Name: İnsan Hücrelerinde HSV-1 Enfeksiyonu Sonrası ZBP1e Bağlı RIPK3 ve MLKLnin İmmünofloresan Boyama İçin Timamid Sinyal Amplifikasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Keşfedin, HSV-1 enfeksiyonu sonrası ZBP1'e bağlı necroptoz sırasında fosforile RIPK3 ve MLKL'nin tiramid sinyal amplifikasyonu ile immünofloresan boyamasını. Bu yöntem, hassas ve tekrarlanabilir görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VIB Bioimaging Core'a eğitim, destek ve cihaz parkına erişim için teşekkür ederiz. J.N., Araştırma Vakfı Flanders'tan (FWO) doktora bursu ile desteklenmektedir. J.M. grubundaki araştırmalar, bir Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), Araştırma Vakfı Flanders'tan (FWO) bir junior research grant (G031022N), bir CRIG genç araştırmacı kavram kanıtı hibesi ve Ghent Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. P.V. grubundaki araştırmalar EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO kıdemli araştırma hibeleri (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Kansere Karşı Vakıf (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG ve GIGG konsorsiyumları ve VIB tarafından desteklenmiştir.

1. Biyotinillenmiş tiramid hazırlanması
<ol><li>Biotin-tiramidden başlayarak biyotinile tiramid hazırlayın. 10 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için, 1 mL DMSO içinde 3.6 mg biyotin-tiramid çözün. Kaliteyi korumak için çözünmüş ürünü -20 ° C'de alikotlarda saklayın.</li>
</ol>2. HT-29 hücrelerinin kültürde tutulması
NOT: ZBP1-eksprese HT-29, insan ZBP1'i kodlayan bir lentivektör27 ile transdüksiyonla üretilmiştir.
<ol><li>ZBP1 eksprese eden HT-29 hücrelerini McCoy'un 5A ortamında L-glutamin, sodyum-piruvat ve% 10 fetal sığır serumu (bundan böyle tam ortam olarak anılacaktır) ile desteklenmiş olarak tutun ve% 5 karbondioksit ile 37 ° C'de bir inkübatörde tutun. İdeal olarak, düşük bir geçiş sayısına sahip hücreler kullanın (10'dan az). Deney başlamadan önce çözülme döngüsünden sonra hücreleri en az 5 gün iyileşmeye bırakın.</li>
	<li>Hücreleri kültür şişesinden ayırmak için, ortamı çıkarın ve hücreleri 5 mL PBS (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış) ile yıkayın. Daha sonra, hücrelere uygun miktarda tripsin / EDTA (sırasıyla% 0.05 tripsin ve% 0.032 EDTA, 37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ekleyin (T75 şişesi için 2 mL, T175 şişe için 3 mL).</li>
	<li>Tripsin/EDTA içeren hücreleri 37 °C'de %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde 10 dakikaya kadar inkübe edin. Daha sonra, şişeye dokunun ve hücrelerin 4x-20x objektif büyütmeli bir mikroskop kullanarak şişeden ayrılıp ayrılmadığını görsel olarak kontrol edin.</li>
	<li>Hücreler tamamen ayrılmamışsa, 37 ° C'de 5 dakika daha inkübe edin. Hücreler ayrıldığında, şişeye 6 mL tam ortam ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpte toplayın. Canlılığı değerlendirmek için tripan mavisi bir leke kullanarak hücreleri sayın; 1:5 seyreltme önerilir. Sadece hücrelerin yaşayabilirliği% 90'ı aşarsa deneye devam edin.</li>
</ol>3. Deneye başlamak, tohumlama ve hücrelerin uyarılması
<ol><li>Tohum 90.000 ZBP1-eksprese HT-29 hücreleri tam ortamda, 1 cm² yüzey alanı kuyu plakasında üst düzey mikroskopiye izin verir. Kuyu başına 200 μL'lik bir uç hacim kullanın.</li>
	<li>Hücreleri gece boyunca 37 ° C'de% 5 karbondioksit ile inkübe edin. Boyama kontrolleri için bazı ekstra kuyucukların tohumlanması gerektiğini göz önünde bulundurun, bu da adım 5.6'da daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.</li>
	<li>Hücreler% 70 -% 80 akıcılığa ulaştığında, hücrelere nekroptoza neden olan bir uyaran ekleyin. Burada, hücreler HSV-1 ICP6mutRHIM (plak oluşturan birimler (pfu) olarak tanımlanan 5'in enfeksiyon çokluğu [MOI], hücre sayısına bölünür; pfu, Vero hücreleri üzerinde bir plak testi kullanılarak ölçüldü) 6 saat, 8 saat veya 10 saat boyunca enfekte edildi.</li>
	<li>Nekrotoz indüksiyonu için pozitif bir kontrol olarak, hücreleri 30 ng / mL TNF, 20 μM pan-kaspaz inhibitörü zVAD-fmk ve SMAC mimetik BV6'nın 5 μM'sini içeren nekroptozise neden olan bir kokteyl ile 4 saat boyunca uyarın.</li>
	<li>P-RIPK3 (S227) boyaması için negatif bir kontrol olarak, RIPK3 kinaz aktivitesini inhibe etmek ve S227'nin otofosforilasyonunu önlemek için GSK'840 (1 μM) ekleyin. İdeal olarak, inhibitörü tedavi edilmemiş bir durumda ve nekrotoz stimülasyonundan sonra ekleyin. İnhibitör, viral enfeksiyonla aynı anda eklenebilir.</li>
	<li>Stimülasyonları tam ortamda, önceden 37 ° C'ye ısıtılmış olarak hazırlayın. Tüm stimülasyonlar için kuyu başına 200 μL'lik bir uç hacim kullanın.</li>
</ol>4. Hücrelerin sabitlenmesi
<ol><li>Ortamı çıkarın ve hücreleri 200 μL 1x PBS ile yıkayın. Daha sonra, hücrelere 150 μL% 4 PFA (oda sıcaklığında zaten dengelenmiş) ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. NOT: Kolayca ayrılan hücreler kullanıyorsanız, hücrelerin sabitlenmesi aşağıdaki gibi optimize edilebilir. Kuyudan 100 μL ortam çıkarın, böylece plakada 100 μL'lik bir hacim kalır. Hücrelere 100 μL% 4 PFA ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, ortamı / fiksatifi kuyucuklardan çıkarın ve% 4 PFA'nın 150 μL'si ile değiştirin. Hücrelerin tamamen sabitlenmesini sağlamak için hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika daha inkübe edin.</li>
	<li>Fiksasyondan sonra,% 4 PFA'yı çıkarın ve hücreleri 200 μL 1x PBS ile 3x yıkayın. Numuneler, bir sonraki işleme kadar gece boyunca 4 °C'de 1x PBS'nin üzerinde (>200 μL) saklanabilir.</li>
</ol>5. Permeabilizasyon ve primer boyama
<ol><li>PBS'yi çıkarın ve 100 μL geçirgenlik tamponu ekleyin (PBS'de %0,5 Triton X-100). Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Geçirgenlik tamponunu çıkarın ve daha sonra kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile yıkayın (PBS'de% 0.1 Triton X-100). Görüntüleme odasını yıkama tamponu ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında (dakikada 20-30 sallanma hareketi) inkübe edin.</li>
	<li>Birincil antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için, 100 μL bloke edici ortam ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. Alternatif olarak, bu engelleme adımı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de% 3 BSA,% 0.1 Triton-X-100 ile bloke edilerek değiştirilebilir.</li>
	<li>Kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile 3x yıkayın (PBS'de %0,1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Yıkama tamponunu çıkardıktan sonra, birincil antikorları görüntüleme odasına ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Kuyuyu örtmek için 100 μL'lik bir uç hacim kullanın. 4°C'de gece boyunca inkübasyon sırasında, görüntüleme odasını eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısına yerleştirmeyin. NOT: Anti p-MLKL (S358; seyreltme: 1:200) ve anti-p-RIPK3 (S227; seyreltme: 1:200) tavşanı konakçı bir tür olarak paylaşır ve bu nedenle tek bir kuyuda birleştirilmemelidir. Viral enfeksiyonu izlemek için, birincil bir antikoru tercih edilen bir viral proteine karşı p-MLKL (S358) veya p-RIPK3 (S227) ile birleştirin. Burada, hücrelere HSV-1 enfeksiyonu ve ardından ICP0 boyama (seyreltme: 1:50, konakçı tür: fare) bulaştı.</li>
	<li>Bu noktada gerekli boyama kontrollerini göz önünde bulundurun. Maskeleme eşiğini ayarlamak üzere TSA amplifikasyon adımının potansiyel arka planını görselleştirmek için her zaman birincil antikor yok durumu ekleyin (bkz. adım 9). NOT: Bir ko-boyama protokolü durumunda (örneğin, p-MLKL [S358] veya p-RIPK3 [S227] 'yi viral bir proteine karşı bir antikor ile birleştirmek) tek lekeler de kullanın. Tek lekelerin kullanılması, diğer görüntüleme kanallarındaki potansiyel kanama sinyalini düzeltmek için önemlidir.</li>
