Name: Nöroinflamasyon ve Nörotoksisiteyi Değerlendirmek için Larva Zebra Balıklarına Lipopolisakkaritin Beyin Ventriküler Mikroenjeksiyonları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Öğrenin, Danio rerio larvalarına beyin ventrikülüne lipopolisakkarit mikroenjeksiyonu yaparak nöroinflamasyon ve nörotoksisiteyi nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, anti-nöroinflamatuar ilaçların hızlı ve etkili bir şekilde test edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Makao ÖİB Bilim ve Teknoloji Geliştirme Fonu'ndan (FDCT) gelen hibelerle desteklenmiştir (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 ve 0016/2019/AKP), Araştırma Komitesi, Makao Üniversitesi (MYRG2020-00183-ICMS ve CPG2022-00023-ICMS) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81803398).

AB vahşi tip zebra balığı ve transgenik zebra balığı hatları elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP ve mpo: EGFP, Çin Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden (ICMS) elde edilmiştir. Hayvan deneyleri için etik onay (UMARE-030-2017) Makao Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından verilmiş ve protokol kurumsal hayvan bakım kılavuzlarını izlemektedir.
1. Zebra balığı embriyo ve larva yetiştiriciliği
<ol><li>Zebra balığı embriyoları (çiftleşme başına 200-300 embriyo) daha önce bildirildiği gibi doğal çift çiftleşme yoluyla üretin28.</li>
	<li>ddH 2 O'da 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl 2·2H2 O ve9,78 g MgCl2·6H 2 O çözerek yumurta suyu (E3) orta boy stoğunu (60×) hazırlayın ve NaOH ve HCl kullanarakpH'ı7,2'ye ayarlayın. E3 ortamının (1×) çalışma konsantrasyonunu hazırlamak için, stoku kullanılmadığında 28,5 °C'de ddH2O. Store'da 60 kez seyreltin.</li>
	<li>Zebra balığı embriyolarını E3 ortamı içeren bir kaba aktarmak için plastik bir transfer pipeti kullanın. Embriyoları bir inkübatörde 28.5 ° C'de yükseltin ve gelişimlerini ve sağlıklarını izleyin. Ölü embriyoları çıkarın ve kirli E3 ortamını günlük taze ortamla değiştirin.</li>
	<li>Zebra balığı görüntüleme deneyleri için, %0,003 N-feniltiourea (PTU) içeren yaklaşık 15 mL 1× E3 ortamında 0-2 saat döllenme sonrası (hpf) embriyo (yaklaşık 200 yumurta) toplamak için plastik bir transfer pipeti kullanın. NOT: PTU, embriyogenez29 sırasında melanofor oluşumunu inhibe edebilir. Embriyogenez sırasında PTU ile embriyoların tedavisi, mikroskopide sinyal tespitini veya floresan ekspresyonunu iyileştirebilir30.</li>
	<li>Zebra balığı embriyolarını, embriyolar istenen gelişimsel larva aşamasına ulaşana kadar yukarıdaki koşullar altında tutun.</li>
</ol>2. Mikroenjeksiyona hazırlık
<ol><li>Cam kılcal boru çekme için beş adımlı protokolü izleyerek, bir mikropipet çektirici kullanarak cam kılcal damarları çekerek enjeksiyona hazırlanın (Malzeme Tablosuna bakınız) (Tablo 1).</li>
	<li>İğnenin ucunu (filamentli ince duvar cam kılcal damarları [3,5 inç], OD 1,14 mm) forseps kullanarak uygun bir açıyla açın (Şekil 2A).</li>
	<li>Kabarcık olmadığından emin olmak için iğneyi 0,1 mL mineral yağ ile doldurun.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon aparatının çelik iğnesinin vidalı kapağını çıkarın. Cam iğne deliğini çelik iğneyle hizalayın ve ardından vidalı kapağı sıkın. Yüklenen iğne mikroenjeksiyon aparatını bir mikromanipülatöre monte edin (bkz.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon aparatının konumunu, mikromanipülatörün cihazı mikroskop altında esnek bir şekilde hareket ettirebilmesi için ayarlayın. Çelik iğnenin kılcal cam tüpe girmesini sağlamak için belirli bir miktarda parafin yağı boşaltın.</li>
	<li>Enjeksiyon çözeltisini (1× PBS veya 5 mg / mL LPS gibi) % 70 etanol ile sterilize edilmiş bir cam slayt üzerine bırakın ve mikroenjeksiyon aparatını, ucun sıvı damlasına yerleştirilmesi için ayarlayın. İğneye ~ 2 μL enjeksiyon çözeltisi yükleyin.</li>
	<li>Mikromanipülatörü (yukarı, aşağı, sol ve sağın ince ayar ayarları) mikroenjeksiyon aparatının iğne ucu yüksek büyütmeli larvalarla aynı görüş alanında olacak şekilde ayarlayın (Şekil 2B).</li>
</ol>3. Mikroenjeksiyonlar için zebra balığı montajı
