Murin Fekal İzolasyonu ve Mikrobiyota Transplantasyonu
May 26th, 2023
Buradaki amaç, kardiyovasküler hastalıklarda dysbiosis mekanizmalarını araştırmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektir. Bu yazıda, murin dışkı örneklerinin aseptik olarak nasıl toplanacağı ve nakledileceği, bağırsakların nasıl izole edileceği ve "Swiss-roll" yönteminin nasıl kullanılacağı, ardından gastrointestinal sistemdeki değişiklikleri sorgulamak için immün boyama teknikleri tartışılmaktadır.
Burada, dışkı örnekleri toplamaktan bağırsaktaki değişiklikleri incelemek için İsviçre rulo yöntemini kullanmaya kadar, hastalıktaki dysbiosis mekanizmalarını araştırmada başkalarına rehberlik edecek bir protokol tanımladık. Başlamak için, ötenazi farenin göğsüne ve yanlarına% 70 etanol püskürtün ve gastrointestinal sistemi açığa çıkarmak için cildi ve periton boşluğunu dikkatlice açın. Çekumu izole edin ve ikiye bölmek için steril cerrahi makas kullanın.
Çekumu kısaca açığa çıkarın ve ileumdan proksimal olarak 0.5 santimetre ve kolon ile birleşme noktasında distal olarak 0.5 santimetre kesin. İzole çekumu steril bir Petri kabına aktarın. Çekal içeriğini steril tüplere aktarmak için steril bir spatula kullanın ve alikotları 80 santigrat derecelik bir dondurucuda saklayın.
Taze veya önceden dondurulmuş dışkı peletlerini steril salin içinde 1 ila 20 oranında tekrar askıya alın ve homojenize olana kadar vorteksi askıya alın. Büyük partikül maddeleri gidermek için homojenatı 30 mikrometre gözenekli bir naylon filtreden geçirin. Beş dakika boyunca 79G'de santrifüj yapın ve transplantasyon için kullanmak üzere süpernatantı toplayın.
Mikropsuz alıcı fare başına üç gün üst üste 100 mikrolitre bulamaç için oral gavaj, ardından iki hafta boyunca her üç günde bir gavaj. Fareyi yavaşça önceden ısıtılmış fare tutucusundaki kısıtlamalara yerleştirin ve kuyruğu dışarıda bırakın. Fareyi zorlamamak için sıkıştırmadan üstünü dikkatlice bantlayın.
Farenin tutucuda durmasına izin verin ve alışması için bir tabaka ile kaplı üç ila beş dakika boyunca kuyruk manşeti makine platformuna yerleştirin. Kuyruk manşet pletismografisini kullanarak en az üç tur sistolik basınç ölçümü toplayın ve her hayvan için ortalama bir sistolik basınç için tüm turlardan ölçümlerin ortalamasını alın. Aseptik olarak ötenazi fareden çekal içeriğini toplayın.
Bağırsakları ve diğer dokuları toplamak için, faredeki dokuyu bulun ve bağırsak mikrobiyotasının kardiyometabolik sağlıktaki rolünü incelemek için makasla çıkarın. Birinci günde, fare bağırsağını anal taraftan mide tarafına kadar disseke edin. İzole gastrointestinal sistemin tamamını PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
Proksimal ucu mide ucundan yavaşça çekin ve çevredeki yağ ve bağ dokusunu elle çıkarın. İnce bağırsağı izole edin ve her uzunlukta Z tipi zikzak yapın. Ardından, duodenum, jejunum ve ileum elde etmek için kesin.
Bağırsağın çekumun altındaki bölümünü keserek kolonu izole edin. Duodenum, jejunum, ileum ve kolonu kesin. Bağırsağı yırtmadan PBS ile dikkatlice yıkamak ve yıkamak için bir şırınga ve top uçlu bir iğne kullanın.