</ol>6. Tiramit sinyal amplifikasyonu (TSA)
<ol><li>Birincil antikor karışımını çıkarın ve kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile 3 kat yıkayın (PBS'de %0,1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Yıkama tamponunu çıkarın ve çoğaltılması gereken birincil antikor türlerini tanıyan 100 μL HRP etiketli ikincil antikor ekleyin. p-RIPK3 (S227) veya p-MLKL (S358) sinyalini yükseltmek için, 100 μL anti-tavşan-HRP ekleyin ve yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. NOT: Yalnızca p-MLKL (S358) veya p-RIPK3 (S227) güçlendirilecektir. Bir viral proteinin boyanması, standart bir dolaylı boyama yöntemi kullanılarak görselleştirilecektir.</li>
	<li>Daha sonra, kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile 3 kat yıkayın (PBS'de% 0,1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Sonraki adımlarda, biyotinile tiramidi mikroskobik plakaya ekleyin. İkincil antikorlara bağlı HRP grubunu kullanarak, enzimatik reaksiyon birincil hedefe yakın bir yerde tiramid radikallerinin oluşumunu tetikleyecektir (burada, p-MLKL [S358] veya p-RIPK3 [S227]).</li>
	<li>HRP'nin enzimatik aktivitesini aktive etmek için, biyotinile tiramid ile birlikte oksitleyici bir substrat ekleyin. Bunu başarmak için, TSA tamponunu (0,1 M borik asit [pH 8,5]) 0,03 M H2 O 2iledestekleyin; spesifik olarak, 5 mL TSA tamponu alın ve% 30 H2 O2'den5 μL ekleyin.</li>
	<li>Şimdi, biyotin-tiramidinH2O2 takviyeli TSA tamponunda 1:1.000 ila 1:20.000 arasında seyreltin. NOT: Biotin-tiramidin seyreltme faktörünün parti başına optimize edilmesi gerekir.</li>
	<li>Yıkama tamponunu kuyucuklardan çıkarın ve seyreltilmiş biyotin-tiramid kuyucuklara 100 μL'lik bir son hacme kadar ekleyin.</li>
	<li>Daha sonra, kuyucukları 100 μL yıkama tamponu ile 3x yıkayın (PBS'de% 0.1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
</ol>7. Floroforlar
NOT: Birincil antikorun sinyali bir biyotin grubuna dönüştürüldüğünden, p-MLKL (S358) ve p-RIPK3 (S227), bir florofora bağlanmış streptavidin kullanılarak görselleştirilir (florofor 568, seyreltme: 1:500). Ek olarak, çekirdekler DAPI (5 μg / mL) ile boyanır. Boyama protokolüne bir viral protein dahil edilmişse, birincil antikorunuzun konakçı türlerine karşı uygun bir floresan etiketli ikincil antikor ekleyin. Temsili sonuçlarda, bir fare anti-ICP0 kullanıldı. Sekonder bir antikor olarak keçi anti-faresi florofor 633 (seyreltme: 1:1.000) ile birleşmiştir.
<ol><li>Boyama karışımını yukarıda belirtilen antikorları ve lekeleri içeren yıkama tamponunda (PBS'de% 0.1 Triton X-100) yapın. Yıkama tamponunu çıkarın, 100 μL boyama karışımı ekleyin ve yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. Bu adımdan itibaren görüntüleme odasını ışıktan koruyun.</li>
	<li>Daha sonra, kuyucukları 2x yıkama tamponu ile yıkayın (PBS'de% 0.1 Triton X-100). Yıkama adımlarını yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Son olarak, kuyucukları 1x PBS ile 2x durulayın. Numuneleri görüntülemeye kadar 1x PBS'den fazla (> 200 μL) saklayın. Alternatif olarak, lekelenmeyi korumak için numuneleri montaj ortamına batırın. Görüntüleme odası artık konfokal mikroskopta görselleştirilmeye hazırdır.</li>
</ol>8. Konfokal mikroskop kullanarak görüntüleme
<ol><li>Görüntülemeden en az 10 dakika önce konfokal mikroskop ve lazerleri açın.</li>
	<li>Hassasiyet için bir daldırma hedefi kullanın. Tercihen, 40x veya 63x objektif büyütme kullanın. Görüntülemeden önce, daldırma hedeflerini uygun pamuk topları kullanarak lens temizleyici ile temizleyin. Kirli hedefler (örneğin, toz nedeniyle) daha düşük kaliteli görüntülere neden olabilir.</li>
	<li>Görüntüleme odasının altına fazla miktarda yağ koyun. Ek olarak, seçim hedefine bir damla yağ ekleyin.</li>
	<li>Görüntüleme odasını mikroskop üzerine koyun. DAPI boyama veya parlak alan görüntüleme kullanarak odak alanını bulun. Gerekirse, daldırma yağının düzgün yayılmasını sağlamak için görüntüleme odasının etrafında hareket edin.</li>
	<li>Mikroskopta gerekli görüntüleme izlerini ayarlayın. Mikroskopa bağlı olarak, aşağıdaki adımlar değişebilir (Tablo 1). NOT: Görüntüleme izlerini kurarken, izleri nükleer lekelenmenin en son ölçüleceği şekilde programlayın. 405 nm lazer, fotobeyazlatmaya ve dolayısıyla tüm kanallarda spesifik sinyal kaybına katkıda bulunabilir.</li>
	<li>Tam bir hücreyi p-RIPK3 (S227) veya p-MLKL (S358) varlığına göre analiz etmek için, hücrenin yüksekliğini kapsayan z-yığınlarını ölçün. Burada, z-yığınları her 0.16 μm'de bir 40 dilimden yapıldı ve bu da 6.22 μm'lik bir aralıkla sonuçlandı.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>İz</td>
			<td>Lazer</td>
			<td>Kiriş ayırıcı</td>
			<td>Filtre</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)</td>
			<td rowspan="2">561</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 570-620 + LP645</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS SP615</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Viral Gen: ICP0</td>
			<td rowspan="2">633</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + LP605</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS LP570</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Çekirdek: DAPI</td>
			<td rowspan="2">405</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + BP 495-550</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Hücre görselleştirme için görüntüleme izleri.
9. Veri analizi ve nicelleştirme
<ol><li>Mikroskobik görüntüleri yazılıma yükleyin. Z-yığınının tüm bilgilerini 2B görüntüde görselleştirmek için genişletilmiş odağı kullanın.</li>
	<li>Ardından, aşağıdaki bilgileri çıkarmak için analiz protokolünü programlayın: görüntü başına hücre sayısı, p-RIPK3 (S227) + veya p-MLKL (S358) + boyamasını gösteren voksellerin toplamı. Voksel, bir pikselin üç boyutlu eşdeğeri olarak tanımlanan üç boyutlu bir hacmi temsil eder.</li>
	<li>Görüntü başına hücre sayısını ölçmek için çekirdeği bölümlere ayırın. Segmentasyon sonuçlarındaki gürültüyü azaltmak için, segmentasyona bir boyut sınırlaması ekleyin (>100 μm³). Bölümlenmiş çekirdek sayısı, görüntüdeki hücre sayısını temsil eder.</li>
	<li>p-RIPK3 (S227)+ veya p-MLKL (S358)+ voksel miktarını ölçmek için eşik tabanlı bir segmentasyon programlayın. Eşiği, birincil antikor yok (NP) görüntülerinde sinyal alınmayacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Tedavi edilmemiş sahte durumdan görüntüleri kullanarak eşiği daha da uyarlayın. Nekrotoz stimülasyonu nedeniyle sinyal artışının hassas bir şekilde algılanmasını sağlamak için, daha yüksek bir eşik ayarlayarak sahte koşullarda p-RIPK3 (S227)+ veya p-MLKL (S358)+ voksellerin alınmasını sınırlayın. Programlanmış analiz protokolünü her zaman sahte durumdan ve nekroptoza neden olan viral enfeksiyondan birkaç görüntüde kontrol edin.</li>
	<li>Analizi tüm görüntü kümelerinde çalıştırın. Voksel nicelemesini ve çekirdek segmentasyonunu elektronik tablo yazılımında daha fazla işlem için .txt bir dosyada dışa aktarın.</li>
	<li>Görüntü adını, çekirdek miktarını ve algılanan voksellerin toplamını gösteren verilerin bir pivot tablosunu yapın.</li>
	<li>Ardından, pozitif voksellerin toplamını görüntüdeki hücrelerin sayısına bölün. Bu, hücre başına pozitif voksellerin göreceli bir değeri ile sonuçlanır. Katlama artışını görselleştirmek için, hücre başına p-RIPK3 (S227)+ veya p-MLKL (S358)+ voksellerin göreli değerini, işlenmemiş durumun medyanına (alay) bölün.</li>
</ol>