NOT: Zebra balığı beyin gelişimi 3 dpf içinde gerçekleşir ve iyi gelişmiş bir merkezi sinir sistemi31,32 ile 5 dpf'de olgunlaşır. Bu nedenle, 5 dpf larvaları, LPS aracılı nöronal hasarın yanı sıra davranışsal ve enflamatuar yanıtları incelemek için zaten uygundur.
<ol><li>Enjeksiyon zamanlamasının tutarlılığını korumak için zebra balığı larvalarını ilgilenilen aşamaya ulaştıktan yaklaşık 30 dakika sonra enjekte edin.</li>
	<li>Zebra balığı larvalarını uyuşturmak için, trikaini temiz balık tankı suyuyla birleştirin (son konsantrasyon % 0.02 w / v trikain).</li>
	<li>Bir mikrodalga kullanarak ddH 2 O'da%2'likbir agaroz çözeltisini eritin. Erimiş agarozu plastik bir kaba dökün. %2 agaroz kaplı plastik tabak, 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.</li>
	<li>Anestezi uygulanmış larvaları %2 agaroz kaplı plastik kabın merkezine taşımak için plastik bir transfer pipeti kullanın. İğne erişimi için monte edilmiş larvaları beyin tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin.</li>
</ol>4. Beyin ventrikülünün enjekte edilmesi
<ol><li>Zebra balıklarının beyin ventriküler yapısı görüş alanında açıkça gösterilecek şekilde mikroskobun büyütülmesini ayarlayın (Şekil 2B).</li>
	<li>İğneyi dikkatlice beyin tektumunun üzerine yerleştirin (Şekil 2C).</li>
	<li>Zebra balığı beyninin derisini, mikromanipülatörü kullanarak iğne ucuyla yavaşça delin.</li>
	<li>1 nL 1x PBS veya farklı LPS konsantrasyonlarını (1.0, 2.5 ve 5.0 mg/mL) çıkarmak için ayak pedalına basın (bkz. Beyin ventrikülünün 1 nL% 1 Evans mavi boyası (PBS'de seyreltilmiş) ile enjekte edildiği başarılı ventrikül enjeksiyon görüntüleri örnek olarak gösterilmiştir (Şekil 2D). Larvaları enjeksiyondan hemen sonra E3 ortamını temizlemek için aktarın. 24 saat sonra, mikroskobik görüntüleme, lokomotif davranışsal tahlil ve diğer göstergelerin belirlenmesi için larvaları toplayın.</li>
</ol>5. Görüntüleme
<ol><li>E3 ortamında% 1.5 düşük eriyikli agaroz çözeltisi hazırlayın ve berrak bir sıvı oluşturmak için bir mikrodalgada ısıtın.</li>
	<li>Larvaları bir cam slayta taşımak ve mümkün olduğunca fazla su çıkarmak için temiz bir plastik transfer pipeti kullanın.</li>
	<li>Larvalara% 1.5 düşük eriyikli agaroz damlası eklemek için plastik bir transfer pipeti kullanın. NOT: Larvalara zarar vermemek için eklemeden önce düşük erimiş agarozu pipette bir süre soğutun.</li>
	<li>Larvaları yönlendirmek için 1 mL'lik bir şırınga iğnesi kullanın. Görüntülemeye başlamadan önce agaroz soğuyana ve katılaşana kadar bekleyin.</li>
	<li>Tg(ETvmat2:EGFP) ve Tg(elavl3:mCherry) zebra balığının tüm beynindeki nöron bölgesini ve ayrıca floresan stereo mikroskop altında Tg(mpo:EGFP) zebra balığı beyninde nötrofillerin işe alınmasını gözlemleyin ve fotoğraflayın (bkz. NOT: Görüntüleme için kullanılan floresan mikroskop ayarları aşağıda gösterilmiştir. Tg (ETvmat2: EGFP) zebra balığı beyni (uyarma dalga boyu: 450-490 nm, emisyon dalga boyu: 500-550 nm, görsel büyütme: 100x); Tg (elavl3: mCherry) zebra balığı beyni (uyarma dalga boyu: 541-551 nm, emisyon dalga boyu: 590 nm, görsel büyütme: 100x); Tg (mpo: EFGP) zebra balığı beyni (uyarma dalga boyu: 450-490 nm, emisyon dalga boyu: 500-550 nm, görsel büyütme: 63x).</li>
	<li>ImageJ yazılımını kullanarak Tg(ETvmat2:EGFP) zebra balığındaki Ra nöron bölgesinin floresan yoğunluğunu ve uzunluğunu ve Tg(elavl3:mCherry) zebra balığı beyin nöronlarının floresan yoğunluğunu ölçün ve analiz edin. Tg(mpo:EFGP) zebra balığının beyin bölgesindeki nötrofilleri manuel olarak sayın.</li>
</ol>6. Gen ekspresyon belirteçlerinin belirlenmesi
<ol><li>LPS beyin ventrikül enjeksiyonundan 24 saat sonra, gen ekspresyon belirteçlerinin belirlenmesi ile devam edin. Bunu yapmak için, zebra balığı larvalarını% 0.02 trikain ile uyuşturun (adım 3.2'de belirtildiği gibi).</li>
	<li>Göz ve yumurta sarısı kesesi bölgeleri olmadan larvaların baş kısımlarını (grup başına 40 larva) ayırmak için iki adet 1 mL şırınga kullanın (Şekil 2E).</li>
