyüklükteki (yaşlı veya immün yetmezlikli farelerin timusları gibi çok küçük organlar dahil) timüzlerin hassas ve güvenilir perkütan enjeksiyonlarını verimli bir şekilde gerçekleştirmesini sağlar. Bu yöntem, istenirse bireysel lobların enjeksiyonunu sağlar ve prosedürün zaman kazandıran doğası nedeniyle büyük ölçekli deneyleri kolaylaştırır.

Bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması, izlenecek birkaç önemli adıma dayanmaktadır. İlk olarak, timus bezinin kendisinin güvenilir bir şekilde tanımlanması sağlanmalıdır. Genç farelerde, bezin büyüklüğü nedeniyle bu basittir (Şekil 3A). Yaşlı farelerde veya immün yetmezlikli farelerde, daha zor olabilir; Bununla birlikte, modern ultrason ekipmanı ile hala çok uygundur (Şekil 3B, C). İkincisi, iğne yörüngesini ayarlamak kritik derecede öne...

Bu protokol, açık cerrahi riskini önlemek ve kör perkütan enjeksiyonların doğruluğunu artırmak için farelerde intratimik enjeksiyon için oluşturulan girişimsel bir radyoloji prosedürünü tanımlamaktadır.

Farelerde İntratimik Enjeksiyon için Minimal İnvaziv, Doğru ve Etkili Bir Teknik

Intrathymic injection in mouse models is an important technique for studying thymic and immune function, including genetic and acquired T cell disorders. ...