<ol><li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li>
<li>Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+necroptotic+cell+death+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structural basis of necroptotic cell death signaling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).</li>
<li>Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis%3A+The+Trojan+horse+in+cell+autonomous+antiviral+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense.</a> Virology. 479-480, 160-166 (2015).</li>
<li>Nailwal, H., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+in+anti-viral+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Necroptosis in anti-viral inflammation.</a> Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).</li>
<li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RIPK3+maintains+MLKL+in+an+inactive+conformation+prior+to+cell+death+by+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6783(2021).</li>
<li>Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location%2C+location%2C+location%3A+A+compartmentalized+view+of+TNF-induced+necroptotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signalling%22%5BJournal%5D)">Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling.</a> Science Signalling. 14 (668), (2021).</li>
<li>Koehler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+E3+prevents+sensing+of+Z-RNA+to+block+ZBP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis.</a> Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).</li>
<li>Balachandran, S., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Z-RNA+triggers+ZBP1-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death.</a> Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).</li>
<li>Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZBP1%3A+Innate+sensor+regulating+cell+death+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation.</a> Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).</li>
<li>Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+sensors+and+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid sensors and programmed cell death.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).</li>
<li>Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+manipulation+of+host+cell+necroptosis+and+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis.</a> Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+suppresses+necroptosis+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells.</a> Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+1+%28HSV-1%29+and+HSV-2+mediate+species-specific+modulations+of+programmed+necrosis+through+the+viral+ribonucleotide+reductase+large+subunit+R1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1.</a> Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP1%2FRIP3+binding+to+HSV-1+ICP6+initiates+necroptosis+to+restrict+virus+propagation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice.</a> Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-independent+contribution+of+ZBP1%2FDAI%2FDLM-1-triggered+necroptosis+in+host+defense+against+HSV1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1.</a> Cell Death & Disease. 9 (8), 816(2018).</li>
<li>Devos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+endogenous+nucleic+acids+by+ZBP1+induces+keratinocyte+necroptosis+and+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913(2020).</li>
<li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-nucleic-acid+sensing+triggers+ZBP1-dependent+necroptosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation.</a> Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).</li>
<li>de Reuver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAR1+prevents+autoinflammation+by+suppressing+spontaneous+ZBP1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation.</a> Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).</li>
<li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAR1+averts+fatal+type+I+interferon+induction+by+ZBP1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1.</a> Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).</li>
<li>Hubbard, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAR1+mutation+causes+ZBP1-dependent+immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology.</a> Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAR1+masks+the+cancer+immunotherapeutic+promise+of+ZBP1-driven+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis.</a> Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).</li>
<li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotin+amplification+of+biotin+and+horseradish+peroxidase+signals+in+histochemical+stains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).</li>
<li>Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyramide+signal+amplification+for+DNA+and+mRNA+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).</li>
<li>Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyramide+signal+amplification+for+analysis+of+kinase+activity+by+intracellular+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).</li>
<li>Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyramide+signal+amplification+mass+spectrometry+%28TSA-MS%29+ratio+identifies+nuclear+speckle+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207(2020).</li>
<li>Samson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+for+imaging+RIPK1%2C+RIPK3%2C+and+MLKL+in+mouse+and+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).</li>
<li>De Groote, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+new+gateway-compatible+inducible+lentiviral+vector+platform+allowing+easy+derivation+of+co-transduced+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells.</a> Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).</li>
<li>Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+1+ICP6+impedes+TNF+receptor+1-induced+necrosome+assembly+during+compartmentalization+to+detergent-resistant+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).</li>
<li>Mandal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP3+induces+apoptosis+independent+of+pronecrotic+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Moleular+Cell%22%5BJournal%5D)">RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity.</a> Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+Z-RNAs+induce+ZBP1-mediated+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis.</a> Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).</li>
<li>Garnish, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+interconversion+of+MLKL+and+disengagement+from+RIPK3+precede+cell+death+by+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 2211(2021).</li>
<li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedural+requirements+and+recommendations+for+multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+assays+to+support+translational+oncology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies.</a> Cancers. 12 (2), 255(2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu immünofloresan boyama protokolü, RIPK3 ve MLKL26'nın fosforilasyonu da dahil olmak üzere tespit edilmesi zor olan insan nekroptotik sinyal yolunun sinyal olaylarına duyarlılığı artırmak için tiramid sinyal amplifikasyonunun (TSA) kullanımını açıklar. Bir TSA adımının dahil edilmesi, p-RIPK3 (S227) ve p-MLKL (S358) algılama eşiğini önemli ölçüde iyileştirir ve p-MLKL (S358) gerilmesinin hassasiyetini artırır. TSA, alaycı muamele görmüş numunelerde zaten mevcut olan bir p-RIPK3 (S227) sinyali ort...