	<li>RNA'yı larva kafa kısımlarından çıkarın.<ol><li>RNA ekstraksiyonu için, kafa kısmını 200 μL RNA ekstraksiyon reaktifi ile homojenleştirin (bakınız Malzeme Tablosu) 5 s için 11.000 rpm dönme hızında bir doku öğütücü kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>Kloroform-izopropanol yöntemini kullanarak RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin. Bunu yapmak için, 40 μL kloroform ekleyin, tüpleri kuvvetlice sallayın ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Sulu fazı taze bir tüpe (yaklaşık 100 μL) aktarın ve 100 μL izopropanol ekleyin. 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın ve daha sonra 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı çıkarın.</li>
		<li>RNA peletini yıkamak için 200 μL% 75 etanol ekleyin. Numuneleri kısaca vorteksleyin ve ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 7500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve RNA peletini tekrar yıkayın.</li>
		<li>RNA peletini 5-10 dakika boyunca hava ile kurutun, ardından RNA peletini çözmek için 30 μL RNaz içermeyen su ekleyin. Bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak RNA'nın saflığını (260 nm ve 280 nm'de absorbans oranı) ve bütünlüğünü kontrol edin (bkz.</li>
	</ol></li>
	<li>Rastgele primerlerle ters transkriptaz kullanarak adım 6.3'te ekstrakte edilen RNA'dan cDNA'yı sentezleyin (bkz.<ol><li>Nükleaz içermeyen bir tüpe 1 μL rastgele primer, 1 μL dNTP, 1 μg RNA ve damıtılmış su (toplam hacim 12 μL'ye) ekleyin. Karışımı 5 dakika boyunca 65 ° C'ye ısıtın ve buz üzerinde hızlı bir şekilde soğutun.</li>
		<li>Tüpe 1 μL 0.1 M DTT, 1 μL RNaz inhibitörü, 4 μL 5× birinci iplikçik tamponu ve 1 μL M-MLV ters transkriptaz (toplam hacim: 20 μL) ekleyin. Nazikçe karıştırın ve tüpü 2 dakika boyunca 25 ° C'de, ardından 50 dakika boyunca 42 ° C'de inkübe edin. 70 °C'de 15 dakika ısıtarak reaksiyonu etkisiz hale getirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hedef genlerin (IL-1β, IL-6 ve TNF-α) ekspresyonunu belirlemek için piyasada satılan bir RT-qPCR kiti (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak bir qPCR Sistemi üzerinde gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin (bkz. Reaksiyon karışımı (20 μL), 10 μL SYBR yeşili, 0.4 μL ROX referans boyası, ileri ve geri primerlerin her biri 0.8 μL, 6 μL ddH 2 O ve2μL şablon cDNA (1 μg) içeriyordu. PCR amplifikasyonunu şu koşullar altında gerçekleştirin: 30 s için 95 °C, ardından 5 s için 95 °C ve 34 s için 60 °C 40 döngü ve 15 s için 95 °C, 60 s için 60 °C ve 15 s için 95 °C ayrışma aşaması.</li>
	<li>Hedef genlerin mRNA seviyelerini bir temizlik genininkine normalleştirin, uzama faktörü 1 α (Ef1α). Her hedef gen için ekspresyon seviyelerini 2-ΔΔCT yöntemi33 ile hesaplayın. Her genin primer dizileri Tablo 2'de açıklanmıştır.</li>
	<li>Nitrik oksit tayini için, bir doku öğütücü kullanarak kafa kısmını (adım 6.2'de elde edilen) 100 μL soğuk PBS'de homojenize edin. Elde edilen PBS ve baş kısmı süspansiyonunu 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın. Lisatları toplayın ve ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak nitrit konsantrasyon testi34 yapın (bkz.</li>
</ol>7. Zebra balığı lokomotif davranışsal testi
<ol><li>LPS beyin ventrikül enjeksiyonundan 24 saat sonra, zebra balığı larvalarını ayrı ayrı 96 kuyucuklu kare mikroplakanın kuyularına aktarın. Her bir oyuğa 300 μL E3 ortamı ekleyin ve daha sonra larvaları test plakasına alıştırmak için 4 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Larva yüklü mikro plakayı zebra balığı izleme kutusuna aktarın (bkz. Işık kaynağını açın ve ardından çevreye alışmak için larvaları test kutusunda 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Otomatik bir video izleme sistemi kullanarak zebra balığı davranışını izleyin ve kaydedin. Her zebra balığı için 12 seans (her biri 5 dakika, toplam 1 saat) kaydedin. Toplam mesafeyi (etkin olmayan, küçük ve büyük mesafelerden oluşur) her balığın 60 dakikalık bir izleme süresi boyunca hareket ettiği mesafe (mm cinsinden) olarak tanımlayın.</li>
</ol>8. İstatistiksel analiz
<ol><li>Standart analiz yazılımı kullanarak istatistiksel analizler yapın (bakınız Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Sıradan tek yönlü ANOVA kullanarak iki grup arasındaki farkların istatistiksel analizini yapın. Korelasyonların gücünü değerlendirmek için Pearson'ın korelasyon katsayısını hesaplayın. P < 0.05 tüm analizlerde anlamlı bulundu.</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkar olmadığını beyan ederler.