Bağırsağı filtre kağıdına yerleştirin ve kağıdı bölümün adıyla ve ardından proksimal için sol üst köşede P veya sol alt köşede distal için D ile etiketleyin. Bağırsağı bilyalı uçlu makasla uzunlamasına kesin. Filtre kağıdındaki bağırsağı açın ve gerektiğinde daha fazla PBS ile yıkayın.
Bağırsağı iki filtre kağıdı arasına sıkıştırın ve filtre kağıtlarını bağırsağın yakınındaki dört noktada veya köşede zımbalayın. % 10 formalin nötr tampon çözeltisine batırın ve oda sıcaklığında gece boyunca beş rpm'de bir platform rocker kullanarak çalkalayın. İkinci günde, hazırlanan% 2 agarozu damıtılmış suda, alüminyum folyo ile kaplı bir beherde bir karıştırma çubuğu ile ısıtın.
Dokuları almak için, üst filtre kağıdını sıyırın ve bağırsağı proksimal taraftan yuvarlayın, böylece proksimal taraf önce içeri girer ve lümen slaytta da içeride olacak şekilde içe doğru yuvarlanır. Gerektiğinde 30 gauge iğne veya iki iğne ile sabitleyin. Tek kullanımlık lisansüstü transfer pipetleri kullanarak bir mililitre agarozu aspire edin ve dokulardaki hava kabarcıklarını önlerken agarozu düz bir yüzeyde haddelenmiş bir bağırsak bölümüne dökün.
Agaroz soğuduktan ve katılaştıktan sonra, doku bölümünün etrafındaki ekstra agarozu kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Son olarak, bağırsak bölümlerini doku işleme veya gömme kasetlerine yerleştirin ve dört santigrat derecede% 70 etanol içine batırın. Normal tuz diyetlerinde ve yüksek tuzlu diyetlerde farelerden elde edilen çekal içeriğindeki tür biyoçeşitliliğinin tahmini burada gösterilmiştir.
Yüksek tuza yanıt olarak bağırsak mikrobiyotasındaki değişiklikler, bakteriyel biyoçeşitlilikte bir azalma içeriyordu. Metrik olmayan çok boyutlu ölçekleme, normal tuz ve yüksek tuzlu diyet farelerinden gelen bakterilerin ayrı kümeler oluşturduğunu göstermektedir. Yüksek tuz, artmış bir Firmicutes / Bacteroidetes oranı ile ilişkilidir.
Yüksek tuzla beslenen farelerden dışkı mikrobiyota transplantasyonu, mikropsuz fareleri anjiyotensin II ile indüklenen hipertansiyona yatkınlaştırır. Yüksek tuza bağlı disbiyotik bağırsak mikrobiyotasının aktarılması, normal tuz bağırsak mikrobiyotası alan farelere kıyasla mikropsuz farelerde önemli ölçüde artmış sistolik basınç ile ilişkiliydi. Temsili görüntüler, proteinüri olmadan veya proteinüri ile hiperlipidemi olan farelerden elde edilen iliada apolipoprotein A-I boyasını göstermektedir.
Bu protokol, hem insan hem de kemirgen donörleri için temel deneysel hususlarda başarılı FMT elde etmek için adımları hizalar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, kardiyovasküler hastalıklarda disbiyoz mekanizmalarını araştırmak için bir protokol belirlemektedir. Murin fekal numunelerin aseptik olarak toplanması ve gastrointestinal değişiklikleri incelemek için Swiss-roll yönteminin kullanımı detaylandırılmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Mikrobiyoloji
- Kardiyovasküler Araştırma
Arka Plan
- Disbiyoz, bağırsaktaki mikrobiyal dengesizliği ifade eder.
- Çeşitli hastalıklarla, dahil olmak üzere kardiyovasküler durumlarla bağlantılıdır.
- Bağırsak mikrobiyal ekosisteminin rolünü anlamak, tedavi stratejilerini bilgilendirebilir.