Reseptör etkileşen serin/treonin protein kinaz 3 (RIPK3) ve karışık soy kinaz etki alanı benzeri (MLKL), nekrototik hücre ölümünün merkezi düzenleyicileridir 1,2. Nekrotoz, antiviral bağışıklık ve otoinflamasyonda rol oynayan düzenlenmiş hücre ölümünün litik ve enflamatuar bir şeklidir. Virüs bulaşmış hücrelerin nekroptozu derhal virüs replikasyonunu durdurur. Nekrotoz indüksiyonunu takiben hücre lizisi, antiviral bağışıklığı uyaran hasarla ilişkili moleküler paternleri de serbest bırakır 3,4. Nekrotoz, üç yukarı akış aktive edici molekülden biriyle RIP homotipik etkileşim motifi (RHIM) aracılı etkileşimleri takiben RIPK3'ün aktivasyonu ile başlatılır: RIPK1 (TNF reseptörü 1 [TNFR1] katılımı üzerine), TIR etki alanı içeren adaptörü indükleyen interferon-β (TRIF; Toll benzeri reseptör 3 ve 4 etkileşimi üzerine) veya antiviral nükleik asit sensörü Z-DNA bağlayıcı protein 1 (ZBP1)1,2 . Nekrotoz sinyalizasyonu, RIPK3'ün otofosforilasyonu ile başlayan bir dizi fosforilasyon olayından geçer. İnsan RIPK3'ün kinaz alanı içindeki serin (S) 227'de otofosforilasyonu, MLKL ile etkileşimi sağlayarak nekroptoz için bir ön koşuldur ve yaygın olarak insan RIPK3 aktivasyonu ve nekroptotik hücre ölümü için biyokimyasal bir belirteç olarak kullanılır 1,5. Aktive edildikten sonra, RIPK3, MLKL'nin aktivasyon döngüsünü treonin (T) 357 ve S3581'de fosforile eder. Bu, MLKL konformasyonunda bir değişikliğe neden olur ve N-terminal dört sarmal demet alanının maruz kalmasına neden olur. MLKL daha sonra oligomerize olur ve hücre zarına gider, burada lipit çift katmanına maruz kalan dört sarmal demetinin yerleştirilmesiyle bir gözenek oluşturur ve sonunda hücre ölümüne yol açar 2,6.
ZBP1, Z-konformasyonunda (Z-RNA) çift sarmallı RNA da dahil olmak üzere solak Z-formu nükleik asitleri tanıyan bir antiviral nükleik asit sensörüdür. Z-RNA bağlanması, ZBP1'in N-terminusunda konumlandırılmış iki Zα-alanı aracılığıyla gerçekleşir. RNA ve DNA virüs enfeksiyonu sırasında biriken Z-RNA'nın ZBP1 7,8'i doğrudan etkilediği düşünülmektedir. Aktif ZBP1, merkezi RHIM'leri aracılığıyla RIPK3'ü işe alır ve nekroptoz 9,10 dahil olmak üzere düzenlenmiş hücre ölümünü indükler. Virüsler, ZBP1 ile indüklenen konakçı hücre nekroptozuna karşı koymak için çok sayıda kaçış mekanizması benimsemiştir11. Örneğin, ICP6 olarak bilinen ve UL39 tarafından kodlanan herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) ribonükleotid redüktaz alt birimi 1, RHIM'i insan hücrelerinde ZBP1 aracılı RIPK3 aktivasyonuna müdahale eden N-terminusunda barındırır12,13,14,15. ZBP1 sadece viral replikasyonu kısıtlamakla kalmaz, aynı zamanda fare çalışmaları ZBP1 aktivasyonunun enflamatuar hastalıklara neden olduğunu ve kanser bağışıklığını uyardığını göstermiştir 16,17,18,19,20,21. Bu nedenle, insan hücrelerinde ZBP1 kaynaklı nekroptoz sırasında meydana gelen sinyal olaylarını tespit eden protokoller, ZBP1'in bu süreçlerdeki rolünü değerlendirmek için değerlidir.
Katalizörlü muhabir birikimi (CARD) olarak da adlandırılan tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA), antikor bazlı immünotahlillerde algılama sınırını ve sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için geliştirilmiştir. TSA sırasında, ilgilenilen antijeni tespit etmek için herhangi bir primer antikor kullanılabilir. Yaban turpu peroksidaz (HRP), ikincil bir antikorla birleştiğinde, hidrojen peroksit varlığında biyotinile tiramid radikallerinin lokal birikimini katalize eder. Bu aktive biyotin-tiramid radikalleri daha sonra kovalent bağlar oluşturmak için proksimal tirozin kalıntıları ile reaksiyona girer. Potansiyel tiramid-biyotin substratları antijenin kendisini, birincil ve ikincil antikorları ve komşu proteinleri içerir. Böylece, TSA tahlilin hassasiyetini önemli ölçüde artırırken, mekansal çözünürlüğünün bir kısmı kaybolur. Son bir adımda, biyotin molekülleri floresan olarak etiketlenmiş streptavidin kullanılarak tespit edilir. HRP reaksiyonu, ilgilenilen antijenin üzerinde veya yakınında birçok tiramid-biyotin molekülü biriktirir. Bu, streptavidin-florokrom bağlanma bölgelerinin sayısını büyük ölçüde arttırır, böylece tahlilin hassasiyetini büyük ölçüde arttırır (Şekil 1). Alternatif olarak, tiramid doğrudan bir florokroma bağlanabilir ve streptavidin-kuplajlı floroforlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Protein immünohistokimyası ve DNA / RNA in situ hibridizasyonu, TSA'nın sinyal yoğunluklarını iyileştirmek için kullanıldığı ilk yöntemler arasındaydı22,23. Daha yakın zamanlarda, TSA hücre içi akış sitometrisi24 ve kütle spektrometrisi25 ile birleştirilmiştir.
Burada, immünofloresan mikroskobu kullanılarak HSV-1 enfeksiyonu ile ZBP1'in aktivasyonu üzerine serin 227 fosforile insan RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) ve fosforile insan MLKL'sini (p-MLKL [S358]) tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan ZBP1'i kararlı bir şekilde eksprese etmek için dönüştürülen nekropotoza duyarlı HT-29 insan kolorektal adenokarsinom hücre hattı kullanıyoruz. Bu hücreler, viral RHIM (VQCG) içindeki dört çekirdek amino asidin alaninler (AAAA) ile değiştirildiği mutant bir ICP6 proteinini (HSV-1 ICP6mutRHIM) eksprese eden bir HSV-1 suşu ile enfekte oldu, böylece ICP6, ZBP1 aracılı nekroptoz 13,14,15'i bloke edemez hale getirdi. İmmün boyama26'da p-RIPK3 ve p-MLKL'ye karşı halihazırda piyasada bulunan antikorların düşük sinyal-gürültü oranı sorununun üstesinden gelmek için, insan p-RIPK3'ün (S227) sağlam bir şekilde algılanmasıyla sonuçlanan ve insan p-MLKL'nin (S358) algılama hassasiyetini bir büyüklük sırasına göre artıran bir tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) adımı (Şekil 1) gerçekleştiriyoruz.