Epidemiyolojik ve deneysel verilerin giderek artan miktarı, kronik bakteriyel ve viral enfeksiyonları nörodejeneratif hastalıklar için olası risk faktörleri olarak göstermektedir36. Enfeksiyon, enflamatuar süreçlerin aktivasyonunu ve konakçı immün yanıtlarını tetikler37. Yanıt bir savunma mekanizması olarak hareket etse bile, aşırı aktive inflamasyon nörogeneze zararlıdır ve enflamatuar ortam yenidoğan nöronlarının hayatta kalmasına izin vermez38. So...

Nöroinflamasyon, merkezi sinir sisteminin (MSS) çeşitli nörodejeneratif hastalıklarının patogenezinde rol oynayan önemli bir anti-nörojenik faktör olarak tanımlanmıştır1. Patolojik hakaretleri takiben, nöroinflamasyon, nörogenezin inhibisyonu ve nöronal hücre ölümünün indüklenmesi de dahil olmak üzere çeşitli olumsuz sonuçlara yol açabilir 2,3. Enflamasyon indüksiyonuna yanıtın altında yatan süreçte, çoklu inflamatuar sitokinler (TNF-α, IL-1β ve IL-6 gibi) hücre dışı boşluğa salgılanır ve nörojen ölümünde ve nörogenezin baskılanmasında çok önemli bileşenler olarak işlev görür 4,5,6.
Enflamasyon mediatörlerinin (IL-1β, L-arginin ve endotoksinler gibi) beyne mikroenjeksiyonu, nöronal hücre azalmasına ve nöroinflamasyona neden olabilir 7,8,9. Gram-negatif bakterilerin hücre duvarında bulunan patojenik bir endotoksin olan lipopolisakkarit (LPS, Şekil 1), nöroinflamasyonu indükleyebilir, nörodejenerasyonu şiddetlendirebilir ve hayvanlarda nörojenezi azaltabilir10. Doğrudan fare beyninin CNS'sine LPS enjeksiyonu, nitrik oksit, pro-inflamatuar sitokinler ve diğer düzenleyicilerin seviyelerini arttırdı11. Ayrıca, LPS'nin lokal beyin ortamına stereotaksik enjeksiyonu, nörotoksik moleküllerin aşırı üretimini indükleyebilir, bu da nöronal fonksiyonun bozulmasına ve ardından nörodejeneratif hastalıkların gelişmesine neden olabilir10,12,13,14,15. Nörobilim alanında, canlı organizmalardaki hücresel ve biyolojik süreçlerin canlı ve zaman içinde mikroskobik gözlemleri, patogenezin ve farmakolojik etkinin altında yatan mekanizmaları anlamak için çok önemlidir16. Bununla birlikte, nöroinflamasyon ve nörotoksisitenin fare modellerinin canlı görüntülenmesi, mikroskopinin sınırlı optik penetrasyon derinliği ile temel olarak sınırlıdır, bu da fonksiyonel görüntülemeyi ve gelişimsel süreçlerin canlı gözlemini engeller17,18,19. Bu nedenle, alternatif nöroinflamasyon modellerinin geliştirilmesi, patolojik gelişimin ve nöroinflamasyon ve nörodejenerasyonun altında yatan mekanizmanın canlı görüntüleme ile incelenmesini kolaylaştırmak için büyük ilgi görmektedir.
Zebra balığı (Danio rerio), evrimsel olarak korunmuş doğuştan gelen bağışıklık sistemi, optik şeffaflığı, büyük embriyo debriyaj boyutu, genetik izlenebilirliği ve in vivo görüntüleme için uygunluğu nedeniyle nöroinflamasyon ve nörodejenerasyonu incelemek için umut verici bir model olarak ortaya çıkmıştır19,20,21,22,23 . Önceki protokoller, LPS'yi mekanik değerlendirme olmaksızın larva zebra balıklarının yumurta sarısı ve arka beyin ventrikülüne doğrudan enjekte etmiş veya ölümcül bir sistemik bağışıklık tepkisi24,25,26,27 indüklemek için balık suyuna (kültür ortamı) LPS eklemiştir. Burada, döllenme sonrası 5 gün (dpf) zebra balığı larvalarında doğuştan gelen bir bağışıklık tepkisini veya nörotoksisiteyi tetiklemek için LPS'nin beyin ventriküllerine mikroenjeksiyonu için bir protokol geliştirdik. Bu yanıt, nöronal hücre kaybı, lokomotor davranış eksikliği, artmış nitrit oksit salınımı, enflamatuar gen ekspresyonunun aktivasyonu ve enjeksiyondan 24 saat sonra zebra balığı beyninde nötrofillerin işe alınması ile kanıtlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6361</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz, düşük jelleşme sıcaklığı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Nanoject III Programlanabilir Nanolitre Enjektör</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Floresan stereo mikroskoplar</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prizma yazılımı</td><td>GraphPad Yazılımı</td><td>Ver. 7.04</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli'den lipopolisakkaritler O111:B4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3024</td><td></td></tr><tr><td>Manuel mikromanipülatör</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005P qPCR sistemi</td><td>Agilent Technologies</td><td>Mx3005P</td><td></td></tr><tr><td>Nanovue plus spektrofotometre</td><td>Biochrom</td><td>80-2140-46</td><td></td></tr><tr><td>Nitrit konsantrasyon test kiti</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>S0021M</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Programlanabilir Yatay Pipet Çektirme</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>PMP-102</td><td></td></tr><tr><td>PTU (N-Feniltiyoüre)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Rastgele primerler</td><td>Takara</td><td>3802</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Ters Transkriptaz</td><td>İnvitrojen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II kiti</td><td>Doğru Biyoloji</td><td>AG11701</td><td></td></tr><tr><td>3. Nesil Töğütücü</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y30</td><td></td></tr><tr><td>İnce duvarlı cam kılcal damarlar (4 inç), filamentli, OD 1,5 mm</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>TW150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Trikain (3-amino benzoik asit etil ester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>TRNzol Üniversal reaktif</td><td>Tiangen</td><td>DP424</td><td></td></tr><tr><td>Zebra balığı izleme kutusu</td><td>Bakış Açısı Davranış Teknolojisi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nöroinflamasyon ve nörotoksisiteyi değerlendirmek için larva zebra balıklarına lipopolisakkaritin beyin ventriküler mikroenjeksiyonları