Protokol, geleneksel cerrahi ve kör enjeksiyon yöntemlerine doğru, güvenli ve etkili bir cerrahi olmayan alternatif sunar. Aynı zamanda yaşlı veya immün yetmezlikli farelerde atrofi timusları için en doğru enjeksiyon tekniğidir. En önemli avantajı, çok güvenli ve hassas, aynı zamanda hızlı olan minimal stresli bir enjeksiyon prosedürüdür, böylece cerrahi strese bağlı immünsüpresyondan veri ödün vermeden büyük ölçekli deneylere olanak tanır.İğnenin ve dönüştürücünün hizalanmasını sağlarken göğüs duvarından ilerletmek biraz pratik gerektirir. Bu nedenle, enjeksiyon yapmak veya eğitim vermek için deneyimli bir girişimsel radyolog ile işbirliği yapmanızı öneririz. Prosedürün gösterilmesine yardımcı olacak kişi, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Shaina Anuncio olacak.Başlamak için, kürkü çıkarmak için farelerin ön göğüs bölgesine bir dakikadan az bir süre boyunca ince bir tüy dökücü krem tabakası uygulayın. Kremayı ve gevşek kürkü çıkarmak için ıslak bir kağıt havlu kullanın. Arka pençe sıkışmasına yanıt vermeyerek uygun anestezik derinliği onaylayın.Kornea kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın. Burun konisi yerinde olacak şekilde küçük hayvan ultrason görüntüleme istasyonunun ısıtılmış platformunda sırtüstü pozisyonda her seferinde bir fare yerleştirin. Fareyi arka ve ön bacaklarda tıbbi yapışkan bantla sahneye sabitleyin.Kürksüz üst toraks derisini bir klorheksidin glukonat aplikatörü kullanarak dezenfekte edin. Mevcut en yüksek frekanslı lineer probu etkinleştirin. Tipik olarak, görüntülenen hayvanın büyüklüğü için en yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip prob.Başlatma ekranından sonra ilgili düğmeye dokunarak probu etkinleştirin. Görüntüleme ve enjeksiyon için ultrason ayarlarını optimize etmek amacıyla, ekranın sağ tarafındaki dikey yönelimli kaydırıcıları ayarlayarak görüş alanının derinliğini hedef hayvan için uygun bir boyuta ayarlayın. Düğmeyi ekranın altındaki yatay çubuk boyunca kaydırarak gri tonlama kazancını ayarlayın.Ardından, odak bölgesini timusun beklenen seviyesine ayarlayın. Dönüştürücü yüzeyine, ultrason makinesi tutucusunda veya bir asistanın elinde dururken, dik durumdayken yaklaşık bir mililitre ultrason jeli uygulayın. Isıtılmış platformun yanında küçük bir steril alan hazırlamak için, steril bir prob kapağını, lastik bandı, steril eldivenleri ve steril ultrason jelini steril alana boşaltın.Ardından, steril eldivenleri giyin. Steril prob kapağını ultrason dönüştürücü ve jel üzerine dikkatlice yerleştirin. Steriliteyi korumak için sadece steril kapağa dokunun.Steril lastik bandı yerinde tutmak için prob kapağının üzerine kaydırın. Transdüserin üzerine iki ila üç mililitre steril ultrason jeli yerleştirin. Ultrason jel kaplı probu, steriliteyi korurken, ilk görüntüleme için farenin ön göğüs duvarının dezenfekte edilmiş kısmına dikey olarak yerleştirin.Ultrason görüntüsünü daha önce gösterildiği gibi görüntüleyin ve optimize edin. Farenin ön göğsünü enine bir düzlemde taramak için, dönüştürücüyü dikey olarak tutun ve boya fırçası benzeri veya süpürme hareketiyle boyundan karnına yukarı ve aşağı hareket ettirin. Kalp görüş alanında ortalanmışken, dönüştürücüyü hafifçe boyuna doğru süpürün.Üst göğsün her iki tarafındaki iki yuvarlak eşleştirilmiş siyah yapıya dikkat edin. Ultrason probunu kullanarak, genellikle enjeksiyon için ideal hedef bölge olan timusun en geniş kısmını bulun. Seçilen yerde yatay bir iğne yörüngesi öngörün ve ana kan damarlarının bu bölgede nerede bulunduğunu not edin.Enjeksiyon sırasında bu damarlardan kaçınılmalıdır. Kan damarları hipoekoik pulsatil yapılar olacaktır. Emin değilseniz, damarlardaki akışı kontrol etmek için ekrandaki renk düğmesine dokunarak renkli Doppler modunu etkinleştirin.Transdüseri bir elinizde tutun ve diğer elinizde 10 mikrolitre enjekte edilen 30 gauge insülin iğnesini tutun. Enjeksiyon işlemine başlamak için, transdüseri yanal olarak hareket ettirin, böylece timus ultrason görüş alanında merkezden uzakta olur. Görüş alanının diğer tarafının çoğunlukla ultrason jelinden ve başka hiçbir şeyden oluşmadığından emin olun.İğnenin ucunu dönüştürücünün altındaki jele yerleştirin ve iğneyi cilt yüzeyine bitişik olarak görselleştirilene kadar yavaşça hareket ettirin. İğneyi ultrason altında sürekli görüntülerken, iğneyi kan damarlarından uzakta perkütan bir yörünge ile timus bezine yerleştirin. İğne ucunu giriş bölgesine aykırı timik loba yerleştirmek için çapraz timus yatay yörüngesi kullanın.İğne ucu timusun istenen kısmının içine girdikten sonra, sonografik görselleştirme kullanırken içeriği 30 gauge şırıngadan hızlı bir şekilde enjekte edin. İğne yerleştirme ve enjeksiyon sırasında şırıngayı stabilize etmek için, şırıngayı baş parmak ile üçüncü parmak arasında tutun ve şırınga pistonunu işaret parmağıyla kontrol edin. Tüm içerikler yatırıldıktan sonra iğneyi çıkarın.Genç farelerde, timus bezinin tanımlanması, bezin büyüklüğü nedeniyle basitti. Yaşlı veya immün yetmezlikli farelerde daha zordu. Bununla birlikte, modern ultrason ekipmanı ile hala çok mümkündü.İğne, kalp, aort veya inferior vena kavalardan biri gibi kritik yapıları geçmediğinde başarılı enjeksiyon kaydedildi. İğne ucu, enjeksiyon sırasında hedef konumunda görselleştirildi ve intratimik birikimi doğruladı. Enjeksiyonun intratimik yeri, Luciferin'i lusiferaz transgenik farelere enjekte olarak kullanarak doğrulandı.Bunlar hemen biyolüminesans görüntüleme ile değerlendirildi ve hayvanı feda etmeden enjeksiyonun doğru yerini doğruladı. Alternatif olarak, Trypan Blue, enjeksiyon bölgesinin görsel bir belirteci olarak enjekte edildi ve nekropsi ile ex vivo kullanılarak enjeksiyon doğruluğu enjekte edildi. Grubumuz bu tekniği, genetiği değiştirilmiş progenitör hücrelerin enjeksiyonuna dayanan kanser immünoterapi araştırmaları da dahil olmak üzere birçok büyük çalışma için ve immün yetmezlikli farelerde timik fonksiyonu iyileştirmek için kullanmaktadır.

a-minimally-invasive-accurate-efficient-technique-for-intrathymic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Merkezi sinir sistemi içine yenidoğan farelerin beyin (intraserebroventriküler) ve (intravenöz) 2) sistemik tedavi ajanları tanıtmak içine 1): Bu makale, enjeksiyon iki çok farklı yöntemler göstermektedir.

