Murin Fekal İzolasyonu ve Mikrobiyota Transplantasyonu

Burada, dışkı örnekleri toplamaktan bağırsaktaki değişiklikleri incelemek için İsviçre rulo yöntemini kullanmaya kadar, hastalıktaki dysbiosis mekanizmalarını araştırmada başkalarına rehberlik edecek bir protokol tanımladık. Başlamak için, ötenazi farenin göğsüne ve yanlarına% 70 etanol püskürtün ve gastrointestinal sistemi açığa çıkarmak için cildi ve periton boşluğunu dikkatlice açın. Çekumu izole edin ve ikiye bölmek için steril cerrahi makas kullanın.

Çekumu kısaca açığa çıkarın ve ileumdan proksimal olarak 0.5 santimetre ve kolon ile birleşme noktasında distal olarak 0.5 santimetre kesin. İzole çekumu steril bir Petri kabına aktarın. Çekal içeriğini steril tüplere aktarmak için steril bir spatula kullanın ve alikotları 80 santigrat derecelik bir dondurucuda saklayın.

Taze veya önceden dondurulmuş dışkı peletlerini steril salin içinde 1 ila 20 oranında tekrar askıya alın ve homojenize olana kadar vorteksi askıya alın. Büyük partikül maddeleri gidermek için homojenatı 30 mikrometre gözenekli bir naylon filtreden geçirin. Beş dakika boyunca 79G'de santrifüj yapın ve transplantasyon için kullanmak üzere süpernatantı toplayın.

Mikropsuz alıcı fare başına üç gün üst üste 100 mikrolitre bulamaç için oral gavaj, ardından iki hafta boyunca her üç günde bir gavaj. Fareyi yavaşça önceden ısıtılmış fare tutucusundaki kısıtlamalara yerleştirin ve kuyruğu dışarıda bırakın. Fareyi zorlamamak için sıkıştırmadan üstünü dikkatlice bantlayın.

Farenin tutucuda durmasına izin verin ve alışması için bir tabaka ile kaplı üç ila beş dakika boyunca kuyruk manşeti makine platformuna yerleştirin. Kuyruk manşet pletismografisini kullanarak en az üç tur sistolik basınç ölçümü toplayın ve her hayvan için ortalama bir sistolik basınç için tüm turlardan ölçümlerin ortalamasını alın. Aseptik olarak ötenazi fareden çekal içeriğini toplayın.

Bağırsakları ve diğer dokuları toplamak için, faredeki dokuyu bulun ve bağırsak mikrobiyotasının kardiyometabolik sağlıktaki rolünü incelemek için makasla çıkarın. Birinci günde, fare bağırsağını anal taraftan mide tarafına kadar disseke edin. İzole gastrointestinal sistemin tamamını PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin.

Proksimal ucu mide ucundan yavaşça çekin ve çevredeki yağ ve bağ dokusunu elle çıkarın. İnce bağırsağı izole edin ve her uzunlukta Z tipi zikzak yapın. Ardından, duodenum, jejunum ve ileum elde etmek için kesin.

Bağırsağın çekumun altındaki bölümünü keserek kolonu izole edin. Duodenum, jejunum, ileum ve kolonu kesin. Bağırsağı yırtmadan PBS ile dikkatlice yıkamak ve yıkamak için bir şırınga ve top uçlu bir iğne kullanın.

Bağırsağı filtre kağıdına yerleştirin ve kağıdı bölümün adıyla ve ardından proksimal için sol üst köşede P veya sol alt köşede distal için D ile etiketleyin. Bağırsağı bilyalı uçlu makasla uzunlamasına kesin. Filtre kağıdındaki bağırsağı açın ve gerektiğinde daha fazla PBS ile yıkayın.

Bağırsağı iki filtre kağıdı arasına sıkıştırın ve filtre kağıtlarını bağırsağın yakınındaki dört noktada veya köşede zımbalayın. % 10 formalin nötr tampon çözeltisine batırın ve oda sıcaklığında gece boyunca beş rpm'de bir platform rocker kullanarak çalkalayın. İkinci günde, hazırlanan% 2 agarozu damıtılmış suda, alüminyum folyo ile kaplı bir beherde bir karıştırma çubuğu ile ısıtın.

Dokuları almak için, üst filtre kağıdını sıyırın ve bağırsağı proksimal taraftan yuvarlayın, böylece proksimal taraf önce içeri girer ve lümen slaytta da içeride olacak şekilde içe doğru yuvarlanır. Gerektiğinde 30 gauge iğne veya iki iğne ile sabitleyin. Tek kullanımlık lisansüstü transfer pipetleri kullanarak bir mililitre agarozu aspire edin ve dokulardaki hava kabarcıklarını önlerken agarozu düz bir yüzeyde haddelenmiş bir bağırsak bölümüne dökün.

Agaroz soğuduktan ve katılaştıktan sonra, doku bölümünün etrafındaki ekstra agarozu kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Son olarak, bağırsak bölümlerini doku işleme veya gömme kasetlerine yerleştirin ve dört santigrat derecede% 70 etanol içine batırın. Normal tuz diyetlerinde ve yüksek tuzlu diyetlerde farelerden elde edilen çekal içeriğindeki tür biyoçeşitliliğinin tahmini burada gösterilmiştir.

Yüksek tuza yanıt olarak bağırsak mikrobiyotasındaki değişiklikler, bakteriyel biyoçeşitlilikte bir azalma içeriyordu. Metrik olmayan çok boyutlu ölçekleme, normal tuz ve yüksek tuzlu diyet farelerinden gelen bakterilerin ayrı kümeler oluşturduğunu göstermektedir. Yüksek tuz, artmış bir Firmicutes / Bacteroidetes oranı ile ilişkilidir.

Yüksek tuzla beslenen farelerden dışkı mikrobiyota transplantasyonu, mikropsuz fareleri anjiyotensin II ile indüklenen hipertansiyona yatkınlaştırır. Yüksek tuza bağlı disbiyotik bağırsak mikrobiyotasının aktarılması, normal tuz bağırsak mikrobiyotası alan farelere kıyasla mikropsuz farelerde önemli ölçüde artmış sistolik basınç ile ilişkiliydi. Temsili görüntüler, proteinüri olmadan veya proteinüri ile hiperlipidemi olan farelerden elde edilen iliada apolipoprotein A-I boyasını göstermektedir.

Bu protokol, hem insan hem de kemirgen donörleri için temel deneysel hususlarda başarılı FMT elde etmek için adımları hizalar.