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Nöroinflamasyon, nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli nörolojik bozukluklarda önemli bir oyuncudur. Bu nedenle, nöroinflamasyonun nörodejenerasyondaki rolünü anlamak için alternatif in vivo nöroinflamasyon modellerinin araştırılması ve geliştirilmesi büyük ilgi görmektedir. Bu çalışmada, immün yanıtı ve nörotoksisiteyi indüklemek için lipopolisakkaritin (LPS) ventriküler mikroenjeksiyonunun aracılık ettiği larva zebra balığı nöroinflamasyon modeli geliştirilmiş ve doğrulanmıştır. Transgenik zebra balığı hatları elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP ve mpo: EGFP, floresan yoğunluk analizi ile entegre floresan canlı görüntüleme ile beyin nöron canlılığının gerçek zamanlı olarak ölçülmesi için kullanılmıştır. Zebra balığı larvalarının lokomotor davranışı, bir video izleme kaydedici kullanılarak otomatik olarak kaydedildi. Larva zebra balığı kafasında LPS-indüklenen immün yanıtı değerlendirmek için nitrik oksit (NO) içeriği ve interlökin-6 (IL-6), interlökin-1β (IL-1β) ve insan tümör nekroz faktör α (TNF-α) dahil olmak üzere inflamatuar sitokinlerin mRNA ekspresyon düzeyleri araştırıldı. LPS'nin beyin ventriküler enjeksiyonundan 24 saat sonra, zebra balığı larvalarında nöron kaybı ve hareket eksikliği gözlendi. Ek olarak, LPS'ye bağlı nöroinflamasyon, döllenme sonrası 6 gün (dpf) zebra balığı larvalarının başında NO salınımını ve IL-6, IL-1β ve TNF-α mRNA ekspresyonunu arttırdı ve zebra balığı beyninde nötrofillerin işe alınmasıyla sonuçlandı. Bu çalışmada, zebra balıklarının LPS ile 5 dpf'de 2.5-5 mg / mL konsantrasyonda enjeksiyonu, bu farmakolojik nöroinflamasyon testi için en uygun koşul olarak belirlenmiştir. Bu protokol, bir zebra balığı larvasında LPS aracılı nöroinflamasyonu ve nörotoksisiteyi indüklemek için LPS'nin beyin ventrikülü mikroenjeksiyonu için yeni, hızlı ve etkili bir metodoloji sunar; bu, nöroinflamasyonu incelemek için yararlıdır ve aynı zamanda yüksek verimli bir in vivo ilaç tarama testi olarak da kullanılabilir.