- Disbiyozu inceleyen protokoller, araştırmaların ilerlemesi için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Fekal numune toplamak için ayrıntılı bir protokol sağlamak.
- Bağırsak analizi için Swiss-roll yöntemini göstermek.
- Kardiyovasküler hastalığın disbiyozu üzerindeki araştırmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Murin fekal numunelerin aseptik olarak toplanması.
- Gastrointestinal sistemin, özellikle sekumun izole edilmesi.
- Doku analizi için Swiss-roll yönteminin kullanılması.
- Değişiklikleri gözlemlemek için immünoboyama tekniklerinin kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Fekal numunelerin başarılı bir şekilde toplanması ve korunması.
- Analizler için sekumun etkili bir şekilde izole edilmesi.
- Swiss-roll yönteminin uygulanması, anlamlı veriler elde etmiştir.
- İmmünoboyama, bağırsak morfolojisinde önemli değişiklikler ortaya koymuştur.
Sonuçlar
- Belirtilen protokol, disbiyozu incelemek için değerli bir araçtır.
- Bulgular, kardiyovasküler hastalığın bağırsak sağlığına olan etkisini anlamak için katkıda bulunur.
- Gelecekteki araştırmalar, daha derin bilgiler için bu yöntemler üzerinde gelişmeler sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Murine fecal microbiota transplantation (FMT) protocols enable mechanistic interrogation of gut microbiome contributions to cardiometabolic disease, supporting target validation and translational biomarker discovery. Standardized collection, processing, and transplantation workflows reduce biological ambiguity and facilitate reproducible preclinical modeling of dysbiosis-driven pathophysiology. These capabilities are critical for de-risking early-stage therapeutic hypotheses and informing portfolio advancement decisions in microbiome-targeted drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of microbiota-driven disease mechanisms in controlled murine models.
- Supports functional validation of gut microbiome targets implicated in cardiometabolic disorders.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating the impact of specific microbial communities.
- Provides a platform for hypothesis-driven interrogation of host-microbiome interactions.
Screening & Assay Development
- Standardizes preparation of donor and recipient systems for reproducible FMT studies.
- Enables quantitative assessment of physiological endpoints such as systolic blood pressure.
- Supports assay development for evaluating microbiota-induced phenotypic changes.
- Facilitates downstream screening of microbiome-modulating interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant gut microbiota alterations observed in humans.
- Enables assessment of translational biomarkers such as gut morphology and immunostaining readouts.
- Supports continuity from discovery-stage findings to preclinical validation of microbiome-targeted therapies.
- Provides risk-adjusted data for advancing microbiome interventions toward clinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative phenotyping of microbiome-driven disease models.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing of microbiota contributions to disease phenotypes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative endpoints for comparing donor microbiota effects.
- Analytics: Delivers statistical outputs such as biodiversity indices and blood pressure measurements.
- Translational Research: Aligns gut morphology and immunostaining data with disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for microbiome-targeted R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbiome-disease associations and target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across preclinical studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for microbiome-targeted assets and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of microbiome-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, aseptic technique, and microbiome analytics.
- Demands access to sterile surgical tools, controlled environments, and analytical instrumentation for physiological and morphological endpoints.
- Necessitates cross-team standardization of donor selection, processing, and transplantation protocols.
- May require adaptation for different donor species or disease models based on translational objectives.
- Potential limitations include interspecies variability and the need for rigorous statistical analysis of outcomes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:29
Aseptic Collection of Mouse Fecal Samples
1:21
Fecal Matter Transplantation (FMT)
2:06
Systolic Blood Pressure Measurements
2:47
Assessment of FMT to Cardiovascular Changes and Making Gut Intestine Swiss-Rolls
5:46
Results: Effects of High and Low-Salt Diet, Fecal Microbiota Transplantation from High-Salt Fed Mice, and Immunohistochemistry on the Ileum
7:07
Conclusion