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tavşan önleyici HRP</td><td>Agilent Technologies Belçika</td><td>K4002</td><td>Envision+ Sistemi-HRP Etiketli Polimer anti-tavşan</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare DyLight 633</td><td>Thermofisher</td><td>35513</td><td>Sekundary antikor</td></tr><tr><td>HSV-1 ICP0</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53070</td><td>Fare anti-ICP0 (HSV-1) antikoru</td></tr><tr><td>IAV-PR8 fare serumu</td><td>Ev üretiminde</td><td>xx</td><td>Fare anti-IAV-PR8 poliklonal antikoru</td></tr><tr><td>pMLKL</td><td>Abcam</td><td>ab187091</td><td>Tavşan anti-MLKL-fosfo S358 antikoru</td></tr><tr><td>pRIPK3</td><td>Abcam</td><td>ab209384</td><td>Tavşan anti-RIPK3-fosfo S227 antikoru</td></tr><tr><td><güçlü>Floroforlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>D21490</td><td>Hücrelerin çekirdeğini görselleştirmek için</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ile birleştirilmiş Streptavidin</td><td>Thermofisher</td><td>S11226</td><td>Biyotin moleküllerini görselleştirmek için</td></tr><tr><td><güçlü>bileşikler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% H2<>O2</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>HRP aktivitesi için gerekli oksitleyici substrat</td></tr><tr><td>%4 PFA</td><td>SANBIO</td><td>AR1068</td><td>Hücreleri sabitlemek/çapraz bağlamak için</td></tr><tr><td>Biotinyl-tyramide</td><td>R& D Systems</td><td>6241</td><td>Sinyali yükseltmek için, HRP substrat</td></tr><tr><td>BV-6</td><td>Selleckchem</td><td>S7597</td><td>BV6 IAP İnhibitörü</td></tr> <tr><td>ve nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Hücre kültürü için: hücreleri ayırmak için</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>8.0 g/L NaCl</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0.4 g/L EDTA'nın disodyum tuzu</td></tr><tr><td>EDTA %0.04</td> <td>Ev içi formülasyon</td><td></td><td>1.1 g/L Na2HPO4</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,2 g/L NaH2PO4</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,2 g/L KCl</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0.2 g/L Glikoz</td></tr><tr><td>Fetal Sığır serumu</td><td>TICO</td><td>FBS EU XXX</td><td>Hücre kültürü için, hücre kültürünün sürdürülmesi; Lot numarası: 90439</td></tr><tr><td>GSK'840</td><td>Aobious</td><td>AOB0917</td><td>RIPK3 kinaz inhibitörü</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Hücre kültürü için, hücre kültürünün bakımı</td></tr><tr><td>MAXblock</td><td>Active Motif</td><td>15252</td><td>Engelleme çözümü</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>10444402</tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>Hücre kültürü için, hücre kültürünün TNF</td></tr><tr><td>-&alfa bakımı;</td><td>Ev</td> <td>üretiminde-Sinyal</td> <td>molekülü, BV6 ve zVAD ile kombinasyon halinde hücre ölümünü tetikleyebilen</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Hücrelere nüfuz etmek için</td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Merck</td><td>11732</td><td>Hücre sayımı için, %0,1'de canlı/ölü belirteç olarak kullanılır</td></tr> <tr><td>Tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4424</td><td>Hücre kültürü için: hücreleri ayırmak için</td></tr><tr><td>zVAD</td><td>Bachem</td><td>BACE4026865.0005</td><td>Z-Val-Ala-DL-Asp-florometilketon</td></tr><tr><td><güçlü>Malzeme</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&mikro;-Slayt 8 kuyu yüksek cam alt</td><td>iBidi</td><td>80807</td><td>Hücreleri kültürlemek için</td></tr><tr><td>Pamuk Preping Topları boyutunda orta</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>71001-10</td><td>Hedefleri temizlemek için</td></tr><tr><td>Immersol 518 F / 30 &deg; C</td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td>Numuneyi yüksek büyütme oranlarında görselleştirmek için</td></tr><tr><td>Lens Temizleyici</td><td>ZEISS</td><td>000000-0105-200</td><td>Objektifleri temizlemek için</td></tr><tr><td>LSM880 Fast Airyscan konfokal mikroskop</td><td></td><td></td><td>Örneği görselleştirmek için</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Office</td><td>xx</td><td>Verileri işlemek için</td></tr><tr><td>Prizma 9</td><td>Graphpad</td><td>xx</td><td>Verileri analiz etmek için - istatistiksel test ve grafik oluşturma</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Volocity</td><td>xx</td><td>Nicelemeleri gerçekleştirmek için</td></tr><tr><td>Zen black</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>Görüntüleri elde etmek ve işlemek için</td></tr><tr><td>Zen mavisi</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>Görüntüleri görselleştirmek için</td></tr><tr><td>Virüsler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dr. Jiahuai Han tarafından</td><td>ev replikasyonunda</td> üretilen <td>HSV-1 (mutRHIM) F suşu</td>, <td>nekrotoz için bir tetikleyici olarak HSV-1; UL39 / ICP6'nın RHIM çekirdek alanı mutasyona uğramıştır (VQCG > AAAA)</td></tr> <tr><td>HSV-1 (WT) F suşu</td><td>Dr. Jiahuai Han tarafından</td><td>ev replikasyonunda</td><td>üretilmiştir Nekrotoz indüksiyonu için negatif bir kontrol olarak HSV-1 (WT) (ICP6 inhibisyonu)</td></tr> <tr><td>IAV Evde PR8</td> ev <td>stoğunda</td><td>replikasyon</td><td>Nekrotoz için bir tetikleyici olarak IAV</td></tr></tbody></table>