Burada açıklanan iş akışı, zebra balığı larvalarında LPS aracılı nöroinflamasyonu ve nörotoksisiteyi indüklemek için yeni, hızlı ve etkili bir metodoloji sunmaktadır. Bu tarif edilen protokolde, 5 dpf zebra balığı, bir mikroenjektör kullanılarak beyin ventriküllerine LPS (Şekil 1) enjekte edildi (Şekil 2A-C). Beyin ventrikül bölgesine başarılı enjeksiyon% 1 Evans mavi lekesi kullanılarak doğrulandı (Şekil 2D...

Bu protokol, ortaya çıkan nöroinflamatuar yanıtı ve nörotoksisiteyi incelemek için bir zebra balığı larva modelinde beyin ventriküler bölgesine lipopolisakkaritin mikroenjeksiyonunu göstermektedir.

Nöroinflamasyon ve Nörotoksisiteyi Değerlendirmek için Larva Zebra Balıklarına Lipopolisakkaritin Beyin Ventriküler Mikroenjeksiyonları

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Nöroinflamasyon çeşitli nörolojik bozukluklarda önemli bir oyuncudur. Bu nedenle, patolojik gelişim çalışmalarını kolaylaştırmak için alternatif in vivo nöroinflamasyon modellerinin araştırılması ve geliştirilmesi büyük ilgi görmektedir. Burada açıklanan teknik, in vivo görüntüleme yoluyla beyindeki patolojik değişiklikleri daha iyi anlamak ve olası anti-nöroinflamatuar ilaçları hızlı ve verimli bir şekilde değerlendirmek için mükemmel bir araçtır.Cam kılcal tüp çekme için beş adımlı protokolü izleyerek bir mikropipet çektirme makinesi kullanarak cam kılcal damarları çekerek enjeksiyona hazırlanın. Forseps kullanarak iğnenin ucunu uygun boyutta bir açıyla açın. Kabarcık olmadığından emin olmak için iğneyi 0,1 mililitre mineral yağ ile doldurun.Mikroenjeksiyon aparatının çelik iğnesinin vidalı kapağını çıkarın. Cam iğne deliğini çelik iğneyle hizalayın, ardından vidalı kapağı sıkın. Yüklü iğne mikroenjeksiyon aparatını bir mikromanipülatöre monte edin.Mikroenjeksiyon aparatının konumunu, mikromanipülatörün cihazı mikroskop altında esnek bir şekilde hareket ettirebilmesi için ayarlayın. Çelik iğnenin kılcal cam tüpe girmesini sağlamak için gereken uygun miktarda parafin yağı boşaltın. PBS veya lipopolisakkaritten oluşan enjeksiyon çözeltisini% 70 etanol ile sterilize edilmiş bir cam slayt üzerine bırakın ve mikroenjeksiyon aparatını, ucun sıvı damlasına yerleştirilmesi için ayarlayın.İğneye yaklaşık iki mikrolitre enjeksiyon çözeltisi yükleyin. Mikromanipülatörü, mikroenjeksiyon aparatının iğne ucu, yüksek büyütmeli larvalarla aynı görüş alanında olacak şekilde ayarlayın. Bir mikrodalga kullanarak çift damıtılmış sudamıtılmış% 2'lik bir agaroz çözeltisini eritin.Erimiş agarozu plastik bir kaba dökün. Anestezi uygulanan larvaları% 2 agaroz kaplı plastik bir kabın merkezine taşımak için plastik bir transfer pipeti kullanın. İğne erişimi için monte edilmiş larvaları beyin tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin.Zebra balıklarının beyin ventriküler yapısı görüş alanında açıkça gösterilecek şekilde mikroskopun büyütülmesini ayarlayın. İğneyi dikkatlice beyin tektumunun üzerine yerleştirin. Beyin bölgesini% 70 etanol ile temizleyin ve mikromanipülatörü kullanarak zebra balığı beyninin cildini iğne ucuyla yavaşça delin.Bir nanolitre 1X PBS veya farklı konsantrasyonlarda lipopolisakkarit çıkarmak için ayak pedalına basın. Larvaları enjeksiyondan hemen sonra temiz bir E3 ortamına aktarın. 