Fare intraserebroventriküler sayesinde Terapötik Ajanlar teslimi (ICV) ve intravenöz (IV) Enjeksiyon

Bu makalede, meme kanseri hücrelerini meme yağ yastığına enjekte ederek dişi farelerde bir meme kanseri modelinin nasıl oluşturulacağını tartışıyoruz. Örnek protokol ortotopik enjeksiyonu göstermektedir.

Meme Yağ Yastığına Ortotopik Enjeksiyon: Farelerde Meme Kanseri Oluşumu

Profilaktik ve terapötik aşılama çoğu zaman düğümleri ve bağışıklık hücrelerinin dolayısıyla kötü katılımını lenf nedeniyle aşının hafta drenaj güçlü bağışıklık tepkilerini uyarmak için başarısız olur. Lenf düğümlerine aşı doğrudan enjeksiyon ile, sözde lenf sistemi içi enjeksiyon, aşı etkinliği güçlü geliştirilebilir ve aşı doz azaltılabilir.

Fare intralenfatik immünoterapi ve Aşılama

Bu rapor, kısa süreli hafif anestezi altında fare lumbar spinal kordda siRNA yerelleştirilmiş transfeksiyonu için intratekal iğne giriş basit ve hızlı bir yöntem açıklanır.

Farelerde Hızlı noninvaziv Lomber İntratekal enjeksiyon yoluyla Vivo siRNA&#39;nın Transfaksiyon ve Omurilik Gen demonte olarak

Ekokardiyografi perkü- intramiyokardiyal enjeksiyon sıçangil kalp gen transfer ajanları veya hücre verilmesi için etkili, güvenilir ve hedeflenebilir yaklaşımı olmaktadır. Bu protokolde belirtilen adımları izleyerek, operatör hızla bu çok yönlü, minimal invaziv teknikle yetkin olabilir.

Farelerde ultrason eşliğinde transtorasik intramiyokardiyal Enjeksiyon

Burada fareler bir protokol kalp özel gen manipülasyon için mevcut. Anestezi altında fare kalpler dördüncü interkostal uzayda externalized. Daha sonra kodlama belirli genler bir şırınga vivo içinde görüntüleme ve Batı ile protein ifade ölçü tarafından takip Miyokardiyum içine enjekte edildi adenovirüse bakın analiz leke.

Vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde Intramyocardial enjeksiyonla için basit ve etkili bir yöntem

Burada, farelerde serbest el yaklaşımı kullanarak (yani stereotaksik bir cihaz olmadan) intraserebroventriküler enjeksiyonlar yapmak için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklanmaktadır.

Farelerde Serbest El İntraserebroventriküler Enjeksiyonlar

Bu protokol, gen düzenlenmiş hücreler de dahil olmak üzere birkaç hematopoietik veya lösemik kök hücrenin murin ksenogreft modellerinde intrafemoral enjeksiyonunu tanımlar, bu da sadece hücrelerin hızlı ve güvenli bir şekilde nakledilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kemik iliğinin seri analizlerini de sağlar.

Canlı fareler kullanılarak yapılan basitleştirilmiş intrafemoral enjeksiyonlar, sürekli kemik iliği analizine izin verir

Subretinal enjeksiyonlar, fotoreseptör ve RPE hastalıkları için terapötiklerin klinik öncesi gelişimi için vazgeçilmez bir tekniktir. Farelerde intraoperatif başarı oranlarını artıran ve retina hasarını en aza indiren optimize edilmiş bir transskleral subretinal enjeksiyon tekniğini tanımladık.

Farede Optimize Edilmiş Minimal İnvaziv Transskleral Subretinal Enjeksiyon Tekniği

Tümör içi immünoterapiye artan ilgi nedeniyle, erişilebilir ve pratik tümör modelleri seçmek çok önemlidir. Deri altı tümörleri oluşturmak kolaydır ancak görselleştirmek ve manipüle etmek zordur. Bu protokolte, daha iyi görünürlük ve erişilebilirlik sağlayan deri içi tümörlerin oluşumu için yöntemleri tanımlıyoruz.

İntradermal Tümör İmperasyonu Olarak Mısır Kanseri İçin Sağlam Bir Model Olarak İntümörlü İmmünoterapi Çalışmaları

Öğrenin, farelerde intratimik enjeksiyon için minimal invaziv, ultrason rehberliğiyle güvenli ve hassas bir yöntem. Yaşlı veya immün yetmez farelerde atrofik timüsler için idealdir.

Farelerde İntratimik Enjeksiyon için Minimal İnvaziv, Doğru ve Etkili Bir Teknik

Daha fazla video keşfet