İnsan hücrelerinde hsv-1 enfeksiyonu sonrası zbp1'e bağlı ripk3 ve mlkl'nin İmmünofloresan boyama İçin timamid sinyal amplifikasyonu

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

Kinaz Reseptörü ile etkileşime giren serin/treonin protein kinaz 3 (RIPK3) ve substrat karışık soy kinaz etki alanı benzeri (MLKL), önemli antiviral fonksiyonlara sahip hücre ölümünün enflamatuar bir formu olan nekroptozun kritik düzenleyicileridir. RIPK3'ün otofosforilasyonu, fosforilasyonu ve nekroptoz MLKL'nin gözenek oluşturan cellat proteininin aktivasyonunu indükler. Fosforile MLKL'nin hücre zarında ticareti ve oligomerizasyonu, nekrototik hücre ölümünün karakteristiği olan hücre lizisi ile sonuçlanır. Nükleik asit sensörü ZBP1, RNA ve DNA virüsleri ile enfeksiyondan sonra solak Z formundaki çift sarmallı RNA'YA (Z-RNA) BAĞLANARAK AKTIVE EDILIR. ZBP1 aktivasyonu, enfekte konakçı hücrelerin nekroptozu da dahil olmak üzere düzenlenmiş hücre ölümünü indükleyerek virüs enfeksiyonunu kısıtlar. İmmünofloresan mikroskopi, ZBP1 aracılı nekroptozun aşağı yönünde farklı sinyal basamaklarının hücre bazında görselleştirilmesine izin verir. Bununla birlikte, standart floresan mikroskobunun, insan RIPK3 ve MLKL'ye karşı mevcut ticari olarak temin edilebilen fosfo-spesifik antikorları kullanan duyarlılığı, bu belirteçlerin tekrarlanabilir görüntülenmesini engellemektedir. Burada, herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) ile enfekte olmuş insan HT-29 hücrelerinde serin (S) fosforile edilmiş RIPK3 (S227) ve MLKL (S358) için optimize edilmiş bir boyama prosedürünü açıklıyoruz. İmmünofloresan boyama protokolüne bir tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) adımının dahil edilmesi, S227 fosforile RIPK3'ün spesifik olarak tespit edilmesini sağlar. Dahası, TSA, S358 fosforile MLKL'nin tespitinin hassasiyetini büyük ölçüde arttırır. Birlikte, bu yöntem ZBP1 kaynaklı nekroptozun indüksiyonu sırasında bu iki kritik sinyal olayının görselleştirilmesini sağlar.

İnsan hücrelerinde MLKL fosforilasyonunun ve özellikle RIPK3 fosforilasyonunun immünofloresan tespiti teknik olarak zordur26. Burada ZBP1'in aktivasyonu üzerine insan p-RIPK3 (S227) ve p-MLKL (S358) için geliştirilmiş bir boyama protokolü sunuyoruz. Protokol, floresan sinyallerinin algılama sınırını ve hassasiyetini artırmak için bir TSA adımı içerir. Yöntemi doğrulamak için, TSA aracılı immünofloresansın hem p-RIPK3 (S227) hem de p-MLKL'nin (S358) standart dolaylı floresan boyaması ile yan yana k...

İmmünofloresan boyama sırasında tiramid sinyal amplifikasyonu, HSV-1 enfeksiyonundan sonra ZBP1 kaynaklı nekroptoz sırasında fosforile RIPK3 ve MLKL'nin hassas tespitini sağlar.