24 saat sonra, mikroskobik görüntüleme, lokomotif davranışsal tahlil ve diğer göstergelerin belirlenmesi için larvaları toplayın.E3 ortamında% 1.5 düşük eriyikli agaroz çözeltisi hazırlayın ve berrak bir sıvı oluşturmak için bir mikrodalgada ısıtın. Larvaları bir cam slayta taşımak ve mümkün olduğunca fazla su çıkarmak için temiz bir plastik transfer pipeti kullanın. Larvalara% 1.5 düşük eriyikli agaroz damlası eklemek için plastik bir transfer pipeti kullanın.Larvaları yönlendirmek için bir mililitrelik bir şırınga iğnesi kullanın. Görüntülemeye başlamadan önce agaroz soğuyana ve katılaşana kadar bekleyin. Lipopolisakkarit beyin ventrikül enjeksiyonundan 24 saat sonra, gen ekspresyon belirteçlerini belirlemeye devam edin.Larvaların baş kısımlarını göz ve yumurta sarısı kesesi bölgeleri olmadan ayırmak için iki adet bir mililitrelik şırınga kullanın. Beş saniye boyunca dakikada 11.000 rotasyonda bir doku öğütücü kullanarak kafa kısmını 200 mikrolitre RNA ekstraksiyon reaktifi ile homojenize edin, ardından kloroform izopropanol yöntemini kullanarak RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin. RNA peletini beş ila 10 dakika boyunca hava ile kurutun, ardından RNA peletini çözmek için 30 mikrolitre RNAse içermeyen su ekleyin.Metin makalesinde açıklandığı gibi rastgele primerlerle ters transkriptaz kullanarak cDNA'yı sentezleyin. Ardından, hedef genlerin ekspresyonunu belirlemek için piyasada satılan bir RT-qPCR kiti kullanarak bir qPCR sisteminde gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin. Lipopolisakkarit beyin ventrikül enjeksiyonundan 24 saat sonra, zebra balığı larvalarını ayrı ayrı 96 kuyucuklu kare mikroplakanın kuyularına aktarın.Her bir oyuğa 300 mikrolitre E3 ortamı ekleyin ve daha sonra larvaları test plakasına alışmak için dört saat boyunca inkübe edin. Larva yüklü mikro plakayı zebra balığı izleme kutusuna aktarın. Işık kaynağını açın ve çevreye alışmak için larvaları test kutusunda 30 dakika boyunca inkübe edin.Otomatik bir video izleme sistemi kullanarak zebra balığı davranışını izleyin ve kaydedin. Bireysel zebra balığı larvaları için her biri beş dakikalık 12 seans kaydedin ve metin yazısında açıklandığı gibi toplam mesafeyi tanımlayın. 24 saat tedaviden sonra, mililitre başına bir ila beş miligram lipopolisakkarit ventriküler beyin enjeksiyonu, TgEtvmat2: GFP larva zebra balığının beyninde kontrol ve sahte gruplara kıyasla önemli miktarda RA nöron kaybına neden oldu.Transgenik çizgi elavl3: mCherry zebra balığı, mililitre lipopolisakkarit başına 2.5 ila beş miligram enjekte edildiğinde larva beyin nöronlarının floresan entegre yoğunluğunda önemli değişiklikler gösterirken, mililitre lipopolisakkarit enjeksiyonu başına bir miligram hiçbir etki göstermedi. Ayrıca, mililitre lipopolisakkarit başına beş miligram, hareket eksikliğine neden oldu ve 60 dakikalık bir izleme süresi boyunca zebra balığı hareketinin toplam mesafesini azalttı. Zebra balığı larvalarının başındaki pro-inflamatuar sitokinlerin azot oksit üretimi ve mRNA ekspresyonu, kontrol ve sahte gruplardaki ekspresyona kıyasla, mililitre lipopolisakkarit tedavisi başına 2.5 ila beş miligram üzerinde artmıştır.Mililitre lipopolisakkarit başına bir ila beş miligram enjeksiyonu, nötrofillerin larva zebra balığı beynine alındığını gösterdi ve Tgmpo: eGFP zebra balığı beyin bölgesindeki nötrofil sayısında önemli bir artışa neden oldu. İğnelerin açılma boyutu ve mikroenjeksiyon için enjeksiyon kuvveti miktarının yanı sıra zebra balıklarının gözlerinden ve vücudundan kafa ayrımı bu prosedür için çok önemlidir.

brain-ventricular-microinjections-lipopolysaccharide-into-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Zebra balığı hızla gelişmesi, küçük boyutu ve şeffaflık enfeksiyon doğal immün kontrolü çalışması için çok büyük avantajları...

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Bu video, zebra balığı larvalarında mantar enfeksiyonunu ölçmek için bir yöntem göstermektedir. Mantar sporları larva arka beyin ventrikülüne mikroenjekte edilir ve larvalar enfeksiyon gelişimine izin vermek için kuluçkaya yatırılır. Enfekte larvalar belirli aralıklarla toplanır ve enfeksiyon ilerlemesi, koloni oluşturan birimlerin numaralandırılmasıyla değerlendirilir.

Zebra Balığı Larvalarında Mantar Enfeksiyonunu Ölçmek İçin Bir Teknik

Video, zebra balığı larvalarında floresan olarak etiketlenmiş mantar patojen enfeksiyonunu gözlemlemek için bir zebra balığı yaralama ve tuzak cihazı tekniğini göstermektedir. İlk enfeksiyon makrofajları çeker ve enfeksiyon devam ettikçe enjeksiyon bölgesinde nötrofil alımı ilerler.

Mantar Patojeni ile Enfekte Zebra Balığı Larvalarını Görselleştirmek için Bir zWEDGI Tekniği

Video, nöroinflamasyonu indüklemek için zebra balığı larvalarının beyinlerine lipopolisakkaritlerin (LPS) mikroenjeksiyonunu göstermektedir. Larvalar agaroz kaplı bir tabağa yerleştirilir, iğne beyin ventriküllerine yerleştirilir ve LPS enjekte edilir. Enjekte edilen LPS, nöroinflamasyona yol açan bir bağışıklık tepkisini tetikler.

Lipopolisakkarit Enjeksiyonu ile Zebra Balığı Larvalarında Nöroinflamasyonun İndüklenmesi

Burada, zebra balığı otik vezikülünde lokalize bir bakteriyel enfeksiyonun oluşturulması ve görüntülenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

Bu iletişim kuralı sentezi, karakterizasyonu ve monomeric amiloid-β42 peptidler amiloid toksisite histolojik analizler ve tespiti takip bir Alzheimer hastalığı modeli kurmak için yetişkin Zebra balığı üretme için enjeksiyon açıklar toplamalardan.

Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme

Biz nöronlar, makrofajlar ve microglia larva Zebra balığı beyin fizyolojik ve patolojik şartlar altında gelen izole etmek için bir protokol mevcut. Yalıtım, RNA gen ifade profillerini analiz etmek için bu hücrelerden elde edilir. Bu iletişim kuralı için yüksek kaliteli RNA koleksiyonu aşağı akım analizi qPCR ve transcriptomics gibi gerçekleştirmek için izin verir.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

Burada insan intrakerebral kanama (Ich) bağlamında, zebra balığı larvalarda beyinde kanama sonrasında beyin yaralanması, lokomotor açıkları ve nöroinflamasyonu ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Hemorajik Inme patolojik sonuçlarını Incelemek için zebrafish larva kullanma

Burada, makrofaj-soy hücrelerine ilaç dağıtımını hedeflemek amacıyla ilaç yüklü lipozomların ve bunların mikroenjeksiyonunun larva zebra balığına sentezini anlatıyoruz.

Uyuşturucu Yüklü Lipozomenjekte ederek Larva Zebra balığı Makrofajlarına Yönelik İlaçların Hedeflenmesi

Genetik olarak hassas organizmalarda inflamatuar sinyallerin nörogelişimi nasıl etkilediğini modellemek için, zebrafish larvalarının Cuvier (ortak kardinal damar) kanalına IL-6 mikroenjeksiyonu için bir protokol sunuyoruz; bu protokol iltihabın kontrollü indüklenmesini ve tüberoz skleroz kompleksi (TSC) bağlamında gelişimsel etkisinin değerlendirilmesini mümkün kılmaktadır.

TSC zebrafish larvalarının kanına interleukin-6'nın mikroenjeksiyonu ve nöropsikiyatrik bozukluk benzeri davranışların incelenmesi

Öğrenin, Danio rerio larvalarına beyin ventrikülüne lipopolisakkarit mikroenjeksiyonu yaparak nöroinflamasyon ve nörotoksisiteyi nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, anti-nöroinflamatuar ilaçların hızlı ve etkili bir şekilde test edilmesini sağlar.

Nöroinflamasyon ve Nörotoksisiteyi Değerlendirmek için Larva Zebra Balıklarına Lipopolisakkaritin Beyin Ventriküler Mikroenjeksiyonları (Video) | JoVE Journal

Nöroinflamasyon ve Nörotoksisiteyi Değerlendirmek için Larva Zebra Balıklarına Lipopolisakkaritin Beyin Ventriküler Mikroenjeksiyonları

Daha fazla video keşfet