İnsan Hücrelerinde HSV-1 Enfeksiyonu Sonrası ZBP1'e Bağlı RIPK3 ve MLKL'nin İmmünofloresan Boyama İçin Timamid Sinyal Amplifikasyonu

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

Nekrotoz indüksiyonu sırasında iki önemli sinyal olayı olan fosforile RIPK3 ve MLKL'nin sağlam bir şekilde görselleştirilmesi teknik olarak zor olmuştur. Sunulan tiramid amplifikasyon protokolü, bu iki molekülün hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Sinyal amplifikasyon adımı, fosforile RIPK3 ve MLKL'nin sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde algılanmasını sağlayarak algılama eşiğini düşürür.90.000 ZBP1 eksprese eden HT-29 hücrelerini tam güçte McCoy's 5A ortamında bir santimetre karelik bir yüzey alanı kuyu plakasında tohumlamaya başlayın ve üst düzey mikroskopiye izin verin. Kuyu başına 200 mikrolitrelik bir uç hacim kullanın. Hücreleri gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.Hücreler% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştığında, hücreleri önceden ısıtılmış 200 mikrolitre, tam mukavemetli McCoy'un herpes simpleks virüsü içeren 5A ortamını enfekte eder ve bir jant mutant ICP6'yı beş enfeksiyon çokluğunda kodlar. Nekropsi indüklemek için hücreleri dokuz saat boyunca virüsle inkübe edin. Nekrotoz indüksiyonu için pozitif bir kontrol olarak, hücreleri 200 mikrolitre önceden ısıtılmış nekroptozise neden olan kokteyl ile dört saat boyunca uyarın.Negatif bir kontrol olarak, RIPK3 kinaz aktivitesini inhibe etmek için 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış 22 mikrolitre 10 mikromolar GSK840 ekleyin. Bu inhibitörü, tedavi edilmemiş bir durumda ve serin 227'nin otofosforilasyonunu önlemek için nekroptoz stimülasyonundan sonra dahil edin. Hücreleri sabitlemek için ortamı çıkarın ve hücreleri 200 mikrolitre PBS ile yıkayın.Daha sonra PBS'yi çıkarın ve oda sıcaklığında dengelenmiş 150 mikrolitre% 4 paraformaldehit ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Fiksasyondan sonra,% 4'lük paraformaldehiti çıkarın ve hücreleri 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın.Numuneler, bir sonraki işleme kadar gece boyunca dört santigrat derecede PBS'den fazla saklanabilir. PBS'yi plakadan çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre geçirgenlik tamponu ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında inkübe edin. Kuluçkadan sonra, geçirgenlik tamponunu çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın.Görüntüleme odasını, yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında beş dakika boyunca yıkama tamponu ile inkübe edin. Birincil antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için, plakayı yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında iki saat boyunca oda sıcaklığında 100 mikrolitre bloke edici ortam ile inkübe edin. Daha sonra, kuyucukları 100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez, yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında beş dakikalık inkübasyonla yıkayın.Yıkama tamponunu çıkardıktan sonra, görüntüleme odasına 100 mikrolitre birincil antikor ekleyin. Tiramit sinyal amplifikasyonunun potansiyel arka planını görselleştirmek ve maskeleme eşiğini ayarlamak için birincil antikor içermeyen bir durum içerdiğinden emin olun. Odayı bir gecede dört santigrat derecede inkübe edin.Birincil antikor karışımını çıkarın ve kuyucukları, eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında beş dakikalık inkübasyonla 100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Yıkama tamponunu çıkardıktan sonra, hücreleri 100 mikrolitre HRP etiketli sekonder antikor ile inkübe edin ve eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında 30 dakika boyunca çoğaltılacak birincil antikor türlerini tanıyın. Antikor inkübasyonu sırasında, biyotinile tiramid karışımını hazırlayın.HRP'nin enzimatik aktivitesini tetiklemek için, kullanmadan önce TSA tamponuna taze olarak oksitleyici bir substrat ekleyin. Daha sonra, optimize edilmiş seyreltmeyi kullanarak hazırlanan TSA tamponundaki biyotinillenmiş tiramid seyreltin. HRP etiketli sekonder antikor ile inkübasyondan sonra, kuyucukları üç kez, eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında beş dakikalık inkübasyonla yıkama tamponu ile yıkayın.Yıkama tamponunu kuyudan çıkardıktan sonra, seyreltilmiş biotin-tiramid kuyuya 100 mikrolitrelik bir uç hacme ekleyin. Oda sıcaklığındaki reaksiyonu eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında 10 dakika boyunca inkübe edin, ardından üç yıkama tamponu yıkayın. İkincil antikor, birleştirilmiş streptavidin ve nükleer leke ve yıkama tamponunu içeren boyama karışımını hazırlayın.Yıkama tamponunu çıkarın ve plakayı 100 mikrolitre boyama karışımı ile oda sıcaklığında bir saat boyunca eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında inkübe edin. Bu adımdan itibaren görüntüleme odalarını ışıktan koruyun. Boyama işleminden sonra, art arda iki kez yıkama tamponu ile yıkayın ve kuyucukları PBS ile iki kez durulayın.Görüntülemeye kadar lekelenmeyi korumak için PBS'yi aşan örnekleri dört santigrat derecede saklayın. Görüntüleme odası artık konfokal mikroskopta görselleştirilmeye hazırdır. Tiramit sinyal amplifikasyonunun dahil edilmesi, herpes simpleks virüsünün sitosolünde serin 227'de fosforile edilmiş RIPK3'ün sağlam bir şekilde tespit edilmesini sağladı ve bir jant mutant ICP6 ile enfekte olmuş hücreleri kodladı.Hassas algılama için %2'lik bir lazer gücü yeterliydi. Standart dolaylı immünofloresansta, fosfo-RIPK3'ün tespiti için daha yüksek bir lazer gücü yetersiz kalmıştır. Üç boyutlu Z-yığını görüntülerinin nicelleştirilmesinde, enfekte olmuş hücreler, sahte tedavi edilen hücrelere göre fosforile edilmiş RIPK3 için pozitif voksellerin yaklaşık 20 kat arttığını gösterdi.Vahşi tip herpes simpleks virüsü bir enfekte hücrenin sahte tedavi edilen hücrelere kıyasla artan fosfo-RIPK3 boyaması, ICP6'nın jant alanının serin 227'de RIPK3 fosforilasyonunu tamamen bloke edemediğini göstermiştir. GSK840, RIPK3'ün kinaz alanına bağlanır ve ZBP1 aktivasyonu üzerine serin 227'de RIPK3 fosforilasyonunu önler ve tiramid sinyal amplifikasyonu aracılı fosfo-RIPK3 algılama yönteminin özgüllüğünü doğrular. Alaycı muamele görmüş hücreler, serin 358'de MLKL fosforilasyonunun hafif noktalanmış sitozolik boyanmasında düşük gösterirken, enfekte olmuş hücrelerin sitozol, çekirdek ve plazma zarında güçlü boyama tespit edildi.Standart dolaylı immünofloresan, enfekte hücrelerde fosfo-MLKL sinyalinin spesifik tespiti için% 40 lazer gücü gerektiriyordu. Buna karşılık, tiramid sinyal amplifikasyonu, fosfo-MLKL'nin algılama hassasiyetini arttırdı, böylece gerekli lazer gücünü% 6'ya düşürdü3D Z-yığını görüntü niceliği, standart yöntemi kullanarak yedi kat artışa kıyasla, tiramid sinyal amplifikasyonu kullanarak fosfo-MLKL için pozitif voksel sayısında yaklaşık 90 kat artış gösterdi ve fosfo-MLKL için gelişmiş algılama eşiği ve duyarlılığı gösterdi. Herpes simpleks virüsü birine benzer şekilde, influenza A virüsü enfeksiyonu ZBP1'e bağımlı nekroptozu tetikledi.Tiramit sinyal amplifikasyonu, nekropsitozu gösteren fosfo-RIPK3 ve fosfo-MLKL'nin sağlam bir şekilde algılanmasına izin verdi. Konfokal boyamayı yorumlamak için, birkaç boyama kontrolünün dahil edilmesi gerekir. Bu, birincil koşul olmadan, tek lekeler ve pozitif bir kontrol gerektirir.Bu protokolü uyarlayarak, sıralı TSA kullanılarak birden fazla hedef güçlendirilebilir. Bu, aynı hücre içinde fosforile RIPK3 ve MLKL'nin tespit edilmesini sağlayacaktır. Nekrotoz biyobelirteçlerinin hassas tespiti, yürütülen ZBP1'e bağımlı hücre ölüm yollarının hala nekroptoz, apoptoz veya pirotoksoz olarak doğrulanması gereken otoinflamasyon veya virüs enfeksiyonu üzerine devam eden ZBP1 araştırmaları için anlayışlı olabilir.

tyramide-signal-amplification-for-immunofluorescent-staining-zbp1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Migren ve kronik migren, dönüşüm, gelişmiş tedavi seçenekleri ihtiyacı büyük sağlık yükleri vardır. Biz modellenen, sinir bağışıklık sinyalizasyon migren duyarlılık modüle nasıl tanımlamak...

Yayılma Depresyon Episodik ve Kronik Migren Sinir Bağışıklık Sinyalizasyonu Modelleme In Vitro</em

Bu makale toplam iç yansıma floresans (TIRF) mikroskop camı desteklenen düzlemsel bilayers bir HIV-1 zarf kaynaklı virolojik sinaps oluşumu görselleştirmek için bir yöntem açıklanır. Yöntem ayrıca, HIV-1 zarfı ile endüklenen virolojik sinaps oluşumu sırasında meydana gelen sinyal molekülleri aktivasyonu ve dağıtılması algılamak için immünfloresans boyama yöntemi ile kombine edilebilir.

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Bu video, herpes simpleks virüsü-1 enfeksiyonunda enfekte hücre proteini 0, ICP0 trafiğini izlemek için bir yöntem göstermektedir. Post-de novo sentez, ICP0 çekirdeğe yer değiştirir ve daha sonra enfeksiyon ilerlemesi sırasında sitoplazmaya hareket eder. İmmünofloresan mikroskobu, proteinin hücre altı lokalizasyonunu ortaya çıkarır ve analiz ederek, enfeksiyon aşamaları boyunca kaçakçılığına ilişkin içgörüler sunar.

Enfekte Hücrelerde Viral Protein Lokalizasyonu için Bir İmmünofloresan Tekniği

Bu hayvan modellerinin doku bölümleri içinde kalıcı bir DNA virüsü genomunun saptanması için in situ hibridizasyon protokolünde bir floresan kurulmuştur. Bu protokol, viral genomun codetection, kendi RNA ürünleri ve tek bir hücre içinde viral veya hücresel proteinleri tarafından enfeksiyon süreci üzerinde çalışırken sağlar.

Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Deri, insan patojeni herpes simpleks virüsü tip 1'in (HSV-1) hedef dokularından biridir. HSV-1'in dokuya invazyon yolunu araştırmak için, cildin en dış tabakasını temsil eden murin epidermal tabakalarının ex vivo bir enfeksiyon modeli oluşturduk.

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

Viral transkripsiyon fabrikalar hücresel RNA polimeraz II viral gen transkripsiyonu yeniden etkinleştirme sırasında artırmak için ile zenginleştirilmiş ayrık yapılardır. Burada, sitelerinden Aktif 3D nükleer alanda viral Kromatin ayirt boyama ve in situ RNA hibridizasyon kombinasyonu tarafından transkripsiyonu birini bulmak için bir yöntem açıklanmıştır.

3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme

ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında nükleer-için-sitoplazmik translocation uğrar. Bu olay moleküler mekanizması bilinmemektedir. Burada biz confocal mikroskop ICP0 translocation gelecek mekanik çalışmalarda kantitatif analiz etmek için zemin bırakır HSV-1 enfeksiyonu hareketinde ICP0 ölçmek için bir araç olarak nasıl kullanılacağını açıklar.

Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi

Biz situ hibridizasyon floresan kullanan bir protokol tarif (FISH) lytically enfekte insan hücrelerinin içinde birden fazla herpesviral RNA görselleştirmek için, süspansiyon veya yapışık. Bu protokol, nükleositoplazmik oran üreten floresan ların niceliğini içerir ve konak ve viral proteinlerin immünoresans (IF) ile eşzamanlı olarak görüntülenmesi için uzatılabilir.

KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan

Bu çalışmada, Herpes simpleks virüs tip-1 (HSV-1) enfekte monosit kaynaklı dendritik hücrelerde otofatik akı ile müdahale etmek için inhibitör ve siRNA tabanlı stratejiler sürünmektedir.

Herpes Simpleks Virüs Tip 1-Enfekte Monosit Türetilmiş Dendritik Hücrelerde Otofaji Modüle siRNA Elektroporasyon

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Keşfedin, HSV-1 enfeksiyonu sonrası ZBP1'e bağlı necroptoz sırasında fosforile RIPK3 ve MLKL'nin tiramid sinyal amplifikasyonu ile immünofloresan boyamasını. Bu yöntem, hassas ve tekrarlanabilir görüntüleme sağlar.

İnsan Hücrelerinde HSV-1 Enfeksiyonu Sonrası ZBP1e Bağlı RIPK3 ve MLKLnin İmmünofloresan Boyama İçin Timamid Sinyal Amplifikasyonu (Video) | JoVE Journal

İnsan Hücrelerinde HSV-1 Enfeksiyonu Sonrası ZBP1'e Bağlı RIPK3 ve MLKL'nin İmmünofloresan Boyama İçin Timamid Sinyal Amplifikasyonu

Daha fazla video keşfet